Ein Flow-Analysesystem für perlenbasierte Multiplex-Assays, das eine Zwei-Reporter-Ablesung ermöglicht, wurde für die Entwicklung von multiplex-serologischen und Antikörper-Neutralisationsassays verwendet, die gleichzeitig neutralisierende IgG- und IgM-Antikörper für SARS-CoV-2 messen können.
Die COVID-19-Pandemie hat die Notwendigkeit schneller Hochdurchsatzmethoden für den sensitiven und spezifischen serologischen Nachweis von Infektionen mit neuartigen Krankheitserregern wie SARS-CoV-2 unterstrichen. Multiplex-serologische Tests können besonders nützlich sein, da sie gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Antigene analysieren können, die die Pathogenabdeckung optimieren und die Variabilität im Organismus und die individuelle Wirtsreaktion steuern. Hier beschreiben wir einen SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluoreszierenden Mikrosphären-basierten Assay, der sowohl IgM- als auch IgG-Antikörper gegen drei wichtige SARS-CoV-2-Antigene nachweisen kann – das Spike(S)-Protein, die Spike-Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2)-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) und das Nukleokapsid (Nc). Es wurde gezeigt, dass der Assay eine vergleichbare Leistung wie ein SARS-CoV-2-Referenzassay für IgG im Serum aufweist, der nach ≥21 Tagen nach Symptombeginn erhalten wurde, aber eine höhere Empfindlichkeit mit Proben aufwies, die nach ≤5 Tagen nach Symptombeginn gesammelt wurden. Darüber hinaus wurde unter Verwendung von löslichem ACE2 in einem Neutralisationsassay-Format eine Hemmung der Antikörperbindung für S und RBD nachgewiesen.
Die COVID-19-Pandemie hat die Bedeutung der schnellen Entwicklung und Implementierung schneller, leistungsstarker serologischer Tests mit hohem Durchsatz und derEntstehung unterstrichen, die zur Diagnose und Überwachung neuartiger Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 eingesetzt werden können. Multiplex-serologische Tests können in einer Pandemie äußerst nützlich sein, da sie gleichzeitig Antikörper gegen mehrere Antigene analysieren können, was eine breite Pathogenabdeckung und Kontrollen für die Variabilität im Organismus und die Reaktion des Wirts auf Infektionen ermöglicht. Die Entwicklung eines multiplex-fluoreszierenden Perlen-basierten Assays, des SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), der Antikörper gegen das Spike(S)-Protein, die Spike-Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) Rezeptor-bindende Domäne (RBD) und Nukleokapsid (Nc) von SARS-CoV-2 nachweisen kann1. 3Flex zeigte eine vergleichbare Leistung wie ein SarS-CoV-2-IgG-Referenzassay für Serum, das nach ≥21 Tagen nach Symptombeginn erhalten wurde, hatte jedoch eine höhere Empfindlichkeit mit Proben, die nach ≤5 Tagen nach Symptombeginn gesammelt wurden. Zusätzlich wurde die Hemmung der Antikörperbindung für S- und RBD-Antigene unter Verwendung von löslichem ACE2 in einem Neutralisationsassay-Format nachgewiesen. Die auf Multiplex-Perlen basierende Technologie wurde weithin als bewährte Technologie für serologische Multiplex-Tests eingesetzt und hat deutliche Vorteile für das großflächige Screening, einschließlich kurzer Zeit bis zu den Ergebnissen, geringem Probenbedarf und reduziertem Arbeitsaufwand2,3,4.
Vor kurzem ist ein neues Durchflussanalysegerät verfügbar, das die gleiche High-Plex-Hochdurchsatzfähigkeit des Systems bietet, die in früheren Arbeiten1demonstriert wurde, jedoch mit dem zusätzlichen Vorteil von zwei Reporterkanälen. Die Fähigkeit, zwei fluoreszierende Reportersignale in einer einzigen Reaktion zu messen, ermöglicht die Bewertung von zwei Ergebnissen pro Analyt für jede Probe und ist ideal für Isotypisierungsanwendungen, die typischerweise in separaten Reaktionsbohrungen durchgeführt werden müssen5. Die Dual-Reporter-Fähigkeit liefert doppelt so viele Daten für jede Probe in halb so vielen Reaktionsbohrungen mit der Hälfte des Probenvolumenbedarfs und hat damit einen klaren Vorteil gegenüber Einzel-Reporter-Systemen. Diese Studie beschreibt das serologische Standard-Assay-Protokoll und beschreibt die Anpassung an einen Neutralisationsassay. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht die Umwandlung des Einzelreporter-Assays in einen serologischen Dual-Reporter-Assay und anschließend in einen Dual-Reporter-Neutralisierungsassay, um gleichzeitig neutralisierende Antikörper sowohl der IgG- als auch der IgM-Isotypen gegen die SARS-CoV-2 S-, RBD- und Nc-Antigene zu messen. Eine visuelle Übersicht über das Assay-Protokoll finden Sie in Abbildung 1.
