JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה

Published: March 09, 2021
doi:
10.3791/62323
,
1Magnetic Resonance Center − CERM,University of Florence, 2Consorzio Interuniversitario Risonanze Magnetiche di Metalloproteine − CIRMMP, 3Neurofarba Department,University of Florence

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של bioreactor NMR כדי לשמור על תאים אנושיים אנקפסולציה קיימא עבור עד 72 שעות, ואחריו זמן נפתר בתוך התא NMR נתונים וניתוח. המתודולוגיה מוחלת כדי לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד תאיות בזמן אמת.

Abstract

NMR בתוך התא היא גישה ייחודית להתבונן בתכונות המבניות והדינמיות של מקרומולקולות ביולוגיות ברזולוציה אטומית ישירות בתאים חיים. ניתן לראות קיפול חלבונים, שינויים כימיים ושינויים קונפורמציה הנגרמים על ידי איגוד ליגנד. לכן, שיטה זו יש פוטנציאל גדול בהקשר של פיתוח תרופות. עם זאת, אורך החיים הקצר של תאים אנושיים המרותקים לספקטרומטר NMR מגביל את טווח היישום של NMR בתוך התא. כדי להתגבר על בעיה זו, ביו-ריאקטורים של NMR מועסקים שיכולים לשפר מאוד את יציבות מדגם התא לאורך זמן, וחשוב מכך, לאפשר הקלטה בזמן אמת של ספקטרום NMR בתוך התא. בדרך זו, האבולוציה של תהליכים כגון חדירת ליגנד וקשירה ליעד החלבון התאי ניתן לפקח בזמן אמת. Bioreactors מוגבלים לעתים קרובות על ידי הכדאיות התא נמוך במספרי תאים גבוהים, מה שמביא לפשרה בין הרגישות הכוללת של הניסוי לבין הכדאיות התא. לאחרונה דיווחנו על bioreactor NMR אשר שומר על מספר גבוה של תאים אנושיים פעיל מטבולית לתקופות ממושכות של זמן, עד 72 שעות. התקנה זו הוחלה כדי לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד ושינוי כימי חלבון. הצגנו גם זרימת עבודה לניתוח כמותי של נתוני NMR בזמן אמת, המבוססת על רזולוציית עקומה רב-משתנית. השיטה מספקת פרופילי ריכוז של המינים הכימיים הקיימים בתאים כפונקציה של זמן, אשר ניתן לנתח עוד יותר כדי לקבל פרמטרים קינטיים רלוונטיים. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הגדרת הביו-ריאקטור של NMR ויישומה לניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים.

Introduction

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית בתוך התא (NMR) התגלתה לאחרונה כגישה רבת עוצמה לחקור תכונות מבניות ודינמיות של מקרומולקולות בתוך הסביבה התאית1,2,3,3,4,5,6. NMR בתוך התא הצליח בחקירה של תהליכים רלוונטיים מבחינה תפקודית כגון קיפול חלבונים/זיהוי שגוי7,8,9, כריכת מתכת7,10, היווצרות קשר דיסולפידי11,12, וחלבון−אינטראקציה חלבון−חלבון13, אינטראקציה חלבון-ליגנד14,15,16, ואינטראקציה חומצה-ליגנד גרעין17 18 בתאים אנושיים חיים. אחד הגורמים המגבילים של יישומי NMR בתוך התא הוא אורך החיים הקצר של התאים במהלך הניסוי. הפתרון לבעיה זו כרוך בשימוש ביו-ראקטורים של NMR. במכשירים אלה, זרימה מתמדת של מדיום צמיחה מוחלת על התאים, אשר נשמרים מוגבלים בתוך ספקטרומטר NMR, על מנת לספק חמצן וחומרים מזינים ולהסיר תוצרי לוואי רעילים. בעקבות הופעתו של NMR בתוך התא, פותחו מספר עיצובים של ביו-ראקטורים של NMR כדי לשפר את הכדאיות של התא לפרקי זמן ארוכים יותר, שבהם חיידקים או תאי יונקים עטופים בהידרו-ג’ל19,20,20,21,22 או נשמרים בהשעיה ומונעים באמצעות שימוש בקרום מיקרודיאליזה23 . ביו-ריאקטורים כאלה אפשרו רכישה של ניסויי NMR ארוכים יותר עם יחס אות לרעש מוגבר (S/N)5, וחשוב מכך, ניתן להשתמש בהם כדי לחקור תהליכים סלולריים בזמן אמת22,23,24. הודות לרגישות הכימית והקונפורמציה הגבוהה של NMR, היישום האחרון יכול לספק תובנות יקרות ערך על הקינטיקה של תהליכים פונקציונליים בתוך תאים חיים ברזולוציה אטומית.

