多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

以前にSARS-CoV-2診断分析でテストされた残留ヒト血清サンプルは、ロチェスター大学機関審査委員会によって承認されたこの研究で使用されました。 1. 試薬・装置 商業的な供給源からコロナウイルス抗原およびヒトIgGおよびIgMを得る。 測定器ベンダーからアッセイ制御(AC)ビーズセット(45および220)を入手します。ACビードセット45は単一のレポーターチャネル(RP1)の器械の中央値蛍光強度(MFI)コレクションを監禁する。AC ビード セット 220 は、2 番目のレポーター チャネル(RP2)で MFI コレクションを監視します。 結合確認に用いる検出抗体及び抗原特異的ウサギセラ及び抗体を取得する。 ストレプトアビジン、R-フィコエリスリンコンジュゲート(SAPE)またはフルオロフォアスーパーブライト436(SASB;405ナノメートル(nm)での励起および436nmの放出のいずれかとビオチン標識抗体で検出を行う。 ヒトACE2タンパク質(すなわち、SARS受容体)を得る。使用前に、凍結乾燥したACE2タンパク質をヌクレアーゼフリー水(DEPC処理せず、オートクレーブされ、0.2-μm滅菌濾過)に溶解し、4°Cで保存します。 96ウェル非結合面(NBS)黒の平底プレートですべての反応を行います。プレートを96ウェルマイクロプレートアルミニウムシールテープでシールし、アッセイインキュベーションステップを行います。アッセイ洗浄工程には磁気プレートセパレータを使用してください。 2. 抗原結合および抗体結合対照ビーズ製剤 キャメロン等に記載されているように、磁気、ポリスチレン、および色分けされた微小球セット(直径6.5μm)とS、RBD、およびNc抗原を共有結合する。コロナウイルス抗原は、10 pmol/106 ビーズ(S)および100 pmol/106 ビーズ(RBDおよびNc)で結合される。ヒトIgGまたはIgMと結合したコントロールビーズは、前述の1のように生成される。IgGとIgMは5 μg/106 ビーズで結合されます。 カップリング後、ビーズ濃度を決定し、記載の手順6を使用して各ストックを1 x 106 ビーズ/mLに希釈します。 キャメロンら 1 に記載されているようにウサギまたは陽性ヒトセラからの抗原特異的抗体との抗原結合の確認を行う。 アッセイのビオチン化抗ヒトIgG/SAPE検出試薬とのヒトIgG結合、およびフィコエリスリン(PE)標識ヤギ抗ヒトIgMとのIgM結合を確認します。注:結合確認は、これらの試薬に使用する最適濃度が不明であるため、タンパク質特異的血清または抗体の滴定を使用して行われます。血清には、シリアルフォールド希釈液が使用され、mg/mLストックとして供給される抗体には、シリアルμg/mL希釈系列が使用されます。 マルチプレックスビーズミックスで使用する前に、2つのレポーターチャンネルのMFI収集を1 x 106 ビーズ/mLの濃度まで監視する希薄アッセイ制御(AC)ビーズ。 3. フレッシュマルチプレックスビーズミックスの準備 個々の結合ビーズから毎日新鮮なマルチプレックスビーズミックスを準備し、1 x 106 ビーズ/mLでビーズストックを制御します。注:マルチプレックスビーズミックスは、各ビーズ領域に対して2,500個のビーズを50 μLボリュームで供給できるように用意されています。任意の数の反応に対してマルチプレックスビーズミックスを準備する方法の計算は、アンジェニ(2020)6によって公開されたブログに記載されています。 4. サンプル希釈 10 μL の血清を、0.05% Tween 20、0.02% アジドナトリウム、1% のウシ血清アルブミン (BSA) (PBS-TBN バッファー) を含む 990 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に混合して、1:100 血清サンプル希釈を調製します。 1:100希釈液20μLをPBS-TBNの180 μLに加えて、サンプルを再び10倍に希釈します。注:血清サンプルは、2019年にCOVID-19パンデミック以前に採取した標本から、低および高抗体価を表すSARS-CoV-2 PCR陽性患者からの陽性血清から構成されています。陽性試料は、症状発症から≈3日から>60日(DFSO)の間で採取した。すべての血清試料およびIgG剥ぎ取り陰性対照血清は、以下に記載されるように1:1000に希釈される。中和アッセイの場合、セラは、以下の中和プロトコル(セクション6および8)に記載されているように1:500希釈される。 5. 単一記者血清学的アッセイプロトコル 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。 ピペット50 μLの1:1000血清またはPBS-TBNを適切なウェルに入れ、ウェル内の血清の最終的な希釈は1:2000です。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1回試料後培養洗浄)。