استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه
Summary
Gangliosides هي جليكوسفينغوليبيد حاملة لحمض السياليك وفيرة بشكل خاص في الدماغ. تتطلب طبيعتها البرمائية تقنيات استخراج وتنقية عضوية / مائية لضمان الاسترداد الأمثل والتحليلات الدقيقة. توفر هذه المقالة لمحات عامة عن استخراج العقدة التحليلية والإعدادية وتنقيتها وتحليل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة.
Abstract
Gangliosides هي جليكوسفينغوليبيد تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا حمض السياليك. توجد على جميع الخلايا والأنسجة الفقارية ولكنها وفيرة بشكل خاص في الدماغ. يتم التعبير عنها في المقام الأول على النشرة الخارجية للأغشية البلازمية للخلايا ، فهي تعدل أنشطة بروتينات سطح الخلية عن طريق الارتباط الجانبي ، وتعمل كمستقبلات في تفاعلات الخلايا الخلوية وهي أهداف لمسببات الأمراض والسموم. يؤدي خلل التنظيم الوراثي للتخليق الحيوي للعقدة في البشر إلى اضطرابات خلقية حادة في الجهاز العصبي. بسبب طبيعتها البرمائية ، يتطلب استخراج وتنقية وتحليل العقديات تقنيات تم تحسينها من قبل العديد من الباحثين في سنوات 80 منذ اكتشافها. هنا ، نصف طرقا على مستوى مقاعد البدلاء لاستخراج وتنقية وتحليلات نوعية وكمية أولية للجانجليسيدات الرئيسية من الأنسجة والخلايا التي يمكن إكمالها في غضون ساعات قليلة. كما نصف طرقا لعزل وتنقية الأنواع الرئيسية من الجانجليوسيد على نطاق أوسع من الدماغ. توفر هذه الطرق معا وصولا تحليليا وتحضيريا إلى هذه الفئة من الجزيئات النشطة بيولوجيا.
Introduction
تعرف الجانجليوسيدات بأنها جليكوسفينغوليبيد تحمل واحدا أو أكثر من بقايا حمض السياليك1. يتم التعبير عنها في المقام الأول على سطح الخلية مع مويتي الدهون سيراميد الكارهة للماء المضمنة في النشرة الخارجية لغشاء البلازما والجليكان المحب للماء الذي يمتد إلى الفضاء خارج الخلية2. على الرغم من توزيعها على نطاق واسع في الخلايا والأنسجة الفقارية، إلا أنها وفيرة بشكل خاص في دماغ الفقاريات3، حيث تم اكتشافها لأول مرة وتسميتها4.
تختلف هياكل الجليكان العقدي وهي أساس تسميتها (الشكل 1). يتكون جليكان جانجليوسيد من نواة سكر محايدة تحمل أعدادا وتوزيعات مختلفة من أحماض السياليك. أصغر جانجليوسيد ، GM4 ، يحتوي على سكرين فقط (حمض السياليك المرتبط بالجالاكتوز)5. قد تحتوي العقديات الكبيرة التي تحدث بشكل طبيعي على أكثر من اثني عشر سكرية إجمالية6 أو ما يصل إلى سبعة أحماض سياليك على نواة محايدة واحدة7. كما تختلف الجزيئات الدهنية من السيراميد ، حيث تحتوي على أطوال سفينغوزين مختلفة ومجموعة متنوعة من أميدات الأحماض الدهنية. في دماغ الفقاريات ، تسود أربعة أنواع من الجانجليوسيد ، GM1 و GD1a و GD1b و GT1b. يتم تنظيم تعبير Ganglioside من الناحية التنموية ، والأنسجة المحددة ، ونوع الخلية محددة.
الشكل 1: العقد الدماغية الرئيسية وسلائفها الاصطناعية الحيوية. يتم عرض الهياكل باستخدام تسمية الرمز ل Glycans11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تعمل Gangliosides على المستوى الجزيئي عن طريق إشراك وتعديل البروتينات في أغشيتها الخاصة (تنظيم رابطة الدول المستقلة) أو عن طريق إشراك بروتينات ربط الجليكان في الوسط خارج الخلية ، بما في ذلك السموم البكتيرية والليكتين على الخلايا الأخرى (التعرف عبر الإنترنت)3. يؤدي الارتباط المحدد للجانجليوسيدات بالبروتينات التنظيمية و / أو الارتباط الذاتي مع جزيئات أخرى في طوافات دهنية إلى تغييرات في سلوك الخلية التي تؤثر على بنية الجهاز العصبي ووظيفته ، وتطور السرطان ، والتمثيل الغذائي ، والالتهاب ، واعتلال البروتين العصبي ، والأمراض المعدية8. وبسبب أدوارها الخلوية المتنوعة، يمكن أن توفر طرق عزلها وتحليلها رؤى معززة في تنظيم العمليات الفسيولوجية والمرضية. هنا ، يتم توفير طرق تم التحقق من صحتها للاستخراج والتحليل السريع على نطاق صغير ، والعزل على نطاق تحضيري للجانجليوسيدات من الدماغ. وتناقش الفرص والتحديات للتطبيق على الأنسجة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن طرق استخراج وعزل العصابات الصغيرة والكبيرة النطاق المبلغ عنها هنا ليست فريدة من نوعها – فهناك العديد من أساليب استخراج وتنقية المذيبات المختلفة التي توفر نتائج ممتازة12. وقد ثبت أن الطرق التي تم الإبلاغ عنها هنا للتنقية على نطاق صغير من الدماغ ، من فريدمان وسفينرهولم <sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) لمنحة Glycoscience U01CA241953. تم دعم MJP من قبل برنامج واجهة الكيمياء والبيولوجيا في جامعة جونز هوبكنز (T32GM080189).
Materials
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe – Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe – Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L. Gangliosides of the vertebrate nervous system. Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al. E-selectin receptors on human leukocytes. Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L. Isolation of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K. Thin-layer chromatography of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