בפרוטוקול זה, אנו מראים כיצד להגדיר ולהפעיל bioreactor משופר לאחרונה דיווח25, אשר הושג על ידי שילוב עיצוב bioreactor מודולרי קיים23 עם הגישה המסתמכת על אנקפסולציה התא הידרוג’ל שהיו חלוצים על ידי קבוצות אחרות19,20,20,21,22,22,26,27 . אנו מתארים את היישום של הביו-ריאקטור למחקרי NMR בתוך התא בזמן אמת של ליגנד תאיים עם ליגנד בתאי HEK293T. ב bioreactor, תאים הם encapsulated בצפיפות גבוהה בחוטי ג’ל agarose והם נשמרים קיימא מאוד ופעיל מטבולית עד 72 שעות, שבמהלכו ניסויים NMR בזמן אמת בתא נרשמים. הביו-ריאקטור מורכב מצינור זכוכית שמתאים לבדיקות NMR סטנדרטיות בקוטר 5 מ”מ, האטום למים ומחובר למחזיק צינור, כך שלתא המדגם הפנימי יש קוטר פנימי של 4.2 מ”מ, גובה 38 מ”מ ונפח של 526 μL. הכניסה היא נימי PEEK באורך 7 מטר (o.d. = 1/32 אינץ’, כלומר = 0.5 מ”מ) המוחדר לתא המדגם עד ~ 6 מ”מ מלמטה, ואילו השקע הוא נימי PTFE באורך 7 מטר (O.d. = 1/32 אינץ’, כלומר = 0.5 מ”מ) המחובר בחלק העליון של מחזיק הצינור (איור 1). הצינורות מוכנסים באופן קואקסיאלי לקו מבוקר טמפרטורה המחובר לאמבטיית מים. הכניסה והשקע מחוברים באמצעות צינורות PEEK לשסתום דו-כיווני בעל 4 כיוונים המחובר למשאבת FPLC לשליטה בזרימה הבינונית ובמכל פסולת.

הביו-ריאקטור מוחל כדי לחקור את הקינטיקה של האינטראקציה, שדווחה בעבר14,25, בין שתי תרופות, פרצטזולמיד (AAZ) ומתאזולמיד (MZA), בתאים אנושיים עם האיזופורם השני של אנהידרז פחמתי אנושי (CA II), יעד רלוונטי מבחינה פרמקולוגית 28,29,30, ואת הקינטיקה של היווצרות הקשר הדיסולפידי תוך מולקולרי, מקודם על ידי המולקולה הקטנה ebselen25, 31, של הצורה נטולת הנחושת, אבץ קשורה של נחושת אנושית, אבץ סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD1), אנזים נוגד חמצון המעורב בהתפרצות של טרשת אמיוטרופית לרוחב7,8,32. לבסוף, ניתוח כמותי של נתוני NMR בזמן אמת מבוצע ב- MATLAB באמצעות אלגוריתם רזולוציית העקומה הרב-משתנית-חילופים -ריבועים לפחות מתחלפים (MCR-ALS) 33, שבאמצעותו הרכיבים הספקטרליים הטהורים ופרופילי הריכוז כפונקציה של זמן מתקבלים עבור המינים שנצפו, שניתן לנתח עוד יותר כדי לקבל פרמטרים קינטיים רלוונטיים.

הפרוטוקול מתחיל מבקבוק T75 של תאי HEK293T (~ 3 x 107 תאים לבקבוק) המבטא באופן חולף יתר על המידה CA II אנושי (ללא תווית) או SOD1 אנושי (15N שכותרתו). התאים גדלו ונשמרו בבקבוקונים T75 עם גלוקוז גבוה DMEM על ידי 1:10 קטעים כל 3-4 ימים ו transfected עם cDNA קידוד החלבון של עניין 48 שעות לפני הניסוי. השלבים המעורבים בשלב זה מדווחים בפירוט במקום אחר34.