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 反応ウェルを以下のように洗浄する(第2回ポストサンプルインキュベーション洗浄)。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石からプレートを取り外します。 抗体を0.62 μg/mL、SAPEを1 μg/mLに希釈して、SAPEとビオチン抗ヒトIgGを新たに組み合わせます。各ウェルに100 μLを加えます。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1の検出後抗体インキュベーション洗浄)。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 反応ウェルを以下のように洗浄する(第2の検出後抗体インキュベーション洗浄)。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、磁気プレート分離器の上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石からプレートを取り外します。 各ウェルにPBS-TBNの100 μLを加えます。 ホイルシールで覆い、37°Cで2分間振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り外します。その後、ホイルシールを取り外し、ユーザーマニュアルに従ってフローアナライザ上の各ウェルの50 μLを読み取ります。簡単な説明を以下に示します。 画面の左上隅にあるドロップダウン メニューを選択し、[ プレート設定] に移動します。 [ プレートの実行] を選択します。 プレートキャリアを 取り出すには、イジェクト アイコンを選択します。 プレートキャリアにプレートをロードし、プレートキャリアを 引き込むには、リトラクト アイコンを選択します。 [ 実行 ]アイコンを選択して、プレートを実行します。 6. 単一記者中和アッセイプロトコル 上記のセクション3で説明したように、新鮮なマルチプレックスビーズミックスを準備します。 患者を希釈し、次のようにセラ1:500を制御します。 10 μLの血清をPBS-TBNの990 μLに混合して、血清1:100を希釈した。 1:100血清40μLをPBS-TBNの160 μLに加えて、さらに5倍の希釈液を使用します。 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。 2μg/mL ACE2希釈液を25μLずつ加えます。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで2分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、ホイルシールを取り外します。 割り当てられたウェルに1:500血清またはPBS-TBNの25 μLを加えます。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。 アッセイ手順の残りの部分については、上記の手順5.4~5.18.5に従ってください。 7. デュアルレポーターIgGとIgM血清学的アッセイへの転換 上述のセクション2に記載されているように、抗原結合ビーズを準備します。注:人間のIgMと組み合わせた追加のビーズセットは、抗IgM検出試薬の追加を監視するために含まれており、また、RP2用MFIのコレクションを監視するための追加のACビードセット(220)が含まれています。すべてのビーズの在庫は、以下に説明するマルチプレックスビーズミックスに含めるために1 x 106 ビーズ/mLにあります。 上記のセクション3で説明したように、新鮮なマルチプレックスビーズミックスを準備します。 上記のセクション4に記載されているように、希薄血清サンプルおよびIgG剥離陰性対照血清1:1000。 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。 ピペット50 μLの1:1000血清またはPBS-TBNを適切なウェルにする。ウェル内の血清の最終的な希釈は1:2000です。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1回試料後培養洗浄)。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、プレートマグネットの上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 PBS-TBN(第2のポストサンプルインキュベーション洗浄)で再び反応ウェルを洗浄し、手順7.10.1-7.10.5で前述したとおりに洗います。 磁石からプレートを取り外します。 必要な試薬の組み合わせで新しい検出試薬ミックスを作成し、各ウェルに50 μLまたは100 μLを加えます。注:ブリリアントバイオレット421レポーター色素に結合した抗ヒトIgGを含む検出試薬混合物(BV;405nmで励起し、421nmで放出)は、在庫試薬の量が制限されているため、50μL/wellで使用されました。