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Chemistry

Monitoraggio delle interazioni proteina-ligando nelle cellule umane mediante NMR quantitativa in-cellula in tempo reale utilizzando un bioreattore ad alta densità cellulare

Published: March 09, 2021
doi:
10.3791/62323
,
1Magnetic Resonance Center − CERM,University of Florence, 2Consorzio Interuniversitario Risonanze Magnetiche di Metalloproteine − CIRMMP, 3Neurofarba Department,University of Florence

Summary

Questo protocollo descrive la configurazione di un bioreattore NMR per mantenere vitali le cellule umane incapsulate fino a 72 ore, seguito dall’acquisizione e dall’analisi dei dati NMR in-cell risolti nel tempo. La metodologia viene applicata per monitorare le interazioni intracellulari proteina-ligando in tempo reale.

Abstract

La NMR in-cell è un approccio unico per osservare le proprietà strutturali e dinamiche delle macromolecole biologiche a risoluzione atomica direttamente nelle cellule viventi. Si possono osservare ripiegamenti proteici, modifiche chimiche e cambiamenti conformazionali indotti dal legame del ligando. Pertanto, questo metodo ha un grande potenziale nel contesto dello sviluppo di farmaci. Tuttavia, la breve durata delle cellule umane confinate nello spettrometro NMR limita il campo di applicazione della NMR in-cell. Per superare questo problema, vengono impiegati bioreattori NMR che possono migliorare notevolmente la stabilità del campione cellulare nel tempo e, soprattutto, consentire la registrazione in tempo reale degli spettri NMR in-cell. In questo modo, l’evoluzione di processi come la penetrazione del ligando e il legame al bersaglio proteico intracellulare può essere monitorata in tempo reale. I bioreattori sono spesso limitati da una bassa vitalità cellulare ad alto numero di cellule, il che si traduce in un compromesso tra la sensibilità complessiva dell’esperimento e la vitalità cellulare. Recentemente abbiamo riportato un bioreattore NMR che mantiene un elevato numero di cellule umane metabolicamente attive per lunghi periodi di tempo, fino a 72 ore. Questa configurazione è stata applicata per monitorare le interazioni proteina-ligando e la modifica chimica delle proteine. Abbiamo anche introdotto un flusso di lavoro per l’analisi quantitativa dei dati NMR in tempo reale, basato sulla risoluzione della curva multivariata. Il metodo fornisce profili di concentrazione delle specie chimiche presenti nelle cellule in funzione del tempo, che possono essere ulteriormente analizzati per ottenere parametri cinetici rilevanti. Qui forniamo una descrizione dettagliata della configurazione del bioreattore NMR e della sua applicazione al monitoraggio delle interazioni proteina-ligando nelle cellule umane.

Introduction

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) in-cell è recentemente emersa come un potente approccio per studiare le proprietà strutturali e dinamiche delle macromolecole all’interno dell’ambiente cellulare1,2,3,4,5,6. La NMR in-cell è riuscita nello studio di processi funzionalmente rilevanti come il ripiegamento/misfolding proteico7,8,9, il legame del metallo7,10, la formazione del legame disolfuro11,12 e l’interazione proteina-proteina13, l’interazione proteina-ligando14,15,16 e l’interazione acido-ligando nucleico17 ,18 nelle cellule umane viventi. Uno dei fattori limitanti delle applicazioni NMR in-cell è la breve durata delle cellule durante l’esperimento. La soluzione a questo problema prevede l’uso di bioreattori NMR. In questi dispositivi, un flusso costante di terreno di crescita viene applicato alle cellule, che sono tenute confinate all’interno dello spettrometro NMR, al fine di fornire ossigeno e sostanze nutritive e rimuovere sottoprodotti tossici. In seguito all’avvento della NMR in-cell, sono stati sviluppati diversi progetti di bioreattori NMR per migliorare la vitalità cellulare per periodi di tempo più lunghi, in cui batteri o cellule di mammifero sono incapsulati in un idrogel19,20,21,22 o mantenuti in sospensione e perfusi attraverso l’uso di una membrana di microdialisi23 . Tali bioreattori hanno permesso l’acquisizione di esperimenti NMR più lunghi con un aumento del rapporto segnale-rumore (S/N)5 e, cosa ancora più importante, potrebbero essere impiegati per studiare i processi cellulari in tempo reale22,23,24. Grazie all’elevata sensibilità chimica e conformazionale della NMR, quest’ultima applicazione può fornire preziose informazioni sulla cinetica dei processi funzionali all’interno di cellule viventi a risoluzione atomica.