Protocol

1. הגדרת ריאגנט ופתרון כדי להכין DMEM מלא, להוסיף 5 מ”ל L-גלוטמין 200 mM, 5 מ”ל פניצילין-סטרפטומיצין 100x, ו 50 מ”ל סרום בקר עוברי (FBS, 10% ריכוז סופי נפח / vol / vol) עד 440 מ”ל DMEM.הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (55 °F) במשך חודש אחד. הכן פתרון agarose על ידי המסת 150 מ”ג של אגרוז ג’ל נמוך ב 10 מ”ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ב 85 °C (85 °C) כדי לקבל פתרון 1.5% (w / v). לחטא על ידי סינון עם מסנן 0.22 מיקרומטר. הכן 1 מ”ל aliquots של פתרון agarose ב 1.5 מ”ל כתרים צינורות ולאחסן ב 4 °C (65 °F). הכן את המדיום הביו-ריאקטור. יש להמיס 13.4 גרם של אבקת DMEM ב-1 ליטר של H2O אולטרה-פורה.הערה: בהתאם ליישום, אמצעי האחסון הסופי הנדרש עשוי להיות שונה (למשל, עבור 500 מ”ל בינוני, להמיס 6.7 גרם של אבקה ב 500 מ”ל H2O). הוסף 2% FBS, 10 mM NaHCO3, 1x פניצילין-סטרפטומיצין (100x), ו 2% D2O (למשל, עבור 500 מ”ל בינוני, להוסיף 10 מ”ל של FBS, 0.4 גרם של NaHCO3, 5 מ”ל של פניצילין-סטרפטומיצין 100x, ו 10 מ”ל של D2O). מדוד את ה- pH באמצעות pH-meter ובמידת הצורך הסתגל ל- 7.4 על-ידי הוספת HCl.הערה: בדרך כלל, ה- pH ההתחלתי קרוב מאוד ל- 7.4. סננו את המדיום הביו-ריאקטור בעזרת מסנן סטרילי מונחה ואקום בבקבוק זכוכית סטרילי של 250 מ”ל או 500 מ”ל. במכסה המנוע של זרימת למינאר, לאטום את הבקבוק עם כיסוי ראש פלדה סטרילי עם שני חרירי צינור ולחבר אותם צינורות FEP (o.d. = 1/8 “, כלומר = 1.6 מ”מ) כי יהיה מחובר למשאבה ומסנן מזרק PTFE 0.22 מיקרומטר מיקרומטר לצריכת אוויר. 2. התקנת ביו-ריאקטור להרכיב את יחידת הזרימה באמצעות צינור NMR יחידת זרימה שנייה, אשר יוחלף מאוחר יותר עם אחד המכיל את התאים. עיין בהוראות ההפעלה של יחידת הזרימה עבור ההרכבה הנכונה.הערה: בשלב זה יש לנקות כבר את יחידת הזרימה (אם לא, בצע את שלב 4.2). הגדר את אמבט המים המחובר לבקרת הטמפרטורה של יחידת הזרימה ל-37 מעלות צלזיוס. מניחים את בקבוק המאגר באמבט המים. חבר את צינורות FEP של בקבוק המאגר למשאבה. סובב את שסתום הביו-ריאקטור כדי “לעקוף” ולמלא מראש את המשאבה עם בינוני. להפוך את שסתום bioreactor “זרימה” מראש ולמלא את bioreactor עם בינוני ב 0.1 מ”ל / דקה. 3. הכנת דגימת התא לאסוף את התאים מאינקובטור CO2 . קח בקבוק T75 של תאי HEK293T שהודבקו מהחממה CO2 ולהסיר את המדיום בילה. לשטוף את התאים פעמיים עם 7 מ”ל (כל אחד) של PBS בטמפרטורת החדר (~ 20 °C (60 °F). השתמש 2 מ”ל של טריפסין / EDTA כדי לנתק תאים. לאחר הוספת הפתרון, יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק את התאים.הערה: תאים שהודבקו עשויים להימשך מעט יותר זמן כדי להתנתק. במידת הצורך, לדגור על התאים ב 37 °C (50 °F). טריפסין מושבת עם 20 מ”ל של DMEM מלא; ביסודיות resuspend התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולהעביר אותם בצינור צנטריפוגה 50 מ”ל. צנטריפוגה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. לשטוף את התאים עם 10 מ”ל של PBS בטמפרטורת החדר כדי להסיר את המדיום שיורית. צנטריפוגה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. מעבירים את גלולה התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה כתרים של 1.5 מ”ל. הטמע תאים בחוטי אגרוז. להמיס aliquot אחד של agarose מוצק ב 85 °C (85 °F) באמבט מים ולאחר מכן לשמור אותו בתמיסה ב 37 °C (50 °F) בתנור בלוק. עם פיפטה פסטר, למלא את החלק התחתון של צינור יחידת הזרימה NMR עם 60-70 μL של 1.5% ג’ל agarose ולהניח אותו בקרח. פעולה זו תיצור תקע תחתון בגובה ~ 5 מ”מ המאפשר הצבת דגימת התא בתוך הנפח הפעיל של סליל NMR 1H. לחמם את גלולה של תאים המתקבלים בשלב 3.1.8 ב 37 °C (57 °F) עבור 15 −20 s בתרמובלוק. תאים resuspend ב 450 μL של פתרון agarose. היזהר כדי למנוע היווצרות של בועות. שאפו את ההשעיה של התא−agarose לתוך צינורות PEEK כרומטוגרפיים באורך ~30 ס”מ (כלומר = 0.75 מ”מ) המחוברים למזרק 1 מ”ל.הערה: לפני השאיפה, הצינורות והנפח המת של המזרק צריכים להיות מלאים מראש עם PBS בטמפרטורת החדר, כדי למנוע היווצרות של בועות. אורך הצינורות אינו קריטי. תן את הצינורות להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות. יש למלא מראש את צינור NMR של יחידת הזרימה ב-100 μL של PBS בטמפרטורת החדר. חוטים יצוקים של תאים המוטבעים באגרוז לתוך צינור NMR יחידת הזרימה על ידי דחיפה עדינה של המזרק.הערה: כדי למלא את צינור NMR בצורה הומוגנית, התחל על ידי הצבת הקצה של צינורות PEEK בתחתית צינור NMR ולהמשיך לכיוון החלק העליון תוך מתנדנד לאט שמאלה-ימינה. חזור על שלבים 3.2.5, 3.2.6 ו- 3.2.8 עד שכל ההשעיה של התא-נגרם תוטל. הכנס תאים לביוריאקטור הביולוגי. הסר את צינור NMR הריק מיחידת הזרימה ולהגדיל את קצב הזרימה ל 2 מ”ל / דקה במשך כמה דקות כדי להסיר בועות גז שיורית בצינורות הכניסה. הגדר את קצב הזרימה ל 0.2 מ”ל / דקה ולהכניס את צינור NMR המכיל את התאים על ידי דוחף אותו כלפי מעלה לאט אבל בהתמדה.הערה: הזרימה הפעילה של מדיום מונעת את הזרימה האחורית של תוכן הצינור דרך הכניסה, שאחרת הייתה מתרחשת במהלך ההוספה. 4. תפעול וניקוי ביו-ריאקטורים פעולת ביו-ריאקטור במהלך ניסוי NMR. הגדר את הטמפרטורה בספקטרומטר NMR ל 310 K. הכנס את יחידת הזרימה לספקטרומטר. ספק את מדיום הביו-ריאקטור בקצב זרימה של 0.1 מ”ל/דקה למשך כל תקופת ניסויי ה-NMR בתא. בזמן הרצוי במהלך הניסוי, להזריק פתרון מרוכז של מולקולה חיצונית לבקבוק המאגר הבינוני על ידי פירסינג צינורות סיליקון עם מזרק סטרילי ארוך מחט.הערה: הריכוז הסופי של מולקולה במדיום צריך להיבחר על סמך ידע קודם של רעילות תאים, ואם זמין, על קצב דיפוזיה חזוי / מוערך דרך קרום התא. בסוף הניסוי NMR, להחליף את הצינור המכיל את התאים עם צינור ריק לשטוף את יחידת הזרימה עם מים. ביו-ריאקטור נקי במקום. נקה את יחידת הזרימה על ידי הזרמת הפתרונות הבאים ב 1 מ”ל / דקה: 0.2 M נתרן הידרוקסיד (NaOH); 3 M חומצת לימון; 0.2 M NaOH, לפחות 30 דקות כל אחד, ואחריו מים אולטרה-פורה מסוננים סטריליים למשך >2 שעות. נקו וסובבו אוטומטית את בקבוק המאגר ואת הרכבת הצינורות לאחר כל ריצה. 5. ניסויי NMR התקנה של ניסויי NMR.הערה: בצע שלבים אלה מראש, לפני הכנת דגימת NMR בתוך התא, כדי למנוע עיכובים בין איסוף תאים לבין רכישת נתונים. צור ערכת נתונים חדשה בספקטרומטר NMR והגדר את הפרמטרים לניסויי NMR הרצויים. הגדר פרמטרים לניסויי NMR 1D 1H. מרכז את תדר נושאת ה-1H ב-4.7 עמודים לדקה באות המים. בחר את תוכנית הדופק zgesgp, הגדר את הרוחב הספקטרלי ל-20 עמודים לדקה, ופעימה מרובעת של 1,000-μs 180° רבועה לדיכוי מים. הגדר השהיית סריקה בין-סריקה של 1 שניות. לרכוש את הספקטרום עם 32 סריקות. עבור תאים המבטאים CA II ללא תווית: בחר את תוכנית הדופק p3919gp, הגדר את הרוחב הספקטרלי ל – 30 עמודים לדקה כדי לכסות את אזור האימונו של הספקטרום, והתאם את העיכוב לדיכוי מים בינומיים כך שהעירושר המרבי יתרכז בשינויים הכימיים של אותות העניין (d7 = 20 מיקרו ב- 950 MHz). הגדר השהיית סריקה בין-סריקה של ≥1 s. לרכוש עם 512 סריקות. עבור תאים המבטאים SOD1 עם תווית 15N: בחר את תוכנית הדופק sfhmqf3gpph, הגדר את הרוחב הספקטרלי של 1H ו- 15N ל- 16 ו- 50 עמודים לדקה, בהתאמה, את היסט הדופק בצורת ורוחב פס עירור ל- 8.5 ו – 6 עמודים לדקה, בהתאמה, ודופק של 350 μs עבור ערכת ניתוק (garp4 או אחר בהתאם למכשיר). הגדר השהיית סריקה בין-סריקה של 0.3 שניות. לרכוש עם 16 סריקות ו 128 מרווחים בממד 15N. רכישת ספקטרום NMR בזמן אמת. לאחר הביו-ריאקטור מוכנס לספקטרומטר NMR, המתן מספר דקות כדי לאפשר את חילופי המדיום.הערה: תהליך זה מנוטר בקלות מהמראה של אות הנעילה כאשר ה- PBS מוחלף במדיום המכיל 2% D2O. התאימו את ההתאמה והכוונון של ערוץ ה-1H, התאימו את המגנט וחשבו את אורך הדופק הקשיח של 1H 90°. התאם את רמות ההספק של 1H בכל רצף דופק בהתאם לדופק הקשיח של 1H. הקלט ספקטרום zgesgp 1H הראשון כדי לבדוק את התוכן לדוגמה ואת הומוגניות השדה. העתק את ניסויי zgesgp ו- p3919gp / sfhmqcf3gpph למספר הרצוי ועמד אותם בתור במנגנון ההדפסה ברקע של הרכישה.הערה: ספקטרום zgesgp משמשים רק כדי לשלוט על מצב המדגם ועל הומוגניות השדה; לכן, ניתן לדלג עליהם או להקליט אותם בתדירות נמוכה יותר. עבור תאים המבטאים CA II ללא תווית: לעבד את ספקטרום p3919gp על-ידי החלת אפס מילוי ופונקציית חלון הרחבת קו מעריכי (LB = 20 הרץ). עבור תאים המבטאים SOD1 בעל תווית 15N: עבוד את ספקטרום sfhmqcf3gpph על-ידי החלת אפס מילוי ופונקציית חלון פעמון סינוס בריבוע (SSB = 2) בשני הממדים.הערה: ניתן להקטין עוד יותר את גודל הספקטרום המעובד על-ידי הסרת אזורים ללא אותות (בטופספין, הדבר נעשה על-ידי הגדרת ערכי STSR ו- STSI הרצויים). 