他のすべての検出試薬の混合物は100 μL/wellで使用される。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 PBS-TBN(抗体インキュベーション検出後の最初の洗浄)で、下記のように反応ウェルを洗浄する。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石の上にプレートを保持しながら、ホイルシールを取り外し、慎重に廃液の上にプレートを反転し、ウェルから上澄をそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 PBS-TBN(抗体インキュベーションの検出後の第二の洗浄)で再度反応ウェルを洗浄し、手順7.17.1-7.17.5で上述したとおりに洗浄します。 磁石からプレートを取り外します。 各ウェルにPBS-TBNの100 μLを加えます。 ホイルシールで覆い、37°Cで2分間振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り外します。次にホイルシールを取り外し、手順5.18.1~5.18-5で説明したように、フローアナライザで各ウェルの50 μLを読み取ります。 8. デュアルレポーター中和アッセイへの転換 上記のステップ 7.1 で説明した結合ビーズを使用します。 ステップ 7.2 で説明したように、新しいマルチプレックスビーズミックスを準備します。 血清サンプルおよびIgG剥がされた陰性対照血清は、次のように1:500希釈される。 10 μLの血清をPBS-TBNの990 μLに混合して、1:100希釈を準備します。 1:100希釈液の40μLをPBS-TBNの160 μLに加えて、さらに5倍に希釈します。 96ウェル非結合マイクロチタープレートのそれぞれに50 μLのマルチプレックスビーズミックスを追加します。 2μg/mL ACE2希釈液を25μLずつ加えます。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで2分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、ホイルシールを取り外します。 割り当てられたウェルに1:500血清またはPBS-TBNの25 μLを加えます。 プレートにホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 反応ウェルを以下のように洗浄する(第1ポストサンプルインキュベーション洗浄)。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 PBS-TBN(第2のポストサンプルインキュベーション洗浄)で再び反応ウェルを洗浄し、手順8.13.1-8.13.5で前述したとおりに洗浄します。 磁石からプレートを取り外します。 必要な試薬の組み合わせで新しい検出試薬ミックスを作成し、各ウェルに50 μLまたは100 μLを加えます。注:BVレポーター色素に結合した抗ヒトIgGを含む検出試薬混合物は、利用可能な在庫試薬の量が制限されているため、50 μL/wellで使用されました( 材料表を参照)。他のすべての検出試薬の混合物は100 μL/wellで使用される。 プレートにマイクロプレートホイルシールを覆い、37°Cの加熱プレートシェーカーで600rpmで振って15分間インキュベートします。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 反応ウェルを以下のように洗浄する(まず抗体インキュベーション検出後)。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、2分間磁気プレートセパレータの上に置き、反応混合物からビーズを分離します。 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。 磁石の上にプレートを保持したまま吸収性の紙にプレートをブロットします。 PBS-TBN(抗体インキュベーションの検出後の2回目の洗浄)で再び反応ウェルを洗浄し、手順8.21.1-8.21.5で上記の詳細に記載されているとおりに洗浄します。 プレート磁石からプレートを取り出し、各ウェルに150 μLのPBS-TBNを加えます。 新鮮なホイルシールでプレートを覆い、600rpmで2分間37°Cで振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り出し、磁気プレート分離器の上に2分間置き、ビーズを反応混合物から分離します。 磁石にプレートを保持したまま、ホイルシールを取り外し、慎重に廃容器の上にプレートを反転させ、上澄み物をウェルからそっとフリックします。 磁石からプレートを取り外します。 各ウェルにPBS-TBNの100 μLを加えます。 ホイルシールで覆い、37°Cで2分間振ります。 プレートシェーカーからプレートを取り外します。次にホイルシールを取り外し、手順5.18.1~5.18-5で説明したように、フローアナライザで各ウェルの50 μLを読み取ります。