トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

産卵室は、 P. maidis の雌が卵子を簡単に回収できる保護培地で産卵しながら餌を与えることができるように特別に設計されました。この方法を用いて、DNA、RNA、および/またはタンパク質をマイクロインジェクションするために十分な量の前細胞胚を回収した。成虫の P. maidis の雌は通常、トウモロコシ植物の葉の組織内に卵を産みますが、多くの葉の解剖が必要なため、短時間で十分な卵を得ることは困難です。人工産卵環境は、これらの問題を克服するための解決策を提供します。 表1に示すように、4週間で合計645頭の雌から6,483個の卵子が採取されました。女性は通常、2日目以降に産卵を開始し、4日目から6日目までほとんどの卵を提供します。産卵活動は9日目までに減速した。各産卵室は金曜日に設置され、日曜日から次の日曜日まで卵をチェックしました。このスケジュールに従うと、ほとんどの卵子を平日にマイクロインジェクションのために収集することができました。 この産卵システムの最初の実用化は、目の色遺伝子である白(Pmw)のP. maidis orthologを標的として、Cas9を介した遺伝子ノックアウトの有効性をテストすることでした。白の突然変異は、他の昆虫種の目の色素沈着の実質的な喪失をもたらすことが知られており、白は細胞自律的であり、注射された個体で突然変異を検出することを可能にする16,17。小さな突然変異でも機能が失われる可能性を高めるために、ガイドRNAは、ホワイト機能16に必要なATP結合カセットの領域内で切断するように設計されました。P. maidis 胚には、20% フェノールレッド(注射バッファー)、最終濃度800 ng/μLのCas9を含む注射バッファー(Cas9コントロール)、または注入バッファー中のCas9のいずれかを注入し、それぞれ400 ng/μLの濃度で添加した3つのガイドRNAを注入しました。1つのインジェクションミックス内の3つのガイドの組み合わせは、大きな欠失を作成することと、1つのガイドが切断に効果がない可能性を補うことの両方によって、変異体を生成する可能性をさらに最大化することを目的としていました。各治療の発達率は同等であり(表2)、注射された個人の50〜60%が発達の兆候を示しました。.バッファとCas9コントロールのハッチ率も同等でした。しかし、3ガイドミックスを受けた個体の孵化率は比較的低かった。現時点では、生存率の低下が白色機能の喪失の結果なのか、オフターゲット効果などの3つのガイドミックスの意図しない結果の結果なのかは不明です(ディスカッションセクションを参照)。しかし、眼の色素沈着が完全に失われた(すなわち、完全なノックアウト)個体はいずれも孵化せず、注射された個体の子孫のいずれも白い目を有していなかった。Cas9ベースの突然変異誘発のオンターゲット有効性は、2つの方法で検証されました。まず、注射対象者を眼の色素沈着の喪失についてスクリーニングした。 発症した71人のガイド注射個体のうち、23個体はある程度の色素喪失を示し(図10)、そのうち9個体は孵化し、ノックアウト率は≥32%でした。いずれの対照処置においても眼色素喪失は観察されなかった。第二に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)18 およびシーケンシング19を介して染色体変異が確認されました。変異株を回収できなかったため、3ガイドミックスまたはバッファーのいずれかを注入した胚のプールからゲノムDNAを分析しました。3つのガイドミックスは、 白い 遺伝子座から~180塩基対を除去することが期待されています。これは、注射された個人から単離されたゲノムDNAから増幅されたPCR産物、およびそれらの産物から生成された関連する配列データで見ることができます(図11)。この組み合わせた証拠は、細胞化が起こる前に胚が注射されたことを示しています。 図1:アスピレーター。 効果的なアスピレーターは、プラスチックチューブを介して吸気口に真空ポンプを取り付けることから、15mLのプラスチック円錐管に組み立てることができます。円錐形のチューブの底から約0.5 cmを慎重に取り外す必要があります。綿球を円錐形のチューブのプラスチックチューブの開口部の上に配置して、 P.maidis の成虫が収集されるときにキャッチし、真空ポンプから遠ざける必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:成人用コンテナの構造。 (A)必要な消耗品(左上から時計回り):スクリーン、ホットグルーガン、かみそりの刃、1オンスの容器。(B)1オンスの容器の底に大きな穴を開け、この穴を覆うのに十分な大きさのスクリーンを正方形に切ります。(C)次に、ホットグルーを使用してスクリーンを穴に接着します。(D)接着剤をセットしたら、余分なメッシュを取り除く必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:性別P .メイド成人 。 オス(左)とメス(右) のP. maidis 成虫の腹側が示されています。女性の腹部の上に見える産卵管は、個人の性別の最も明確な指標です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:大人を容器に密封する 。 (A)5cm×5cm角のプラスチックパラフィンワックスフィルム。(B)フィルムは、元のサイズの3〜4倍に均等に伸ばす必要があります。(C)成虫が成体の容器に入れられたら、引き伸ばされたフィルムを開口部の上に置き、成虫を固定する必要があります。次に、10%w/vショ糖溶液の400 μL滴をフィルムの上に置きます。(D)成人に適切な給餌圧力を与えるために、2番目の5 cm x 5 cmの正方形のプラスチックパラフィンフィルムを同様に引き伸ばし、スクロースの滴の上に置く必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:産卵室の設置 。 (A)必要な物資(左上から時計回り):ラップ、完成した成人用容器(成人用)、および1%アガロース(産卵培地)を含むペトリ皿。(B)成体容器をアガロースの上に置き、プラスチックパラフィンフィルム/10%スクロース「サンドイッチ」を産卵培地に直接置く必要があります。(C)ラップは、成体容器を産卵培地に固定するために使用されます。これにより、培地の乾燥が早すぎるのを防ぎます。