كامل الدماغ تنشيط 3D ورسم خرائط الاتصال الوظيفي في الفئران باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية وظيفية عبر الجمجمة
Summary
يصف هذا البروتوكول القياس الكمي للتغيرات الدموية الدماغية الحجمية في دماغ الماوس باستخدام الموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS). يتم توفير إجراءات خريطة التنشيط الوظيفي ثلاثي الأبعاد بعد التحفيز الحسي وكذلك الاتصال الوظيفي لحالة الراحة كأمثلة توضيحية ، في الفئران المخدرة والمستيقظة.
Abstract
التصوير بالموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS) هو طريقة جديدة لتصوير الدماغ تعتمد على مقياس الحساسية العالية لحجم الدم الدماغي الذي تحققه تصوير الأوعية دوبلر فائق السرعة. كما يرتبط بقوة تغلغل الدماغ إلى نشاط الخلايا العصبية المحلية, هذه التقنية تسمح لرسم الخرائط ثلاثية الأبعاد الدماغ كله من التنشيط الإقليمي الناجم عن المهمة، فضلا عن الراحة الدولة الاتصال الوظيفي, غير الغازية, مع دقة لا مثيل لها spatio الزمنية والبساطة التشغيلية. بالمقارنة مع التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي) ، تتمثل الميزة الرئيسية للتصوير بالفوس في تمكين التوافق الكامل مع التجارب الحيوانية المستيقظة والمتصرفة. وعلاوة على ذلك، لا يزال رسم خرائط الدماغ بالرنين المجهري في الفئران، وهو النموذج الأكثر استخداما قبل السريرية في علم الأعصاب، يشكل تحديا تقنيا بسبب صغر حجم الدماغ وصعوبة الحفاظ على ظروف فسيولوجية مستقرة. هنا نقدم بروتوكول بسيط وموثوق وقوي للتصوير بالحواس الخارجية للدماغ كله في الفئران المخدرة والمستيقظة باستخدام نظام fUS تجاري جاهز للاستخدام مع محول خطي مزود بمحرك ، مما يؤدي إلى تنشيط قشري كبير بعد التحفيز الحسي بالإضافة إلى نمط اتصال وظيفي ثلاثي الأبعاد قابل للاستنساخ لتحديد الشبكة.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، أصبح التصوير العصبي أداة مهمة لدراسة وظائف الدماغ وتنظيمه، مما مكن الباحثين من تحقيق اكتشافات مهمة في مجال علم الأعصاب. اليوم، أصبح التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI) تقنية التصوير العصبي السريري القياسية الذهبية لتقييم المهمة أو تنشيط الدماغ الذي يثيره الدواء وخريطة الاتصال الوظيفي في الراحة. في حين أن الإنسان fMRI لديه موثوقية عالية والحساسية، فأرة fMRI لا يزال تحديا من الناحية الفنية لأسباب عديدة1. أولا، إن دقة ال FMRI ضعيفة المكانية والزمنية. الحجم الصغير لدماغ الفأر يتطلب استخدام حقول مغناطيسية قوية باستخدام الماسحات الضوئية باهظة الثمن لتحقيق دقة مكانية معقولة. ثانيا، الحفاظ على المعلمات الفسيولوجية مستقرة ضمن النطاق الضيق السماح اقتران العصبي والأوعية الدموية كفاءة من الصعب جدا في الفئران تخدير. وأخيرا، فإن إشارة مستوى الأكسجين في الدم التي تعتمد عليها دراسات ال fMRI لديها حساسية ضعيفة نسبيا، مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند تطبيقها على الفئران وغالبا ما يتطلب عرض تحفيز متكرر على مدى فترة طويلة للكشف عن الاختلافات الصغيرة. الماوس كونه النموذج الحيواني الأكثر استخداما على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية قبل السريرية، وهذه القيود هي المسؤولة جزئيا عن الفجوة التحويلية في الطب النفسي العصبي، مما يعوق الأهداف العلاجية الواعدة الجديدة على مقاعد البدلاء ليتم نقلها إلى علاجات فعالة على السرير.
الموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS) هي تقنية تصوير عصبي تم تطويرها مؤخرا استنادا إلى دوبلرفائق السرعة 2. من خلال أخذ عينات مباشرة من حجم الدم الدماغي ، تسمح هذه التقنية بالتحقيق في نشاط الدماغ في الوقت الفعلي من خلال اقتران الأوعية الدموية العصبية. بالمقارنة مع تقنيات التصوير العصبي الأخرى، تنتج fUS دقة مكانية تبلغ 100 ميكرومتر ودقة زمنية بعشرات المللي ثانية. تسمح هذه التقنية بتصوير الدماغ بالكامل للأقسام التاجية الكاملة لدماغ الماوس ، بشكل غير جراحي تماما. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع الحيوانات واعية وتتصرف3،4،5. واحدة من القيود الحالية الرئيسية لfUS هو ميزة 2D، مما يسمح لتسجيل طائرة تاجية واحدة في نفس الوقت. في حين أن وحدة التخزين 3D fUS باستخدام محولات مصفوفة مصفوفة 2D قد ثبت بالفعل بنجاح في الفئران6 وأكد في الفئران7، وعدم الحساسية الحالية يتطلب استئصال الجمجمة الكامل ، فضلا عن متوسط عدد كبير من التجارب للكشف عن تغيير طفيف في النشاط. بدلا من ذلك، يمكن أن يخطو محولات الخطية عبر مواقف متعددة وأداء التصوير الوظيفي الطائرة بالطائرة لتغطية الدماغ كله. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية العديد من التكرار التجريبي للنموذج وعلى هذا النحو أوقات الاستحواذ الطويلة (3-4 ساعات لدماغ الماوس)8،9.