In questo protocollo, mostriamo come impostare e utilizzare un bioreattore migliorato recentemente riportato25, che è stato ottenuto combinando un progetto di bioreattore modulare esistente23 con l’approccio basato sull’incapsulamento cellulare in idrogel che sono stati pionieri di altri gruppi19,20,21,22,26,27 . Descriviamo l’applicazione del bioreattore a studi NMR in-cell in tempo reale sul legame del ligando intracellulare protein-observe nelle cellule HEK293T. Nel bioreattore, le cellule sono incapsulate ad alta densità in fili di gel di agarosio e sono mantenute altamente vitali e metabolicamente attive fino a 72 ore, durante le quali vengono registrati esperimenti NMR in-cell in tempo reale. Il bioreattore è composto da un tubo di vetro che si adatta a sonde NMR standard da 5 mm a tenuta stagna e collegato a un supporto per tubi in modo che la camera del campione interna abbia un diametro interno di 4,2 mm, un’altezza di 38 mm e un volume di 526 μL. L’ingresso è un capillare peek lungo 7 metri (o.d. = 1/32″, i.d. = 0,5 mm) inserito nella camera del campione fino a ~6 mm dal basso, mentre l’uscita è un capillare in PTFE lungo 7 metri (o.d. = 1/32″, i.d. = 0,5 mm) attaccato nella parte superiore del supporto del tubo (Figura 1). Il tubo è inserito coassialmente in una linea a temperatura controllata collegata a un bagno d’acqua. L’ingresso e l’uscita sono collegati tramite tubi in PEEK a una valvola a 4 vie e 2 posizioni collegata a una pompa FPLC per il controllo del flusso medio e di un contenitore per i rifiuti.

Il bioreattore viene applicato per studiare la cinetica dell’interazione, precedentemente riportata14,25, tra due farmaci, acetazolamide (AAZ) e metazolamide (MZA), in cellule umane con la seconda isoforma di anidrasi carbonica umana (CA II), un bersaglio farmacologicamente rilevante28,29,30, e la cinetica della formazione del legame disolfuro intramolecolare, promosso dalla piccola molecola ebselen25, 31, della forma priva di rame, legata allo zinco del rame umano, la superossido dismutasi di zinco (SOD1), un enzima antiossidante implicato nell’insorgenza della sclerosi laterale amiotrofica7,8,32. Infine, l’analisi quantitativa dei dati NMR in tempo reale viene eseguita in MATLAB utilizzando l’algoritmo MCR-ALS (Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares)33, attraverso il quale si ottengono le componenti spettrali pure e i profili di concentrazione in funzione del tempo per le specie osservate, che possono essere ulteriormente analizzate per ottenere parametri cinetici rilevanti.

Il protocollo parte da un pallone T75 di celle HEK293T (~ 3 x 107 celle per pallone) che sovraesprimono transitoriamente CA II umano (non etichettato) o SOD1 umano (etichettato 15N). Le cellule sono state coltivate e mantenute in palloni T75 con DMEM ad alto glucosio di 1:10 passaggi ogni 3-4 giorni e trasfettate con il cDNA che codifica la proteina di interesse 48 ore prima dell’esperimento. Le fasi coinvolte in questa fase sono riportate in dettaglio altrove34.