6. ניתוח MCR-ALS לניתוח ספקטרום CA II, לייבא אזורים ספקטרליים 1D ב MATLAB R2019b. בתוכנה, צור רשימה של ניסויים שיש לייצא בתפריט רשימת ערכות נתונים של תהליכים . באמצעות גירסה שונה של תוכנית au convbin2asc, לייצא את האזור הספקטרלי של עניין בתבנית ASCII עבור כל ספקטרום.הערה: פעולה זו יוצרת קובץ טקסט בשם ascii-spec.txt בכל ספריית משנה של ספקטרום. ב- MATLAB, יבא את האזורים הספקטרליים באמצעות קובץ ה- Script המותאם אישית Load_ascii_spectra.הערה: סקריפט זה דורש את ספריית ערכת הנתונים כקלט ומפיק ספקטרום מערך דו-ממדי המכיל את הספקטרום המוערם של 1D ו- cs מערך 1D המכיל את השינויים הכימיים. הפעל את סקריפט Load_acqus כדי לחלץ את חותמות הזמן מהספקטרום 1D.הערה: סקריפט זה מפיק מערך 1D times_hours המכיל את מרווח הזמן עבור כל ספקטרום המבוטא בשעות, עם הספקטרום ההתחלתי בזמן = 0. לניתוח ספקטרום SOD1, יש לייבא ספקטרום דו-ממדי ב- MATLAB R2020b. בטופספין, צור רשימה של ניסויים שיש לייצא בתפריט רשימת ערכות נתונים של תהליכים . ב- MATLAB, יבא את הספקטרום הדו-ממדי באמצעות Load_2D_spectra ה- Script המותאם אישית.הערה: סקריפט זה דורש את ספריית ערכת הנתונים כקלט ומפיק מערך תלת-ממדי ספקטרה המכיל את הספקטרום הדו-ממדי המוערם ואת מערך ה- Cs של מערך 1D המכיל את התנועות הכימיות. הפעל את סקריפט Load_acqus כדי לחלץ את חותמות הזמן מהספקטרום הדו-ממדי. ציין את האזורים הספקטרליים המעניינים בתסקריפט המותאם אישית Cut_2D_spectra והפעל את קובץ ה- Script כדי לחתוך מערכי משנה תלת-ממדיים [(עוצמות ספקטרליות של 1H x 15N) x time]; עצבו אותם מחדש כמערךים דו-ממדיים (נקודות זמן x עוצמות ספקטרליות) וצרפו אותם יחד.הערה: פעולה זו מפיקה מערך דו-ממדי JoinSpec_flat המכיל את האזורים הספקטרליים המעוצבים מחדש והמצורפים. הפעל את MCR-ALS 2.0 במצב GUI. פתח את MCR-ALS 2.0 GUI על-ידי הפעלת קובץ ה- Script של mcr_main. בכרטיסיה בחירת נתונים , טען את הספקטרום או את מטריצת JoinSpec_flat. ניתן להתוות את הנתונים לבדיקה. הערך את מספר הרכיבים על-ידי פירוק ערך יחיד (SVD) או באופן ידני.הערה: מספר הרכיבים צריך להתאים למספר המינים השונים הקיימים בניסוי. במקרה זה n = 2, המתאים לחלבון החופשי וכבול. בחר שיטה להערכה הראשונית של הספקטרום הטהור. ניתן להשתמש בזיהוי המשתנים הטהור ביותר או בניתוח גורמים מתפתחים (EFA). בחלון בחירת ערכת הנתונים , בחר המשך. הגדר את האילוצים עבור הריכוזים בחלון אילוצים: מצב שורה . החל אילוץ אי שליליות, בחר fnnls (מהר לא שלילי מוגבל-ריבועים פחות) כמו “יישום ו 2 מינים”. החל אילוץ סגירה אחד, הגדר את האילוץ ל- 1, תנאי הסגירה כ”שווה ל” והחל על כל המינים.הערה: זה מאלץ את הסכום של כל מינים ריכוזים להיות שווה ל 1, כך הפרופילים המתקבלים של כל מין מנורמלים ביחס לריכוז החלבון הכולל. הגדר את האילוצים עבור הספקטרום בחלון אילוצים: מצב עמודה . החל אילוץ אי שליליות, בחר fnnls כמו “יישום ו 2 מינים”.הערה: אין להחיל אילוץ זה אם קיימים אותות שליליים בספקטרום NMR. בחלון האחרון, הגדר 50 איטראציות וקריטריון התכנסות של 0.01. ציין את שמות הפלט עבור ריכוזים, ספקטרה וסטיית Std. לחץ על המשך כדי להפעיל את התאמת MCR-ALS.הערה: חלון גרפי יציג את התוצאה של התאמה עם התוויות של פרופילי הריכוז ואת הספקטרום של הרכיבים הטהורים. עבור ערכת הנתונים SOD1: השתמש Rebuild_2D_spectra script המותאמים אישית כדי לשחזר את האזורים הספקטרליים הדו-ממדיים מהפלט התלת-ממדי של MCR-ALS ולהתוות אותם. 7. מבחן כחול טריפאן לשחזר את התוכן צינור NMR עם pipet פסטר, ולהעביר את חוטי agarose לצינור כתרים 1.5 מ”ל. הסר את המדיום שיורית על ידי שטיפה של חוטי האגרוז עם 600 μL של PBS וצנטריפוגה אותם ב 4,000 x g במשך 1 דקה בטמפרטורת החדר. זרוק את הסופר-טבעי. הוסף 250 μL של PBS ו 50 μL של 0.4% פתרון כחול טריפאן. דגירה במשך 2 דקות עם צנרת רציפה. לשטוף פעמיים עם 600 μL של PBS להשליך את supernatant. מניחים כמה חוטי אגרווז על שקופית מיקרוסקופ וקוצצים אותם עם סכיני גילוח כדי ליצור פרוסות קטנות של ג’ל. בחר את הפרוסות הדקות ביותר (עובי < 0.4 מ"מ, באופן אידיאלי ~ 0.2 מ"מ) לניתוח. מעבירים את פרוסות הג’ל לתא ספירת תאים מתוצרת עצמית המורכב משתי שקופיות זכוכית במרווחים של שלוש שכבות של סרט פרפין (עובי כולל של כ-0.4 מ”מ) מכל צד.הערה: ניתן להשתמש גם בשקופית תא; עם זאת, פרוסות הג’ל עבות יותר מגובה התא (0.1 מ”מ) ייסחטו, יקרעו את התאים המוטבעים. לרכוש תמונות של תאים בתוך האגרוז ולספור תאים לבנים וכחולים. חשב את הכדאיות של התא כ (סה”כ תאים – תאים כחולים) / סה”כ תאים.

Representative Results

הפרוטוקול לעיל מאפשר אנקפסולציה של תאים בחוטים של הידרוג’ל כדי למקסם את הכדאיות של התא לתקופות זמן ארוכות, הכרחי כדי לחקור בזמן אמת תהליכים תאיים. בביוריאקטור, התאים נשמרים חיים ופעילים מטבולית עד 72 שעות, כפי שאושר בבדיקה הכחולה של טריפאן (איור 2a-c). באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לבחון חלבון תאי של עניין עובר כל שינויים קונפורמציה או כימיים. ביישום הראשון שתואר לעיל, הביו-ריאקטור מוחל לפקח בזמן אמת על האיגוד של שני מעכבים, AAZ ו- MZA, ל- CA II יתר על המידה בציטוסול של תאי HEK293T. ספקטרום פיסול עירור 1H הראשון (zgesgp) שנרשם משמש להערכת עוצמת האות הכוללת (שהיא פרופורציונלית למספר התאים), נוכחות של אותות מהחלבון המובע יתר על המידה וההומוגניות בשדה (איור 2d). במקרה של CA II, האיגוד התאי של שני מעכבי ניתן לפקח על ידי WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR ספקטרום (p3919gp), על ידי התבוננות אותות 1H באזור בין 11 ל 16 עמודים לדקה. אותות אלה נובעים מהתידינים המתאמים אבץ ושאריות ארומטיות אחרות של CA II36 ומוטרדים על מחייב ליגנד 14,15. ריכוזי ליגנד יכולים להיבחר על סמך שיעור הדיפוזיה או, אם זמין, מערכי חדירות שנקבעו בעבר14. כריכה מוצלחת מאושרת חזותית על ידי הופעת קבוצה נוספת של אותות באזור הספקטרלי של עניין, המחליף בהדרגה את האותות המקוריים (איור 3). עקומות כריכה תלויות זמן מתקבלות על ידי ניתוח MCR-ALS, המפריד בין שתי קבוצות האותות NMR הנובעות מ- CA II חופשי וכבול (איור 4a) ובו זמנית מספק את פרופילי הריכוז היחסיים של שני המינים (איור 4b). ביישום השני, הביו-ריאקטור מוחל כדי לפקח על היווצרות של קשר דיסולפידי SOD1 תוך מולקולרי הקשור לאבץ המקודם על ידי ebselen, חיקוי גלוטתיון פרוקסידאז, בתאים אנושיים. תהליך זה מנוטר על ידי התבוננות בשינויים בספקטרום 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 (המספק טביעת אצבע של קונפורמציה של עמוד השדרה של החלבון) הנגרמת על ידי הפרעות של מבנה החלבון המושרה על ידי היווצרות קשר דיסולפיד. אותות נוספים הנובעים מ- SOD1 מחומצן דיסולפיד מופיעים בספקטרום 1H-15N ומחליפים בהדרגה את אלה מ- SOD1 מופחת דיסולפיד. ניתוח MCR-ALS על אזורים נבחרים בספקטרום הדו-ממדי מפריד בין האותות הנובעים משני המינים (איור 5a) ומספק את פרופילי הריכוז היחסיים שלהם (איור 5b). עקומות הריכוז המתקבלות ניתן לנתח עוד יותר על ידי התאמה לא ליניארית כדי לספק מידע על הקינטיקה של התהליכים תחת מחקר25. איור 1: ערכת הביו-ריאקטור. משמאל: תצוגת חתך רוחב של יחידת הזרימה הריקה. מימין: ערכה של מערך הביו-ריאקטור. צינורות הכניסה PEEK מוצגים בירוק; צינורות שקע PTFE מוצגים בכחול. הלוח השמאלי משוחזר באישור Luchinat et al.25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: בדיקת טריפאן כחולה על תאים עטופים ובדיקת מדגם על ידי 1H NMR. פרוסות מייצגות של אגרווז המכילות תאים מוטבעים ומוכתמות בכחול טריפאן (א) מיד לאחר הליהוק ו-(ב) לאחר 72 שעות בביוריאקטור; (ג) כדאיות התא כפונקציה של זמן ביו-ריאקטור NMR תחת זרימה פעילה (שחור) ובתנאים סטטיים (אדום), נמדד על ידי מבחן כחול טריפאן. (ד) ספקטרום zgesgp 1H NMR נרשם על תאים מוטבעים אגרווז overexpressing CA II בהיעדר (שחור) ובנוכחות (אדום) של בועות גז bioreactor. במקרה האחרון, ירידה בהומוגניות השדה גורמת להרחבת הקו ולהופעתם של ממצאי דיכוי ממסים. תכונות ספקטרליות מעניינות מסומנות. לוחות (a-c) משוחזרים באישור Luchinat et al.25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: נתוני NMR מייצגים בזמן אמת בתא 1H המתקבלים על תאים עטופים באגרוז בביוריאקטור. חלקות מפל של ספקטרום 1D 1H NMR (אזור בין 15.6 ל 11.1 עמודים לדקה) של תאי HEK293T overexpressing CA II ולאחר מכן טופל עם (א) 25 מיקרומטר AAZ ו (ב) 10 מיקרומטר MZA, נרשם כפונקציה של זמן בביוריאקטור NMR. הזמן של טיפול ligand מוצג עם חץ. העוצמה הספקטרלית (a.u.) מקודדת בצבע מכחול (הנמוך ביותר) לצהוב (הגבוה ביותר). נתון זה משוחזר באישור של Luchinat et al.25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: פלט MCR-ALS מייצג מספקטרום NMR 1D. (א) ספקטרום NMR של 1H של הרכיבים הטהורים ששוחזרו על ידי MCR-ALS: CA II בהיעדר ליגנדים (שחורים) ובמתחם עם AAZ (אדום) או MZA (מגנטה); (ב) פרופילי ריכוז יחסיים של CA II חופשי (שחור) וכבול כפונקציה של זמן עם הוספת AAZ (אדום) או MZA (מגנטה) שהתקבלו על ידי MCR-ALS. הזמנים של טיפול ליגנד מסומנים בחצים. נתון זה משוחזר באישור של Luchinat et al.25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: תפוקת MCR-ALS מייצגת מספקטרום NMR דו-ממדי. (א) אזורים ספקטרליים של 1H-15N (המסומנים I-IV) של הרכיבים הטהורים ששוחזרו על ידי MCR-ALS: SOD1 מופחת דיסולפידים (שחור) ו-SOD1 מחומצן דיסולפידי (אדום); (ב) פרופיל ריכוז יחסי של הרכיבים הטהורים כפונקציה של זמן עם הוספת אבסלן (מסומן בחץ) שהושג על ידי MCR-ALS. נתון זה משוחזר באישור של Luchinat et al.25. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

המטרה של שימוש bioreactor לניסוי NMR בתוך התא היא לשמור על תאים בחיים ופעיל מטבולית במשך תקופה ממושכת של זמן. יש לקחת בחשבון מספר היבטים קריטיים כדי להשיג מטרה זו. ראשית, יש חשיבות עליונה להימנע מזיהום חיידקי בעת הכנת דגימת התא ובמהלך רכישת נתוני NMR. אם זנים של E. coli או חיידקים אחרים המשמשים בדרך כלל לשיבוט גנים וביטוי חלבון רקומביננטי משמשים במעבדה, הם עלולים לזהם את התאים במהלך הכנת מדגם. פעם אחת בביוריאקטור, החיידקים יגדלו במהירות תוך ניצול מדיום הצמיחה הטרי ויגרמו למוות של תאים עקב ייצור אנדוטוקסינים. זיהום חיידקי מזוהה רק בשלב מתקדם, כאשר הוא הופך את הצמיחה בינונית צהובה ועכורה. יתר על כן, ניקוי לא שלם של bioreactor עלול לגרום לזיהום של המשאבה או צינורות עם חיידקים, שמרים, או תבניות נפוצות.

דרישה להצלחת הניסוי היא הימנעות מהיווצרות בועת גז. בועות גז שנלכדו בין חוטי האגרוז בנפח הפעיל של סליל NMR יציגו אינומוגניות של שדה מגנטי גדול, ויגרמו לדיכוי חלקי של אות H2O ולאובדן חמור של איכות ספקטרלית (איור 2d). בועות עשויות להיגרם על ידי אוויר לכוד במערכת או על ידי היווצרות של CO2 גזי. הראשון ניתן להימנע בקלות על ידי שטיפה של המערכת עם בינוני לפני החדרת מדגם התא, בעוד כדי למנוע את האחרון מומלץ להפחית את הריכוז של NaHCO3 במדיום הצמיחה, ולשמור על כל חלקי המערכת בטמפרטורה קבועה כדי למזער את ההבדלים מסיסות CO2 . חילוף החומרים האירובי התאי עלול גם לגרום להיווצרות CO2 גזי, אשר ניתן למנוע על ידי הגדלת קצב הזרימה.

יש לבדוק את הכדאיות של התא לאחר כל הפעלה על-ידי מבחן טריפאן כחול. עם זאת, זה לא מספק תובנות על הפעילות המטבולית. כדי לקבל תמונה מלאה יותר של המצב המטבולי של התאים במהלך פעולת bioreactor, ספקטרום NMR 31P יכול להתבצע כדי להעריך את הייצור של ATP כפונקציה של זמן23,25. עם זאת, בדיקה ייעודית נחוצה לעתים קרובות עבור מדידה זו, אשר עשוי לאפשר הקלטה בו זמנית עם 1H NMR.

במקרה של CA II, נוכחות של אותות עיתונאיים שנפתרו היטב באזור יוצא דופן בספקטרום 1H מקלה על הניתוח מספקטרום NMR 1D פשוט ואינה דורשת העשרת איזוטופים במהלך ביטוי חלבון. באופן כללי, חלבונים אחרים יכולים להוליד אותות 1H שימושי לניטור שינויים ספקטרליים באזורים אחרים, כגון זה אופייני של הליבה ההידרופובית חלבון בין 0 ל -1 ppm11; עם זאת, אזורים אלה נוטים להיות צפופים עבור חלבונים מקופלים גדולים מ ~ 10 kDa. במקרה זה, כפי שמוצג עבור SOD1, עדיף להעשיר את החלבון עם 15N, על ידי מתן מדיום צמיחה מועשר באופן אחיד 15N במהלך ביטוי חלבון, וכדי לפקח על שינויים בזמן אמת בספקטרום 2D 1H-15N NMR. ספקטרום דו-ממדי מיובא כמערך דו-ממדי ב- MATLAB, מסודרים מחדש למערכי 1D ומוערמים לפני ניתוח MCR-ALS. הגישה השנייה חלה בדרך כלל על כל חלבון תאי שמוליד אותות הניתנים לזיהוי, ומספקת מידע על שינויים קונפורמציה בחלבון ברמת השאריות הבודדות. באופן עקרוני, הגישה השנייה יכולה להיות מוכללת לספקטרום nD ולתוכניות אחרות של תיוג איזוטופים.

לגבי היישום לסוגים שונים של תאים, הפרוטוקול צריך להיות מותאם בקלות לקווי תאים שונים ואינו דורש כי חלבון העניין בא לידי ביטוי ישירות בתאים. לכן, גישות אחרות NMR בתוך התא ניתן לשלב עם פרוטוקול זה, שבו macromolecule של עניין מיוצר רקומביננטי, או מסונתז, ולאחר מכן מוכנס לתאים על ידי אלקטרופורציה או על ידי שיטות משלוח אחרות1,9,38. בעת עבודה עם קווי תאים שונים או פרוטוקולי הכנת מדגם, פרמטרים כגון ריכוז האגרוז, עובי החוט, ואת צפיפות התא הסופית בחוטי agarose ייתכן שיהיה צורך לייעל אמפירית. יתר על כן, תחולתו של הפרוטוקול המתואר כאן מוגבלת לתאים הסובלים אנקפסולציה agarose. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש ניסוחים הידרוג’ל שונים, ואילו התקנה שונה מומלצת בעת ניתוח תאים הגדלים באופן טבעי בהשעיה, למשל, תוך שימוש בקרום מיקרודיאליזה קואקסיאלי כדי להבטיח דיפוזיה תזונתית תוך שמירה על תאים מושעים כלואים בצינור NMR23.

בהשוואה לתכנונים אחרים של NMR bioreactor19,20,21,22, המכשיר המתואר כאן מסתמך על יחידת זרימה זמינה מסחרית, המותאמת לשינויים קלים. לכן, המכשיר יכול להיות משוכפל בקלות במעבדות שונות עם רבייה גבוהה. יתר על כן, הוא מאפשר פעולה סטנדרטית ועמידה מלאה בתקנות בטיחות מעבדה קפדניות, במידת הצורך. בסך הכל, הגמישות וקלות הפעולה של הביו-ריאקטור אמורות לאפשר יישומים רבים אחרים של פתרון NMR, הן בתאים והן במבחנה, בנוסף לאלה כפי שכבר דווחו23,25. בסופו של דבר, אותו עיצוב ביו-ריאקטור יכול להיות מיושם על דגימות הדומות יותר לסביבה הפיזיולוגית של רקמה, כגון כדוריות או אורגנוידים, בתנאי שנמצאים פיגומים מתאימים לשמירה על דגימות כאלה בחיים – או אפילו לקיים את הצמיחה שלהם – בספקטרומטר NMR.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery, מספר מענק 871037, במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית, על ידי Instruct-ULTRA, מספר מענק 731005, פרויקט H2020 של האיחוד האירופי לפיתוח נוסף של השירותים של Instruct-ERIC, ועל ידי Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca PRIN גרנט 20177XJCHX. המחברים מכירים בתמיכתו של Instruct-ERIC, פרויקט ESFRI לנדמרק, באמצעות פרס JRA מספר 815 ושימוש במשאבים של מרכז CERM / CIRMMP איטליה. אנו מודים למתיאו פניסטרי (ברוקר, בריטניה) על מתן התמיכה בפעולת יחידת הזרימה InsightMR.

Materials

Materials
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
D2O Sigma-Aldrich 453366
DMEM, high glucose Life Technologies 10313-021
DMEM, high glucose, powder Sigma-Aldrich D5648
FBS Life Technologies 10270
HCl Sigma-Aldrich 30721
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030
Low-gelling agarose, powder Sigma-Aldrich A4018
NaHCO3, powder Carlo Erba 478537
PBS Life Technologies 10010
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
NaOH, pellets Sigma-Aldrich 30620
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) Sigma-Aldrich T8154 Hazard statement(s): H350 may cause cancer.
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) Life Technologies 25300-054
Equipment
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe Bruker n/a All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible.
InsightMR flow unit Bruker n/a
P-920 pump module from ÄKTA FPLC GE Healthcare n/a Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Inomata, K., et al. High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells. Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).
  2. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, 108-118 (2017).
  3. Dzatko, S., et al. Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).
  4. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation. Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).
  5. Tanaka, T., et al. High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).
  6. Siegal, G., Selenko, P. Cells, drugs and NMR. Journal of Magnetic Resonance. 306, 202-212 (1997).
  7. Banci, L., et al. Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR. Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).
  8. Luchinat, E., et al. In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants. Nature Communications. 5, 5502 (2014).
  9. Theillet, F. -. X., et al. Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells. Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).
  10. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1. Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).
  11. Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. Visualization of redox-controlled protein fold in living cells. Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).
  12. Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR. Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).
  13. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR. Scientific Reports. 5, 14456 (2015).
  14. Luchinat, E., et al. Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).
  15. Luchinat, E., et al. Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR. ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).
  16. DeMott, C. M., et al. Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening. ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).
  17. Krafcikova, M., et al. Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).
  18. Broft, P., et al. In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  19. Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. A bioreactor for in-cell protein NMR. Journal of magnetic resonance. 202 (2), 140-146 (2010).
  20. Kubo, S., et al. A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).
  21. Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells. Chemical Communications. 53 (81), 11245-11248 (2017).
  22. Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions. Biochemistry. 57 (5), 540-546 (2018).
  23. Cerofolini, L., et al. Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).
  24. Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR. Communications Biology. 3, (2020).
  25. Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution. Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).
  26. Koczula, K. M., et al. Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche. Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).
  27. Alshamleh, I., et al. Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).
  28. Supuran, C. T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators. Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).
  29. Neri, D., Supuran, C. T. Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).
  30. Alterio, V., Di Fiore, A., D’Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms. Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).
  31. Capper, M. J., et al. The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation. Nature Communications. 9 (1), 1693 (2018).
  32. Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  33. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  34. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).
  35. Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).
  36. Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).
  37. Schanda, P., Brutscher, B. Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds. Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).
  38. Ogino, S., et al. Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O. Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).

Tags

In-cell NMRProtein-ligand InteractionsHuman CellsBioreactorReal-time MonitoringProtein StructureProtein FunctionConformational ChangesChemical ChangesIsotope LabelingHEK 293T CellsAgarose ThreadsCell EmbeddingFlow UnitNMR TubeTemperature ControlCell ViabilityCell Metabolism

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor. J. Vis. Exp. (169), e62323, doi:10.3791/62323 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image