Diese Studie erweiterte die Funktionalität eines Multiplex-Fluoreszenz-Mikrosphärenassays, 3Flex, der die IgG-Reaktion auf eine Infektion mit SARS-CoV-21qualitativ bewertet. Während viele serologische Assays für COVID-19 ein einzelnes Antigen nachweisen, bewertet dieser Assay gleichzeitig S-, RBD- und Nc-Antigene und enthält eine interne Antikörper-Isotypkontrolle7. Darüber hinaus wird ACE2 als Indikator zum Nachweis neutralisierender Antikörpertiter gegen SARS-CoV-2 verwendet.
Multi-Antigen-Assays könnten in Zukunft besonders nützlich sein, um Immunantworten zwischen infizierten und geimpften Personen zu unterscheiden. Wenn bei SARS-CoV-2 nur S- und RBD-Antikörper ausgewertet werden, wäre es unmöglich zu erkennen, ob dies auf eine frühere Infektion oder auf eine Impfantikörperreaktion zurückzuführen ist. Keiner der derzeit verwendeten Impfstoffe zielt auf das Nc-Antigen ab, so dass es durch die Bewertung von S/RBD- und Nc-Antigenen möglich ist, vergangene Virusinfektionen (Nc- und S/RBD-positiv) von einer Impfreaktion (nur S/RBD-positiv; Nc-negativ).
In der aktuellen Studie wurden die serologischen und Neutralisationsassays 3Flex (Abschnitte 5 und 6) auf ein neues Dual-Reporter-Flow-Analysegerät (Abschnitte 7 und 8) übertragen. Typische Immunoassay-Protokolle für perlenbasierte Multiplex-Assays ähneln Standard-ELISA-Protokollen und folgen vergleichbaren Schritten für die Probeninkubation, die Nachweisantikörper-/Reporterinkubation und die Analyse der Ergebnisse8. Frühere Studien haben auch gezeigt, wie Standard-ELISA-Assays auf eine perlenbasierte Multiplexing-Plattform übertragen werden können9.
Die Assay-Protokolle konnten nahtlos vom Vorgänger-Einzel-Reporter-Instrument auf das neue Dual-Reporter-System übertragen werden, wie die Ergebnisse für die Testproben und Kontrollen zeigen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Im serologischen Assay zeigten alle positiven Serumproben eine charakteristische dosisabhängige Signalabnahme, die sowohl einer höheren Probenverdünnung als auch einer niedrigeren Antikörperkonzentration entsprach, während die Signale für die negativen Proben auf Hintergrundniveau blieben. In ähnlicher Weise entsprachen für den Neutralisationsassay abnehmende Signale für S und RBD, aber nicht Nc, steigenden Konzentrationen des ACE2-Konkurrenten, während das IgG-gestreifte Serum durch die Zugabe von ACE2 viel weniger beeinflusst wurde. Die Vorinkubation der Perlen mit ACE2 für 2 min vor der Zugabe der Serumprobe (wie in den Abschnitten 6 und 8 beschrieben) wurde auch mit der gleichzeitigen Kombination der Perlen mit ACE2 und Serum verglichen und führte zu geringen Unterschieden in den Ergebnissen (Daten nicht gezeigt). Da die mit den Perlen plus ACE2-Vorinkubationsschritt erzielten Ergebnisse jedoch konsistenter waren, war dies das endgültige Verfahren für das Neutralisationsassayprotokoll (Abschnitte 6 und 8).
