介绍了通过 MRGPRX2 受体生成短肽库以激活桅杆细胞的技术。相关技术简单、便宜,可扩展到其他细胞受体。
识别特定于具有治疗意义的细胞受体的配体对于许多应用至关重要,包括设计和开发新的治疗方法。与Mas相关的G蛋白受体-X2(MRGPRX2)是调节乳腺细胞活化的重要受体,因此指导一般免疫反应。已确定MGPRX2的众多配体,包括PAMP、防御素、LL-37和其他蛋白质片段(即降解白蛋白)等内源性肽。进一步鉴定MGPRX2特定配体需要筛选大量的肽(即肽库);然而,桅杆细胞很难和昂贵的体 外 维持,因此,不经济地用于筛选大量的分子。本文演示了使用 MRGPRX2 表达 HEK 细胞设计、开发和筛选小肽分子库的方法。这种细胞系相对容易和便宜的维护,可用于 体外 高通量分析。一种对钙敏感的Fura-2荧光染料,用于监测活化后细胞内钙通量。Fura-2 的荧光强度在 510 nm 时与激发波长 340 和 380 nm 的比例用于计算钙浓度。用于验证该系统的肽库基于内源性前列腺素 N-终端 12 (PAMP-12) 秘密,已知该秘密库将 MRGPRX2 与高特异性和亲和力结合。随后的肽通过氨基酸截断和应用于PAMP-12的阿兰宁扫描技术产生。此处描述的方法简单且价格低廉,但坚固耐用,用于筛选大量化合物库,以识别在受体激活中发挥重要作用的结合域和其他重要参数。
乳腺细胞是免疫系统不可分割的一部分,在先天和自适应免疫反应中起着至关重要的作用。乳腺细胞主要通过抗原与免疫球蛋白E(IgE)-FcéRI受体复合物结合,或者通过最近发现的与男性相关的G-蛋白受体X2(MRGPRX2)1激活。MRGPRX2激活与多种免疫和炎症性疾病有关,因此,了解受体与其配体2的结合机制非常重要。为此,开发并筛选了一个小型肽分子库,对在 HEK 细胞中过度表达的 MRGPRX2 受体进行筛选。在这项研究中,肽库是使用简单多才多艺的阿兰宁扫描和氨基酸截断技术构建的。阿兰宁扫描涉及用阿兰宁残留物取代特定的氨基酸。Alanine 是小而中性的,剥离了被替换残留物赋予的特定特性的肽,并连续突出了氨基酸在受体相互作用中各自的物理化学特性的重要性。相反,在氨基酸截断中,肽序列的设计使其缺少来自N终端、C终端或两者兼有的一个或多个氨基酸残留物。这组肽用于识别对 MRGPRX2 结合至关重要的氨基酸序列。
人类桅杆细胞系(LAD-2)的经验表明,这些细胞很难 在体外培养和维持:两周的加倍时间,昂贵的中等补充剂,以及通过3期间需要的直接注意。这些属性使细胞不适合大规模筛选潜在的配体。在这里,稳定地转染的 HEK 细胞表示 MRGPRX2 受体 (HEK-X2) 用于筛选肽库1。HEK-293细胞由于其高转化效率、较快的翻倍率以及需要在实验室4中培养非昂贵的中等补充剂,被广泛用于表面受体的异质表达。转染 HEK-293 细胞线的方案已经得到证明,并且已经建立了5。HEK-293细胞稳定地表达MRGPRX2受体(通道13-19)被激活与肽通过N截断,C-截断,N+C截断,和丙氨酸扫描1产生。野生型 HEK 细胞 (HEK-WT) (通道 16-21) 用作控制。激活后监测细胞内钙释放,以研究基于MGPRX2的活化。
MRGPRX2 的细胞激活后,细胞溶胶钙动员。乳腺细胞中这种受调节的细胞内钙释放由存储操作的钙进入 (SOCE) 调节,由频闪相互作用分子 1 (STIM1) 协调:并且是免疫反应级联6,7的核心。各种方法已用于检测细胞内钙浓度,包括贴片夹和荧光染料8。在现有的所有技术中,氟钙染料与各种检测技术结合,正在被广泛使用。获得兴趣的两种氟染料是:单波长染料(如 Fluo-4)和双波长比例染料(如印度 -1 和 Fura-2)。双波长比度染料带来单波长染料的优势在于,双波长比度染料纠正了染料加载、照片漂白和聚焦10、11等实验错误。
Fura-2 乙酰酯(Fura-2 AM)是一种细胞渗透的绿色荧光染料,其激发在钙结合后会转移到较低的波长。实验中,Fura-2 的兴奋度为 340 和 380 nm,而排放记录为 510 nm。钙结合后,340纳米的荧光强度增加,而380纳米的荧光强度降低,如图 1所示。数据表示为 340 nm (F340) 激发后的荧光强度与 380 nm (F380) 即 F340/F380 激发后的荧光强度比率。F340/F380的比例是成正比的细胞内钙,其价值可以通过格林凯维奇方程12计算。由于荧光信号来自两波长(340 nm 和 380 nm)的染料激发,荧光信号的比例对染料加载、染料泄漏、光出血和细胞密度等实验因素进行了修正。
钙信号是乳腺细胞脱粒的核心,已广泛应用于受体-配体相互作用、配体鉴定和药物发现等研究。MRGPRX2是最近发现的乳腺细胞受体,被发现在许多炎症性疾病,如痒,哮喘,和特异性皮炎,除其他2。此外,一些经批准的药物已被证明通过MRGPRX2受体15引起炎症反应。因此,研究配体-受体相互作用、识别新的配体并了解激活机制势在必行。这项研…
The authors have nothing to disclose.
SR 和 LDU 希望感谢艾伯塔省创新战略研究项目、NRC 和 NSERC-发现项目赠款。
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |