Activación 3D de todo el cerebro y mapeo de conectividad funcional en ratones utilizando imágenes de ultrasonido funcional transcraneal
Summary
Este protocolo describe la cuantificación de las variaciones hemodinámicas cerebrales volumétricas en el cerebro del ratón mediante ultrasonido funcional (fUS). Los procedimientos para el mapa de activación funcional 3D después de la estimulación sensorial, así como la conectividad funcional en estado de reposo se proporcionan como ejemplos ilustrativos, en ratones anestesiados y despiertos.
Abstract
La ecografía funcional (fUS) es una nueva modalidad de imagen cerebral que se basa en la medida de alta sensibilidad del volumen sanguíneo cerebral lograda por la angiografía doppler ultrarrápida. Como la perfusión cerebral está fuertemente vinculada a la actividad neuronal local, esta técnica permite el mapeo 3D de todo el cerebro de la activación regional inducida por tareas, así como la conectividad funcional en estado de reposo, de forma no invasiva, con una resolución espacio-temporal inigualable y simplicidad operativa. En comparación con la resonancia magnética funcional (fMRI), una de las principales ventajas de las imágenes fUS consiste en permitir una compatibilidad completa con los experimentos con animales despiertos y que se comportan. Además, el mapeo cerebral de fMRI en ratones, el modelo preclínico más utilizado en Neurociencia, sigue siendo técnicamente desafiante debido al pequeño tamaño del cerebro y la dificultad para mantener condiciones fisiológicas estables. Aquí presentamos un protocolo simple, confiable y robusto para imágenes de fUS de todo el cerebro en ratones anestesiados y despiertos utilizando un sistema fUS comercial listo para usar con un transductor lineal motorizado, que produce una activación cortical significativa después de la estimulación sensorial, así como un patrón de conectividad funcional 3D reproducible para la identificación de la red.
Introduction
En las últimas dos décadas, la neuroimagen se ha convertido en una herramienta importante para estudiar la función y la organización del cerebro, lo que permite a los investigadores hacer importantes descubrimientos en el campo de la neurociencia. Hoy en día, la resonancia magnética funcional (fMRI) se ha convertido en la técnica de neuroimagen clínica estándar de oro para evaluar la activación cerebral evocada por tareas o medicamentos y para mapear la conectividad funcional en reposo. Mientras que la resonancia magnética funcional humana tiene una alta confiabilidad y sensibilidad, la resonancia magnética funcional con ratones sigue siendo técnicamente desafiante por numerosas razones1. En primer lugar, la resonancia magnética funcional tiene una resolución espacial y temporal deficiente. El pequeño tamaño del cerebro del ratón requiere el uso de campos magnéticos fuertes utilizando escáneres costosos para lograr una resolución espacial razonable. En segundo lugar, mantener parámetros fisiológicos estables dentro del rango estrecho que permite un acoplamiento neurovascular eficiente es muy difícil en ratones anestesiados. Finalmente, la señal dependiente del nivel de oxígeno en la sangre (BOLD) en la que se basan los estudios de fMRI tiene una sensibilidad relativamente pobre, lo que lleva a una baja relación señal-ruido cuando se aplica a ratones y, a menudo, requiere una presentación de estímulo repetida durante una adquisición prolongada para detectar pequeñas variaciones. Siendo el ratón el modelo animal más utilizado en la investigación biomédica preclínica, estas limitaciones son en parte responsables de la brecha traslacional en la neuropsiquiatría, lo que dificulta la transposición de nuevas dianas terapéuticas prometedoras en el banco en tratamientos efectivos a pie de cama.
La ecografía funcional (fUS) es una técnica de neuroimagen desarrollada recientemente basada en doppler ultrarrápido2. Al muestrear directamente el volumen sanguíneo cerebral, esta técnica permite sondear la actividad cerebral en tiempo real a través del acoplamiento neurovascular. En comparación con otras técnicas de neuroimagen, fUS produce una resolución espacial de 100 μm y una resolución temporal en decenas de milisegundos. Esta técnica permite obtener imágenes de todo el cerebro de secciones coronales completas del cerebro del ratón, de forma completamente no invasiva. Además, es totalmente compatible con animales conscientes y de comportamiento3,4,5. Una de las principales limitaciones actuales de fUS es su característica 2D, que permite grabar un solo plano coronal al mismo tiempo. Si bien el fUS 3D volumétrico que utiliza transductores de matriz 2D ya se ha demostrado con éxito enratas 6 y se ha confirmado en ratones7,su falta actual de sensibilidad requiere una craneotomía completa, así como un promedio de un número importante de ensayos para detectar un ligero cambio de actividad. Alternativamente, los transductores lineales se pueden escalonar a través de múltiples posiciones y realizar imágenes funcionales plano por plano para cubrir todo el cerebro. Sin embargo, esta técnica requiere numerosas repeticiones de paradigmas experimentales y como tales largos tiempos de adquisición (3-4 horas para el cerebro delratón) 8,9.
En el presente trabajo, describimos una plataforma experimental robusta que incluye un ecógrafo funcional disponible comercialmente y un transductor lineal de conmutación rápida de plano con procedimientos para adquirir datos fUS 3D en ratones anestesiados y despiertos, lo que permite un mapeo funcional volumétrico y transcraneal del cerebro del ratón, de forma no invasiva, sin agente de contraste y en tiempos de adquisición cortos. Ilustramos esta característica mediante el mapeo de la activación de la corteza somatosensorial después de la estimulación del bigote, así como la conectividad funcional en estado de reposo. Además de la preparación animal y la recopilación de datos, también describimos el procedimiento para la visualización, el registro del atlas y el análisis de las señales fUS en tiempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos de imágenes cerebrales completas son herramientas cruciales para comprender mejor la fisiología y la patología del cerebro. El método descrito aquí permite la cuantificación precisa de las señales hemodinámicas en el cerebro vivo directamente en el banco. La sensibilidad inigualable y la resolución espacio-temporal del ultrasonido funcional son particularmente adecuadas para la fisiología del ratón. Las respuestas funcionales y las redes de estado de reposo se pueden mapear dentro de tiempos de adquisición cortos, longitudinalmente y sin tener que promediar ensayos o sujetos para obtener una medida confiable. La combinación relevante de sondas lineales ultrasónicas de alta sensibilidad y configuraciones motorizadas rápidas permite realizar imágenes volumétricas transcraneales de fUS en ratones dentro de tiempos de adquisición razonables. Este protocolo se puede realizar en ratones anestesiados o despiertos utilizando una jaula de casa móvil.
La estimulación del bigotes, el estímulo sensorial utilizado como ejemplo ilustrativo en este manuscrito, es un paradigma de activación funcional estándar en roedores y una lectura fiable para estudiar el procesamiento sensorial, el acoplamiento neurovascular y sus alteraciones5,6,10,11. Si bien el cepillado manual grueso de los bigotes puede ser preferido por su facilidad de uso, este método carece de precisión espacial y temporal. El uso de un estimulador automático, como el aquí descrito activado con el escáner de imágenes fUS, permite un mejor control de varios parámetros, incluido el momento de inicio, el desplazamiento de amplitud, la frecuencia y el ángulo de la punta Q / peine, lo que resulta en una mejor reproducibilidad inter-animal. Además, un momento más preciso de la estimulación permite el modelado de la Función de Respuesta Hemodinámica (FCR) mediante la determinación del tiempo hasta el inicio y el tiempo hasta el pico de los parámetros12,13. Para garantizar una mejor precisión en el número de bigotes desviados durante la estimulación (y por lo tanto en el área de la región activada), se pueden adaptar estimuladores más sofisticados a este protocolo. Muchos otros estímulos como la luz8,el sonido14 o la presentación del olor15 se pueden implementar utilizando el mismo protocolo.
La compatibilidad de la ecografía funcional con animales despiertos y de comportamiento es una ventaja importante en comparación con otras técnicas de neuroimagen, lo que permite el mapeo de activación funcional sin el sesgo de anestesia. El uso de una plataforma móvil con elevación neumétrica es una buena alternativa a otros aparatos fijos de cabeza existentes, como las cintas de correr lineales o esféricas. Mientras está firmemente fijo en la cabeza, el movimiento de la casa le da al ratón la ilusión de navegar por el entorno, lo que permite acoplar una amplia gama de pruebas de comportamiento a fUS imaging16. Sin embargo, el procedimiento de habituación a la fijación de la cabeza constituye un paso importante para disminuir el estrés, especialmente para experimentos donde puede considerarse un factor de confusión. El procedimiento detallado aquí (6 días de manipulación y habituación a la fijación de la cabeza) proporciona resultados sólidos para la estimulación sensorial y la conectividad funcional en estado de reposo. Sin embargo, podría ser necesario extender el período de habituación para pruebas de comportamiento más refinadas17.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Beca Avanzada N° 339244-FUSIMAGINE del Consejo Europeo de Investigación (ERC), la Agencia Nacional de Investigación que financia ‘Pinch’ (ANR-18-CE37-005), el Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, el núcleo técnico ElfUS del IPNP, Inserm U1266, el programa de investigación europeo FUSIMICE del Proyecto Cerebro Humano, y EMBO Short-Term Fellowship 8439 a Andrea Kliewer.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