Protocol

1. Configurazione del reagente e della soluzione Per preparare il DMEM completo, aggiungere 5 mL di L-glutammina 200 mM, 5 mL di penicillina-streptomicina 100x e 50 mL di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale 10% vol/vol) a 440 mL dmEM.NOTA: questa soluzione può essere conservata a 4 °C per 1 mese. Preparare la soluzione di agarosio sciogliendo 150 mg di agarosio a basso contenuto di gelifico in 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 85 °C per ottenere una soluzione all’1,5% (p/v). Sterilizzare per filtrazione con un filtro da 0,22 μm. Preparare aliquote da 1 mL di soluzione di agarosio in tubi chiusi da 1,5 mL e conservare a 4 °C. Preparare il mezzo del bioreattore. Sciogliere 13,4 g di polvere DMEM in 1 L di H2O ultrapuro.NOTA: a seconda dell’applicazione, il volume finale richiesto può variare (ad esempio, per 500 mL di terreno, sciogliere 6,7 g di polvere in 500 mL H2O). Aggiungere il 2% fbs, 10 mM NaHCO3, 1x penicillina-streptomicina (100x) e il 2% D2O (ad esempio, per 500 mL di mezzo, aggiungere 10 mL di FBS, 0,4 g di NaHCO3, 5 ml di penicillina-streptomicina 100x e 10 mL di D2O). Misurare il pH utilizzando un pHmetro e, se necessario, regolare a 7,4 aggiungendo HCl.NOTA: In genere, il pH iniziale è molto vicino a 7,4. Filtrare il mezzo del bioreattore con un filtro sterile sottovuoto in un flacone di vetro sterile da 250 ml o 500 ml. Nella cappa a flusso laminare, sigillare la bottiglia con un copricapo in acciaio sterile con due ugelli flessibili e collegarli a un tubo IN FEP (o.d. = 1/8″, i.d. = 1,6 mm) che sarà collegato alla pompa e a un filtro a siringa in PTFE da 0,22 μm per la presa d’aria. 2. Configurazione del bioreattore Assemblare l’unità di flusso utilizzando un secondo tubo NMR dell’unità di flusso, che verrà successivamente sostituito con quello contenente le celle. Fare riferimento alle istruzioni per l’uso dell’unità di flusso per l’assemblaggio corretto.NOTA: a questo punto l’unità di flusso deve essere già pulita (in caso contrario, eseguire il passaggio 4.2). Impostare il bagno d’acqua collegato al controllo della temperatura dell’unità di flusso a 37 °C. Posizionare la bottiglia del serbatoio a bagnomaria. Collegare il tubo FEP della bottiglia del serbatoio alla pompa. Ruotare la valvola del bioreattore per “bypassare” e preriempire la pompa con il mezzo. Ruotare la valvola del bioreattore per “fluire” e preriempire il bioreattore con il mezzo a 0,1 ml / min. 3. Preparazione del campione cellulare Raccogliere le cellule dall’incubatore a CO2 . Prendi un pallone T75 di celle HEK293T trasfettate dall’incubatore a CO2 e rimuovi il mezzo esaurito. Lavare le celle due volte con 7 mL (ciascuna) di PBS a temperatura ambiente (~20 °C). Utilizzare 2 ml di tripsina/EDTA per staccare le cellule. Dopo aver aggiunto la soluzione, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per staccare le cellule.NOTA: le cellule trasfettate potrebbero richiedere un po ‘più di tempo per staccarsi. Se necessario, incubare le cellule a 37 °C. Inattivare la tripsina con 20 ml di DMEM completo; risospese accuratamente le cellule mediante pipettaggio su e giù e trasferirle in un tubo centrifugo da 50 ml. Centrifugare le celle a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Lavare le celle con 10 ml di PBS a temperatura ambiente per rimuovere il mezzo residuo. Centrifugare le celle a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Trasferire il pellet cellulare in un tubo microcentrifuga coperto da 1,5 mL. Incorporare le celle nei fili di agarosio. Sciogliere un’aliquota di agarosio solidificato a 85 °C a bagnomaria e successivamente tenerla in soluzione a 37 °C in un riscaldatore a blocchi. Con una pipetta Pasteur, riempire il fondo del tubo NMR dell’unità di flusso con 60-70 μL di gel di agarosio all’1,5% e metterlo nel ghiaccio. Ciò creerà un tappo inferiore alto ~ 5 mm che consente di posizionare il campione di cella all’interno del volume attivo della bobina NMR 1H. Riscaldare il pellet di celle ottenuto nel passaggio 3.1.8 a 37 °C per 15-20 s nel termoblocco. Cellule risospese in 450 μL di soluzione di agarosio. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle. Aspirare la sospensione di cell-agarosio in un tubo PEEK per cromatografia lungo circa 30 cm (i.d. = 0,75 mm) collegato a una siringa da 1 mL.NOTA: Prima dell’aspirazione, il tubo e il volume morto della siringa devono essere preriempiti con PBS a temperatura ambiente per evitare la formazione di bolle. La lunghezza del tubo non è critica. Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente per 2 minuti. Preriempire il tubo NMR dell’unità di flusso con 100 μL di PBS a temperatura ambiente. Gettare fili di cellule incorporate nell’agarosio nel tubo NMR dell’unità di flusso spingendo delicatamente la siringa.NOTA: per riempire il tubo NMR in modo omogeneo, iniziare posizionando l’estremità del tubo PEEK nella parte inferiore del tubo NMR e procedere verso l’alto oscillando lentamente da sinistra a destra. Ripetere i passaggi 3.2.5, 3.2.6 e 3.2.8 fino a quando non è stata gettata tutta la sospensione di agarosio cellulare. Inserire le cellule nel bioreattore. Rimuovere il tubo NMR vuoto dall’unità di flusso e aumentare la portata a 2 ml/ min per alcuni minuti per rimuovere le bolle di gas residue nel tubo di ingresso. Impostare la portata a 0,2 ml/min e inserire il tubo NMR contenente le celle spingendolo verso l’alto lentamente ma costantemente.NOTA: Il flusso attivo del mezzo evita il riflusso del contenuto del tubo attraverso l’ingresso, che altrimenti si verificherebbe durante l’inserimento. 4. Funzionamento e pulizia del bioreattore Funzionamento del bioreattore durante l’esperimento NMR. Impostare la temperatura nello spettrometro NMR su 310 K. Inserire l’unità di flusso nello spettrometro. Fornire il mezzo del bioreattore ad una portata di 0,1 ml/min per l’intera durata degli esperimenti NMR in-cell. Al momento desiderato durante l’esperimento, iniettare una soluzione concentrata di molecola esterna al flacone del serbatoio medio perforando il tubo di silicone con una siringa sterile ad ago lungo.NOTA: La concentrazione finale della molecola nel mezzo deve essere scelta in base alle precedenti conoscenze sulla tossicità cellulare e, se disponibile, alla velocità di diffusione prevista/stimata attraverso la membrana cellulare. Alla fine dell’esperimento NMR, sostituire il tubo contenente le celle con un tubo vuoto e risciacquare l’unità di flusso con acqua. Bioreattore clean-in-place. Pulire l’unità di flusso facendo scorrere le seguenti soluzioni a 1 mL/min: 0,2 M di idrossido di sodio (NaOH); 3 M acido citrico; 0,2 M NaOH, per almeno 30 minuti ciascuno, seguito da acqua ultrapura filtrata sterile per >2 ore. Pulire e autoclavare la bottiglia del serbatoio e il gruppo del tubo dopo ogni corsa. 5. Esperimenti NMR Impostazione degli esperimenti NMR.NOTA: Eseguire questi passaggi in anticipo, prima della preparazione del campione NMR in-cell, per evitare ritardi tra la raccolta cellulare e l’acquisizione dei dati. Creare un nuovo set di dati nello spettrometro NMR e impostare i parametri per gli esperimenti NMR desiderati. Impostare i parametri per gli esperimenti NMR 1D 1H. Centrare la frequenza portante 1H a 4,7 ppm sul segnale dell’acqua. Selezionare il programma di impulsi zgesgp, impostare la larghezza spettrale su 20 ppm e un impulso quadrato di 1.000 μs a 180 ° per la soppressione dell’acqua. Impostare un ritardo di inter-scansione di 1 s. Acquisisci lo spettro con 32 scansioni. Per le celle che esprimono CA II non etichettato: selezionare il programma di impulsi p3919gp, impostare la larghezza spettrale su 30 ppm per coprire la regione imino dello spettro e regolare il ritardo per la soppressione binomiale dell’acqua in modo che l’eccitazione massima sia centrata sugli spostamenti chimici dei segnali di interesse (d7 = 20 μs a 950 MHz). Impostare un ritardo di inter-scansione di ≥1 s. Acquisisci con 512 scansioni. Per le celle che esprimono SOD1 marcato 15N: selezionare il programma di impulsi sfhmqf3gpph, impostare le larghezze spettrali 1H e 15N su 16 e 50 ppm, rispettivamente, l’offset dell’impulso sagomato e la larghezza di banda di eccitazione a 8,5 e 6 ppm, rispettivamente, e un impulso di 350 μs per lo schema di disaccoppiamento (garp4 o altro a seconda dello strumento). Impostare un ritardo di inter-scansione di 0,3 s. Acquisisci con 16 scansioni e 128 incrementi nella dimensione 15N. Acquisizione di spettri NMR in tempo reale. Una volta inserito il bioreattore nello spettrometro NMR, attendere qualche minuto per consentire lo scambio del mezzo.NOTA: questo processo è facilmente monitorabile dall’aspetto del segnale di blocco poiché il PBS viene sostituito con un mezzo contenente il 2% di D2O. Regolare la corrispondenza e la sintonizzazione del canale 1H, shim il magnete e calcolare la lunghezza dell’impulso duro 1H 90 °. Regolare i livelli di potenza 1H in ogni sequenza di impulsi in base all’impulso duro 1H. Registrare un primo spettro zgesgp 1H per verificare il contenuto del campione e l’omogeneità del campo. Copiare gli esperimenti zgesgp e p3919gp/sfhmqcf3gpph nel numero desiderato e metterli in coda nello spooler di acquisizione.NOTA: Gli spettri zgesgp vengono utilizzati solo per controllare lo stato del campione e l’omogeneità del campo; pertanto, possono essere saltati o registrati meno frequentemente. Per le celle che esprimono CA II senza etichetta: elaborare gli spettri p3919gp applicando il riempimento zero e la funzione della finestra di allargamento esponenziale della linea (LB = 20 Hz). Per le celle che esprimono SOD1 con etichetta 15N: elaborare gli spettri sfhmqcf3gpph applicando il riempimento zero e la funzione della finestra a campana sinusoidale quadrata (SSB = 2) in entrambe le dimensioni.NOTA: La dimensione degli spettri elaborati può essere ulteriormente ridotta rimuovendo le regioni prive di segnali (in Topspin, questo viene fatto impostando i valori STSR e STSI desiderati). 