Da das duale Reportersystem einen zweiten fluoreszierenden Reporterkanal enthält, wurden beide Assays in Isotypisierungsassays umgewandelt, um gleichzeitig IgG- und IgM-Reaktionen zu messen. Die Dual-Reporter-Funktionalität des Durchflussanalysators ermöglicht die Erfassung von fluoreszierenden Signalen von zwei Reporter-Detektionsreagenzien für jeden Analyten im Multiplex für jede Probe, wodurch die pro Probe in einem Assay generierten Daten effektiv verdoppelt werden. Für die Entwicklung und Optimierung der Dual-Reporter-Assay-Protokolle wurden mehrere kommerziell erhältliche Reporterfarbstoffe und Nachweisantikörper für den neuen RP2-Kanal (Abbildung 7 und Abbildung 8) evaluiert, um die besten verfügbaren Optionen zu bestimmen. Der mit dem DL 405-Reporterfarbstoff konjugierte Anti-IgM-Antikörper funktionierte im RP2-Kanal nicht gut (Abbildung 7), so dass Biotin-Anti-IgG mit SASB anschließend für den Nachweis im RP2-Kanal bewertet wurde (Abbildung 8). Drei Kombinationen von RP1- und RP2-Nachweisreagenzien wurden im Dual-Reporter-Neutralisationsassay (Tabelle 1 und Abbildung 9) verglichen, um die leistungsstärksten Kombinationen für den gleichzeitigen Nachweis von IgG- und IgM-neutralisierenden Antikörpern zu bestimmen. Während es signifikante Unterschiede in der Signalintensität zwischen dem RP1-Kanal mit PE-anti IgM und dem RP2-Kanal mit DL 549 anti-IgM gab, gab es keinen signifikanten Unterschied bei der Messung der prozentualen Bindungshemmung durch ACE2.
Mehrere Einschränkungen der aktuellen Methode und dieser Studie werden anerkannt. Zunächst wurden die getesteten und in der Methodenentwicklung und -optimierung verwendeten Proben auf Sätze von 8-11 Proben beschränkt. Weitere Proben werden in erweiterten Studien getestet, um zu überprüfen, ob die Methode vollständig optimiert ist. Zweitens wurde eine begrenzte Anzahl von Reporterfluorophoren und Reporterpaaren getestet. Weitere Tests aller verfügbaren Reporter in allen möglichen Kombinationen werden bestimmen, welche Reagenzien bei dieser Methode erfolgreich eingesetzt werden können. Der mit Biotin konjugierte Anti-IgG-Antikörper unterschied sich von dem Anti-IgG-Antikörper, der mit dem BV 421-Reporter konjugiert wurde. Obwohl also variabel in der Signalintensität für das BV 421 Anti-IgG existierte, könnte dies auf die Spezifität des Antikörpers zurückzuführen sein und nicht mit dem Reporterfarbstoff zusammenhängen. Das Testen anderer verfügbarer BV 421-konjugierter Antikörper kann einen anderen Antikörper identifizieren, der im RP2-Kanal gut funktionieren würde. Zukünftige Studien werden auch die Kombination von PE-Anti-IgM mit BV 421 Anti-Human-IgG für den Nachweis in RP1 bzw. RP2 bewerten. Schließlich sind die Assays selbst bei der Dual-Reporter-Fähigkeit des Instruments auf zwei Isotypen (zwei Parameter) pro Reaktion beschränkt. Wenn zusätzliche Isotypen gemessen werden sollen oder eine vollständige Isotypisierung gewünscht wird, müssten zusätzliche Reaktionen mit den gleichen zwei Reporterkanälen in separaten Bohrkanälen durchgeführt werden.
Die perlenbasierte Multiplexing-Technologie ermöglicht ein schnelles und flexibles Assay-Design mit einfacher Implementierung in routinemäßige Laborabläufe3,4,10. Diese Studie zeigte die Einfache Übertragung der zuvor beschriebenen serologischen und Neutralisationsassays von 3Flex für SARS-CoV-2 auf ein Strömungsanalysesystem zur Messung von IgG mit einem einzigen Reporter oder mit leichter Modifikation, wobei gleichzeitig sowohl IgG- als auch IgM-Reaktionen mit zwei Reportern gemessen wurden. Die Dual-Reporter-Option hat klare Vorteile gegenüber Einzel-Reporter-Plattformen, da sie doppelt so viele Daten pro Probe liefern kann, wobei das halbe Probenvolumen und die Hälfte der Anzahl der Reaktionsbohrungen verwendet werden. Mit den entsprechenden Reporterfarbstoffen und Nachweisantikörpern können Isotypisierungsassays einfach entwickelt und auf dem Dual-Reporter-Flow-Analysegerät durchgeführt werden.
The authors have nothing to disclose.
Dieser Bericht wurde von der Luminex Corporation (Austin, TX) finanziert. Die Autoren danken Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) für die wissenschaftliche Unterstützung bei der Redaktion.
ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |