מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל
Summary
גנגליוסידים הם גליקוספינגוליפידים נושאי חומצה סיאלית הנמצאים בשפע במיוחד במוח. טבעם האמפיפתי דורש טכניקות מיצוי וטיהור אורגניות/מימיות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית וניתוחים מדויקים. מאמר זה מספק סקירות כלליות של מיצוי גנגליוסיד בקנה מידה אנליטי ומכין, טיהור, וניתוח כרומטוגרפיה שכבה דקה.
Abstract
גנגליוסדים הם גליקוספינגוליפידים המכילים שאריות חומצה סיאלית אחת או יותר. הם נמצאים על כל התאים והרקמות החולייתיים אבל הם נפוצים במיוחד במוח. בא לידי ביטוי בעיקר על העלון החיצוני של קרום הפלזמה של תאים, הם לווסת את הפעילות של חלבונים פני התא באמצעות שיוך לרוחב, לפעול כקולטנים באינטראקציות תא-תא והם מטרות עבור פתוגנים ורעלים. דיסרגציה גנטית של ביוסינטזה ganglioside בבני אדם גורמת להפרעות חמורות במערכת העצבים המולדת. בשל אופיים האמפיפי, החילוץ, הטיהור והניתוח של גנגליוסידים דורשים טכניקות שעברו אופטימיזציה על ידי חוקרים רבים ב -80 השנים שחלפו מאז גילוים. כאן, אנו מתארים שיטות ברמת הספסל לחילוץ, טיהור, וניתוחים איכותיים וכמותיים ראשוניים של גנגליוסדים גדולים מרקמות ותאים שניתן להשלים תוך מספר שעות. אנו מתארים גם שיטות לבידוד וטיהור בקנה מידה גדול יותר של מינים גנגליוסידים מרכזיים מהמוח. יחד, שיטות אלה מספקות גישה בקנה מידה אנליטי ומכין לסוג זה של מולקולות ביואקטיביות.
Introduction
גנגליוסידים מוגדרים כגליקוספינגולפידים הנושאים שאריות חומצה סיאלית אחת או יותר1. הם באים לידי ביטוי בעיקר על פני השטח של התא עם moiety השומנים הסרמיד ההידרופובי שלהם מוטבע בעלון החיצוני של קרום הפלזמה ואת הגליקנים ההידרופיליים שלהם המשתרעים לתוך החלל החוץ תאי2. למרות שהם מופצים באופן נרחב בתאים וברקמות בעלי חוליות, הם נפוצים במיוחד במוח החוליות3, שם הם התגלו לראשונה ושמם 4.
המבנים של הגליקנים של גנגליוסייד משתנים ומהווים את הבסיס למינוח שלהם (איור 1). גליקנים גנגליוזידים מורכבים מליבת סוכר נייטרלית הנושאת מספרים שונים והפצות של חומצות סיאליות. בגנגליוסיד הקטן ביותר, GM4, יש רק שני סוכרים (חומצה סיאלית הקשורה לגלקטוז)5. גנגליוסידים טבעיים גדולים יותר עשויים להכיל יותר מתריסר סוכרים סה”כ6 או עד שבע חומצות סיאליות על ליבה נייטרלית אחת7. שלהם ceramide שומנים שומנים גם להשתנות, בעל אורכי ספינגוזין שונים ומגוון של חומצות שומן amides. במוח החוליות שולטים ארבעה מינים של גנגליוסיד, GM1, GD1a, GD1b ו- GT1b. ביטוי Ganglioside מוסדר מבחינה התפתחותית, ספציפי לרקמות, וסוג התא הספציפי.
איור 1: גנגליוסידים מוחיים עיקריים ומבשרי הביוסינתזה שלהם. מבנים מוצגים באמצעות מינוח סמלים עבור Glycans11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
גנגליוסידים פועלים ברמה המולקולרית על ידי עיסוק ווויסות חלבונים בממברנות שלהם (ויסות cis) או על ידי עיסוק בחלבונים מחייבים גליקנים במילייה החוץ-תאי, כולל רעלנים חיידקיים ולקטינים בתאים אחרים (זיהוי טרנס)3. קשירה ספציפית של gangliosides חלבונים רגולטוריים ו/או קשר עצמי עם מולקולות אחרות לתוך רפסודות שומנים בדם גורמת לשינויים בהתנהגות התא המשפיעים על מבנה ותפקוד מערכת העצבים, התקדמות סרטן, חילוף החומרים, דלקת, חלבונים עצביים, ומחלות זיהומיות8. בשל תפקידיהם התאיים המגוונים, שיטות הבידוד והניתוח שלהם יכולות לספק תובנות משופרות על ויסות תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. כאן, שיטות מאומתות לחילוץ וניתוח מהיר בקנה מידה קטן, ובידוד בקנה מידה הכנה של גנגליוסידים מהמוח מסופקים. הזדמנויות ואתגרים ליישום לרקמות אחרות נדונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות להפקת גנגליוסיד בקנה מידה קטן וגדול ובידוד שדווחו כאן אינן ייחודיות – ישנן גישות מיצוי וטיהור ממסים רבות ושונות המספקות תוצאות מצוינות12. השיטות שדווחו כאן לטיהור בקנה מידה קטן מהמוח, מפרדמן וסוונרהולם13, הוכחו כמייעלות את ההתאוששות והוכחו כחסונות ופשוטות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן המשותפת של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) עבור מענק Glycoscience U01CA241953. MJP נתמך על ידי התוכנית לממשק כימיה-ביולוגיה באוניברסיטת ג’ונס הופקינס (T32GM080189).
Materials
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe – Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe – Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
- Schnaar, R. L. Gangliosides of the vertebrate nervous system. Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).
- Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
- Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
- Nimrichter, L., et al. E-selectin receptors on human leukocytes. Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).
- Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
- Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
- Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
- Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
- Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
- Schnaar, R. L. Isolation of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).
- Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
- Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
- Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
- Schnaar, R. L., Needham, L. K. Thin-layer chromatography of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).
- Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
- Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).