6. Analisi MCR-ALS Per l’analisi degli spettri CA II, importare le regioni spettrali 1D in MATLAB R2019b. Nel software, creare un elenco di esperimenti da esportare nel menu Process Dataset List . Utilizzando una versione modificata del programma au convbin2asc, esportare la regione spettrale di interesse in formato ASCII per ogni spettro.Nota : questo crea un file di testo denominato ascii-spec.txt in ogni sottodirectory di spettro. In MATLAB, importa le regioni spettrali utilizzando lo script personalizzato Load_ascii_spectra.NOTA: questo script richiede la directory del set di dati come input e produce uno spettro di matrice 2D contenente gli spettri 1D impilati e un array 1D cs contenente gli spostamenti chimici. Eseguire lo script Load_acqus per estrarre i timestamp dagli spettri 1D.NOTA: questo script produce una matrice 1D times_hours contenente l’incremento di tempo per ogni spettro espresso in ore, con lo spettro iniziale al tempo = 0. Per l’analisi degli spettri SOD1, importare spettri 2D in MATLAB R2020b. In Topspin, create un elenco di esperimenti da esportare nel menu Elenco set di dati di processo . In MATLAB, importa gli spettri 2D utilizzando lo script personalizzato Load_2D_spectra.NOTA: questo script richiede la directory del set di dati come input e produce un array 3D Spectra contenente gli spettri 2D impilati e un array 1D cs contenente gli spostamenti chimici. Eseguire lo script Load_acqus per estrarre i timestamp dagli spettri 2D. Specificare le regioni spettrali di interesse nello script personalizzato Cut_2D_spectra ed eseguire lo script per tagliare le sotto-matrici 3D [(1H x 15N) intensità spettrali) x tempo]; rimodellarli come array 2D (punti temporali x intensità spettrali) e unirli insieme.NOTA: in questo modo viene prodotta una matrice 2D JoinSpec_flat contenente le regioni spettrali rimodellate e unite. Eseguire MCR-ALS 2.0 in modalità GUI. Aprire la GUI di MCR-ALS 2.0 eseguendo lo script mcr_main. Nella scheda Selezione dati caricare gli spettri o la matrice JoinSpec_flat. I dati possono essere tracciati per il controllo. Valutare il numero di componenti in base alla scomposizione del valore singolare (SVD) o manualmente.NOTA: Il numero di componenti deve corrispondere al numero di specie distinte presenti nell’esperimento. In questo caso n = 2, corrispondente alla proteina libera e legata. Selezionare un metodo per la stima iniziale degli spettri puri. È possibile utilizzare il rilevamento delle variabili più pure o l’analisi fattoriale in evoluzione (EFA). Nella finestra Selezione del set di dati , selezionare Continua. Impostare i vincoli per le concentrazioni nella finestra Vincoli: modalità riga . Applicare un vincolo di non negatività, selezionare fnnls (Fast nonnegativity-constrained least-squares) come “implementazione e 2 specie”. Applicare 1 vincolo di chiusura, impostare il vincolo su 1, la condizione di chiusura come “uguale a” e applicarsi a tutte le specie.NOTA: Questo costringe la somma delle concentrazioni di ciascuna specie ad essere uguale a 1, in modo che i profili ottenuti di ciascuna specie siano normalizzati rispetto alla concentrazione totale di proteine. Impostate i vincoli per gli spettri nella finestra Vincoli: modalità colonna . Applicare un vincolo di non negatività, selezionare fnnls come “implementazione e 2 specie”.NOTA: questo vincolo non deve essere applicato se negli spettri NMR sono presenti segnali negativi. Nella finestra finale, impostare 50 iterazioni e il criterio di convergenza 0,01. Specificare i nomi di output per Concentrazioni, Spettri e Deviazione Std. Fare clic su Continua per eseguire il raccordo MCR-ALS.NOTA: Una finestra grafica mostrerà il risultato del montaggio con grafici dei profili di concentrazione e gli spettri dei componenti puri. Per il set di dati SOD1: utilizzare lo script personalizzato Rebuild_2D_spectra per ricostruire le regioni spettrali 2D dall’output 1D di MCR-ALS e tracciarle. 7. Test del tripano blu Recuperare il contenuto del tubo NMR con un pipetto Pasteur e trasferire i fili di agarosio in un tubo coperto da 1,5 ml. Rimuovere il mezzo residuo risciacquando i fili di agarosio con 600 μL di PBS e centrifugarli a 4.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Aggiungere 250 μL di PBS e 50 μL di soluzione blu di trypan allo 0,4%. Incubare per 2 minuti con pipettaggio continuo. Lavare due volte con 600 μL di PBS scartando il surnatante. Metti alcuni fili di agarosio su un vetrino per microscopio e tagliali con lame di rasoio per creare piccole fette di gel. Selezionare le fette più sottili (spessore < 0,4 mm, idealmente ~ 0,2 mm) per l'analisi. Trasferire le fette di gel in una camera di conteggio delle celle fatta da sé composta da due vetrini distanziati da tre strati di pellicola di paraffina (~ 0,4 mm di spessore totale) su ciascun lato.NOTA: potrebbe essere utilizzata anche una slitta da camera; tuttavia, le fette di gel più spesse dell’altezza della camera (0,1 mm) verrebbero schiacciate, rompendo le cellule incorporate. Acquisisci immagini di cellule all’interno dell’agarosio e conta le cellule bianche e blu. Calcola la vitalità cellulare come (celle totali – celle blu) / celle totali.

Representative Results

Il protocollo di cui sopra consente l’incapsulamento delle cellule in fili di idrogel per massimizzare la vitalità cellulare per lunghi periodi di tempo, necessari per indagare in tempo reale i processi intracellulari. Nel bioreattore, le cellule sono mantenute vive e metabolicamente attive fino a 72 ore, come confermato dal test del blu di Trypan (Figura 2a-c). In linea di principio, questo protocollo può essere applicato per osservare una proteina intracellulare di interesse che subisce eventuali cambiamenti conformazionali o chimici. Nella prima applicazione sopra descritta, il bioreattore viene applicato per monitorare in tempo reale il legame di due inibitori, AAZ e MZA, a CA II sovraespressi nel citosol delle cellule HEK293T. Il primo spettro di scultura dell’eccitazione 1H (zgesgp) registrato viene utilizzato per valutare l’intensità complessiva del segnale (che è proporzionale al numero di cellule), la presenza di segnali dalla proteina sovraespressa e l’omogeneità del campo (Figura 2d). Nel caso di CA II, il legame intracellulare dei due inibitori può essere monitorato mediante spettri DI RISONANZA NMR WATERGATE 3-9-1935 1D 1H (p3919gp), osservando segnali 1H nella regione compresa tra 11 e 16 ppm. Questi segnali derivano dalle istidine che coordinano lo zinco e da altri residui aromatici di CA II36 e sono perturbati dal legame del ligando14,15. Le concentrazioni di ligando possono essere scelte in base alla velocità di diffusione o, se disponibile, in base a valori di permeabilità precedentemente determinati14. Il successo del legame è confermato visivamente dalla comparsa di un ulteriore insieme di segnali nella regione spettrale di interesse, che sostituisce gradualmente i segnali originali (Figura 3). Le curve di legame time-dependent sono ottenute dall’analisi MCR-ALS, che separa i due insiemi di segnali NMR derivanti da CA II libero e legato (Figura 4a) e fornisce contemporaneamente i profili di concentrazione relativa delle due specie (Figura 4b). Nella seconda applicazione, il bioreattore viene applicato per monitorare la formazione del legame disolfuro intramolecolare SOD1 legato allo zinco promosso da ebselen, un mimetico della glutatione perossidasi, nelle cellule umane. Questo processo viene monitorato osservando i cambiamenti negli spettri 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 (che fornisce un’impronta digitale della conformazione della spina dorsale proteica) causati da perturbazioni della struttura proteica indotte dalla formazione del legame disolfuro. Ulteriori segnali derivanti da SOD1 ossidata al disolfuro appaiono nello spettro 1H-15N e sostituiscono gradualmente quelli da SOD1 ridotta al disolfuro. L’analisi MCR-ALS su regioni selezionate dello spettro 2D separa i segnali derivanti dalle due specie (Figura 5a) e fornisce i loro profili di concentrazione relativa (Figura 5b). Le curve di concentrazione ottenute possono essere ulteriormente analizzate mediante raccordo non lineare per fornire informazioni sulla cinetica dei processi in studio25. Figura 1: Schema del bioreattore. A sinistra: vista della sezione trasversale dell’unità di flusso vuota. A destra: schema della configurazione del bioreattore. Il tubo di ingresso in PEEK è mostrato in verde; il tubo di uscita in PTFE è mostrato in blu. Il pannello di sinistra è riprodotto con il permesso di Luchinat et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Trypan Blue Test su celle incapsulate e controllo del campione mediante 1H NMR. Fette rappresentative di agarosio contenenti cellule incorporate e colorate con blu di tripano (a) immediatamente dopo la colata e (b) dopo 72 ore nel bioreattore; c) vitalità cellulare in funzione del tempo nel bioreattore NMR in condizioni di flusso attivo (nero) e statico (rosso), misurata mediante Trypan Blue Test. (d) zgesgp 1H Spettri NMR registrati su cellule incorporate di agarosio sovraesprimendo CA II in assenza (nero) e in presenza (rosso) di bolle di gas nel bioreattore. In quest’ultimo caso, la diminuzione dell’omogeneità del campo causa l’allargamento della linea e la comparsa di artefatti di soppressione del solvente. Interessanti caratteristiche spettrali sono etichettate. I pannelli (a-c) sono riprodotti con il permesso di Luchinat et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Dati NMR rappresentativi in tempo reale in-cell 1H ottenuti su cellule incapsulate in agarosio nel bioreattore. Grafici a cascata di spettri NMR 1D 1H (regione compresa tra 15,6 e 11,1 ppm) di cellule HEK293T sovraesprimendo CA II e successivamente trattati con (a) 25 μM AAZ e (b) 10 μM MZA, registrati in funzione del tempo nel bioreattore NMR. Il tempo di trattamento del ligando è mostrato con una freccia. L’intensità spettrale (a.u.) è codificata a colori dal blu (più basso) al giallo (più alto). Questa figura è riprodotta con il permesso di Luchinat et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Output MCR-ALS rappresentativo da spettri NMR 1D. (a) spettri NMR 1H dei componenti puri ricostruiti da MCR-ALS: CA II in assenza di ligandi (nero) e nel complesso con AAZ (rosso) o MZA (magenta); b) profili di concentrazione relativa di CA II libero (nero) e legato in funzione del tempo all’aggiunta di AAZ (rosso) o MZA (magenta) ottenuti da MCR-ALS. I tempi di trattamento del ligando sono contrassegnati da frecce. Questa figura è riprodotta con il permesso di Luchinat et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Uscita MCR-ALS rappresentativa da spettri NMR 2D. (a) regioni spettrali 1H-15N (etichettate I-IV) dei componenti puri ricostruiti da MCR-ALS: SOD1 ridotta al disolfuro (nero) e SOD1 ossidata al disolfuro (rosso); b) profilo di concentrazione relativa dei componenti puri in funzione del tempo all’aggiunta di ebselen (contrassegnato da una freccia) ottenuto da MCR-ALS. Questa figura è riprodotta con il permesso di Luchinat et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Lo scopo dell’utilizzo di un bioreattore per l’esperimento NMR in-cell è quello di mantenere le cellule vive e metabolicamente attive per un periodo di tempo prolungato. Per raggiungere questo obiettivo è necessario prendere in considerazione una serie di aspetti critici. In primo luogo, è fondamentale evitare la contaminazione batterica durante la preparazione del campione cellulare e durante l’acquisizione dei dati NMR. Se in laboratorio vengono utilizzati ceppi di E. coli o altri batteri comunemente usati per la clonazione genica e l’espressione proteica ricombinante, possono contaminare le cellule durante la preparazione del campione. Una volta nel bioreattore, i batteri cresceranno rapidamente sfruttando il mezzo di crescita fresco e causeranno la morte cellulare a causa della produzione di endotossine. La contaminazione batterica viene individuata solo in una fase avanzata, quando diventa il mezzo di crescita giallo e torbido. Inoltre, la pulizia incompleta del bioreattore potrebbe causare la contaminazione della pompa o del tubo con batteri, lieviti o muffe comuni.

Un requisito per il successo dell’esperimento è evitare la formazione di bolle di gas. Le bolle di gas intrappolate tra i fili di agarosio nel volume attivo della bobina NMR introdurrebbero grandi disomogeneità del campo magnetico, causando una soppressione incompleta del segnale H2O e una grave perdita di qualità spettrale (Figura 2d). Le bolle possono essere causate dall’aria intrappolata nel sistema o dalla formazione di CO2 gassosa. Il primo può essere facilmente evitato lavando il sistema con il mezzo prima di inserire il campione cellulare, mentre per evitare il secondo si raccomanda di diminuire la concentrazione di NaHCO3 nel terreno di crescita e di mantenere tutte le parti del sistema a temperatura costante per ridurre al minimo le differenze nella solubilità della CO2 . Il metabolismo aerobico cellulare può anche causare la formazione di CO2 gassosa, che può essere prevenuta aumentando la portata.

La vitalità cellulare deve essere controllata dopo ogni esecuzione da Trypan Blue Test. Tuttavia, ciò non fornisce approfondimenti sull’attività metabolica. Per ottenere un quadro più completo dello stato metabolico delle cellule durante il funzionamento del bioreattore, è possibile eseguire spettri NMR 31P per valutare la produzione di ATP in funzione del tempo23,25. Tuttavia, una sonda dedicata è spesso necessaria per questa misurazione, che può consentire la registrazione simultanea con 1H NMR.