في العمل الحالي ، نصف منصة تجريبية قوية بما في ذلك ماسح ضوئي وظيفي متاح تجاريا بالموجات فوق الصوتية ومحول خطي سريع لتحويل الطائرة مع إجراءات للحصول على بيانات fUS ثلاثية الأبعاد في الفئران المخدرة والمستيقظة ، مما يسمح برسم خرائط وظيفية الحجمية وعبر الجمجمة لدماغ الماوس ، دون الغازية ، دون عامل تباين وخلال أوقات الاستحواذ القصيرة. نوضح هذه الميزة من خلال رسم خرائط تنشيط القشرة الحسية سوماتوسوري بعد تحفيز شعيرات فضلا عن الراحة الدولة الاتصال الوظيفي. وبصرف النظر عن إعداد الحيوانات وجمع البيانات، ونحن أيضا وصف إجراءات التصور، وتسجيل أطلس وتحليل إشارات fUS في الوقت الحقيقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طرق تصوير الدماغ كله هي أدوات حاسمة لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء في الدماغ وعلم الأمراض. الطريقة الموصوفة هنا تسمح بالتحديد الكمي الدقيق للإشارات الديناميكية الدموية في الدماغ الحي مباشرة على مقاعد البدلاء. الحساسية التي لا تضاهى والقرار spatio الزمنية من الموجات فوق الصوتية وظيفية مناسبة بشكل خاص لعلم وظائف الأعضاء الماوس. ويمكن رسم خرائط للاستجابات الوظيفية وشبكات الراحة في غضون فترات اكتساب قصيرة، طوليا ودون الحاجة إلى متوسط التجارب أو المواضيع للحصول على مقياس موثوق به. مزيج ذات الصلة من مسابير خطية بالموجات فوق الصوتية عالية الحساسية والاجهزة الآلية السريعة تمكن المرء من أداء التصوير عبر الجمجمة الحجمي fUS في الفئران في غضون أوقات اكتساب معقولة. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول إما على الفئران المخدرة أو المستيقظة باستخدام قفص منزلي متنقل.
تحفيز شعيرات، التحفيز الحسية المستخدمة كمثال توضيحي في هذه المخطوطة، هو نموذج تنشيط وظيفي قياسي في القوارض وقراءة موثوق بهالدراسةالمعالجة الحسية، اقتران الأوعية الدموية العصبية وتعديلاتها 5،6،10،11. في حين أن الفرشاة اليدوية الخشنة للشعيرات قد تكون مفضلة لسهولة استخدامها ، فإن هذه الطريقة تفتقر إلى الدقة المكانية والزمنية. استخدام محفز تلقائي، مثل واحد وصفها هنا أثار مع الماسح الضوئي التصوير fUS، يسمح للسيطرة بشكل أفضل على العديد من المعلمات بما في ذلك وقت البدء، وتشريد السعة، والتردد، فضلا عن زاوية Q-تلميح / مشط، مما أدى إلى استنساخ أفضل بين الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، توقيت أكثر دقة من التحفيز تمكن النمذجة من وظيفة الاستجابة الهمودية (HRF) من خلال تحديد الوقت لبداية والوقت إلى المعلمات الذروة12،13. لضمان دقة أفضل في عدد الشعيرات المنحرفة أثناء التحفيز (وبالتالي منطقة المنطقة المنشطة) ، يمكن تكييف المحفزات الأكثر تطورا مع هذا البروتوكول. يمكن تنفيذ العديد من المحفزات الأخرى مثل الضوء8، الصوت14 أو عرضالرائحة 15 باستخدام نفس البروتوكول.
التوافق بين الموجات فوق الصوتية وظيفية مع الحيوانات مستيقظا ويتصرف ميزة هامة بالمقارنة مع تقنيات التصوير العصبي الأخرى، وتمكين رسم الخرائط التنشيط وظيفية دون التحيز التخدير. استخدام المنزل المحمول رفع الهواء هو بديل جيد لغيرها من الأجهزة القائمة رئيس ثابتة مثل المطاحن الخطية أو كروية. في حين يجري بحزم رئيس ثابتة، وحركة homecage يعطي الماوس الوهم للتنقل في البيئة، مما يسمح لمجموعة واسعة من الاختبارات السلوكية أن يقترن التصوير fUS16. ومع ذلك ، فإن إجراء التعود على تحديد الرأس يشكل خطوة مهمة لتقليل الإجهاد ، خاصة بالنسبة للتجارب التي يمكن اعتبارها عاملا محيرا. الإجراء المفصل هنا (6 أيام من المناولة والتعود على تثبيت الرأس) يعطي نتائج قوية للتحفيز الحسي والاتصال الوظيفي يستريح الدولة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري تمديد فترة التعود على الاختبارات السلوكية أكثردقة 17.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) منحة متقدمة N ° 339244-FUSIMAGINE، الوكالة الوطنية للبحوث تمويل ‘قرصة’ (ANR-18-CE37-005)، ومسرع تكنولوجيا البحوث Inserm في الموجات فوق الصوتية الطبية الحيوية، والنواة التقنية ElfUS من IPNP، Inserm U1266، وبرنامج البحوث الأوروبية FUSIMICE من مشروع الدماغ البشري، وEMO زمالة قصيرة الأجل 8439 لأندريا Kliewer.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