(D)空気交換が継続できるように、成人用コンテナの画面を覆わないように注意する必要があります。(E)産卵室の図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:加湿フード。 注入スコープの周りに加湿器を装備したフードが設置され、空気の通風を最小限に抑え、胚の取り扱い中に湿度を維持します。作業者が所定の位置に配置された後、フラップを入り口に折りたたむことができ、適切な湿度レベルを維持するのに役立ちます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図7:注射の準備として胚を採取 する。 (A)産卵培地に沈着した胚。一対の細かい鉗子を使用して、培地から胚を抽出し、それらをその表面に配置する。(B)22 mm x 30 mmのカバーガラスに1 mm x 15 mmの両面テープの細いストリップ。(C)カバーガラスは、培地の表面からカバーガラス上のテープに胚を移すことを容易にするために、産卵培地上に置くことができる。(D) P. maidis 胚はバナナの形をしており、一方の端がもう一方の端よりも狭い(狭い端は赤い矢印の頭で示され、広い端は黄色の矢印の頭で示されます)。胚の広い端をテープの上に置く必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図8:注射。 (A)注入プラットフォームは、1%寒天で縁まで満たされたペトリ皿です。胚を保持するテープのストリップを備えたカバーガラスは、注射プラットフォームの表面に直接配置する必要があります。(B)注入圧力は、胚が注入される前に、少量の注射液を水滴に「注入」することによってテストする必要があります。この方法は、注射プロセス中にいつでも針の詰まりをチェックするためにも使用できます。(C)胚は、胚の大きい方の端に針を挿入することによって注入する必要があります。注射が成功した場合、注射液が見えるはずです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図9:注射後のケア 。 (A)カバーガラス上のすべての胚が注入されたら、カバーガラスを1%アガロースを含む新鮮なペトリ皿に入れる必要があります。(B)カバーガラス付きのペトリ皿は、胚が孵化するまで湿度チャンバー(図のような)に維持することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図10: Pmw ノックアウト表現型。 (A)年齢を一致させたコントロールおよび(B) Pmw ノックアウト胚、発達中の目は黒い矢じりで示されています。 B の胚はモザイクで、色素沈着の小さな縞模様が見られます。(C)年齢を一致させた対照と(D) Pmw ノックアウト孵化したばかりの子ガメで、挿入図は目に異なる角度を示しています。 D の孵化したばかりの子ガメもモザイクです。白い矢印は、色素沈着の喪失を示すメイン画像の領域を指しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図11: Pmw ノックアウトシーケンス。 (A)500 bp刻みでマークされた Pmw mRNAのスケールモデルで、gRNA結合部位の位置が示されています:G1、青;G2、黄色。G3、ピンク。この時点で発生するフレームシフト変異は、翻訳製品の大部分を混乱させます。(B)gRNAサイトのゲノムコンテキスト、すべて1つのエクソン(太字の大文字のテキスト)。ガイド結合部位は Aと同じ色で強調表示され、PAMには下線が引かれます。スパンは~300 bpです。エクソンのフレーム内翻訳は、大文字のテキストの1文字の略語として上に示されています。眼色素トランスポーターに特有の2つのモチーフがマークされている。ウォーカーB機能ドメインのCDEPTモチーフは紫色で囲まれ、HループドメインのIHQPモチーフは緑色で囲まれています。どちらのドメインもATPトランスポーターの機能にとって重要です。(C) Pmw 標的領域を2ラウンドのPCRを用いて増幅した。第2ラウンドの製品は、ガイド間の領域の除去に成功したことによるサイズシフトの証拠についてゲル上で調べられました。レーン: L = 100 bp ラダー;1 = PCR水制御;2 =バッファー注入卵;3-4 =3つのガイドミックスを注入した2セットの卵。3ガイドミックスを受けた胚のみが、WTバンド(赤い矢印)と完全な切除から生じるバンド(白い矢印)の両方を産生した。(D)下(白矢印)バンドの同一性を確認するために、このDNAを精製、クローニング、および配列決定した。一番上の行は野生型の配列です。他の2行は、2つのクローンからのシーケンスです。さらに3つのクローンが一番下の配列と一致しました。青色のハイライトはガイド1の結合部位を示し、ピンク色のハイライトはガイド3の結合部位を示します。両方の対立遺伝子において、これら2つのガイド部位の間の領域全体が削除されている。略語: Pmw = ペレグリヌスマイディスホワイト 遺伝子;gRNA = ガイドRNA;PAM = プロトスペーサー隣接モチーフ;ATP =アデノシン三リン酸;PCR =ポリメラーゼ連鎖反応;WT =野生型;KO =ノックアウト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 セット # カップ数 各カップの女性の#数 #卵の 卵の合計#数 2日目 3日目 4日目 5日目 6日目 7日目 8日目 9日目 1 10 15 0 26 166 355 530 193 91 37 1398 2 15 15 22 238 489 699 520 379 203 58 2608 3 8 15 0 57 230 190 116 80 34 1 708 4 10 15 0 226 446 519 301 179 24 15 1710 トータル 43 15 23 547 1331 1763 1467 831 352 111 6483 表1:人工産卵環境からの代表的な採卵 。4セットの採卵カップのデータが表示され、卵の集計はセットアップ後2日目から9日目まで続きます。 注射治療 注入総量 開発総数 ハッチングされた合計 開発率(%) ハッチ率(%) バッファ 39 20 12 51 31 キャス9 39 24 14 61 36 Cas9 +Pmw gRNA 121 71 28 59 28 表2:3つの異なる注射ミックスの注射による生存率とノックアウト率。