Nel caso di CA II, la presenza di segnali reporter ben risolti in una regione insolita dello spettro 1H facilita l’analisi da semplici spettri NMR 1D e non richiede l’arricchimento isotopico durante l’espressione proteica. In generale, altre proteine potrebbero dare origine a segnali 1H utili per monitorare i cambiamenti spettrali in altre regioni, come quello tipico del nucleo idrofobico proteico tra 0 e -1 ppm11; tuttavia, queste regioni tendono ad essere affollate per proteine piegate più grandi di ~ 10 kDa. In questo caso, come mostrato per SOD1, è preferibile arricchire la proteina con 15N, fornendo un mezzo di crescita uniformemente arricchito con 15N durante l’espressione proteica, e monitorare in tempo reale i cambiamenti negli spettri NMR 2D 1H-15N. Gli spettri 2D vengono importati come array 2D in MATLAB, riorganizzati in array 1D e impilati prima dell’analisi MCR-ALS. Quest’ultimo approccio è generalmente applicabile a qualsiasi proteina intracellulare che dà origine a segnali rilevabili e fornisce informazioni sui cambiamenti conformazionali delle proteine a livello di singolo residuo. In linea di principio, quest’ultimo approccio può essere generalizzato agli spettri nD e ad altri schemi di etichettatura isotopica.

Per quanto riguarda l’applicazione a diversi tipi di cellule, il protocollo dovrebbe essere facilmente adattato a diverse linee cellulari e non richiede che la proteina di interesse sia espressa direttamente nelle cellule. Pertanto, altri approcci alla NMR in-cell possono essere combinati con questo protocollo, in cui la macromolecola di interesse viene prodotta in modo ricombinante, o sintetizzata, e successivamente inserita nelle celle mediante elettroporazione o altri metodi di consegna1,9,38. Quando si lavora con diverse linee cellulari o protocolli di preparazione del campione, potrebbe essere necessario ottimizzare empiricamente parametri come la concentrazione di agarosio, lo spessore del filo e la densità cellulare finale nei fili di agarosio. Inoltre, l’applicabilità del protocollo qui descritto è limitata alle cellule che tollerano l’incapsulamento di agarosio. Altri tipi di cellule possono richiedere diverse formulazioni di idrogel, mentre una diversa configurazione è raccomandata quando si analizzano le cellule che crescono nativamente in sospensione, ad esempio, facendo uso di una membrana di microdialisi coassiale per garantire la diffusione dei nutrienti mantenendo le cellule sospese confinate nel tubo NMR23.

Rispetto ad altri progetti di bioreattori NMR19,20,21,22, il dispositivo qui descritto si basa su un’unità di flusso disponibile in commercio, adattata con piccole modifiche. Pertanto, il dispositivo può essere facilmente replicato in diversi laboratori con elevata riproducibilità. Inoltre, consente un funzionamento standardizzato e il pieno rispetto delle rigide norme di sicurezza del laboratorio, se necessario. Nel complesso, la flessibilità e la facilità di funzionamento del bioreattore dovrebbero consentire molte altre applicazioni della soluzione NMR, sia in cellule che in vitro, oltre a quelle già riportate23,25. Alla fine, lo stesso progetto di bioreattore potrebbe essere applicato a campioni che assomigliano più all’ambiente fisiologico di un tessuto, come sferoidi o organoidi, a condizione che vengano trovati scaffold appropriati per mantenere in vita tali campioni – o addirittura sostenere la loro crescita – nello spettrometro NMR.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da iNEXT-Discovery, grant number 871037, finanziato dal programma Horizon 2020 della Commissione Europea, da Instruct-ULTRA, grant number 731005, un progetto EU H2020 per sviluppare ulteriormente i servizi di Instruct-ERIC, e da Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca PRIN grant 20177XJCHX. Gli autori riconoscono il sostegno di Instruct-ERIC, un progetto Landmark ESFRI, attraverso il JRA Award numero 815 e l’utilizzo delle risorse del Centro CERM/CIRMMP Italia. Ringraziamo Matteo Pennestri (Bruker, UK) per aver fornito supporto per il funzionamento dell’unità di flusso InsightMR.

Materials

Materials
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
D2O Sigma-Aldrich 453366
DMEM, high glucose Life Technologies 10313-021
DMEM, high glucose, powder Sigma-Aldrich D5648
FBS Life Technologies 10270
HCl Sigma-Aldrich 30721
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030
Low-gelling agarose, powder Sigma-Aldrich A4018
NaHCO3, powder Carlo Erba 478537
PBS Life Technologies 10010
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
NaOH, pellets Sigma-Aldrich 30620
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) Sigma-Aldrich T8154 Hazard statement(s): H350 may cause cancer.
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) Life Technologies 25300-054
Equipment
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe Bruker n/a All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible.
InsightMR flow unit Bruker n/a
P-920 pump module from ÄKTA FPLC GE Healthcare n/a Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit.
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Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor. J. Vis. Exp. (169), e62323, doi:10.3791/62323 (2021).
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