ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集

1. チップの準備とロード 注:このプロセスは、タンパク質結晶が乾燥するのを防ぐために、湿度制御環境(図1)内で行われます(図1)は、通常、80%から90%以上の相対湿度の間で行われます。一度装填して密封すると、結晶は24時間以上生き残ることができます。しかし、これは結晶系によって大きく異なる場合がある。チャンバー内には、シリコンチップ(図1)、シリコンチップ、ポリエステル箔付きチップホルダー(図2)、p200ピペット、200μLピペットチップ、ピンセット、フィルターペーパー、タンパク質結晶スラリーを保持するローパワー真空ポンプが必要です。 チップホルダーを準備します。 ポリエステル箔を2枚、約6cm×6cmの正方形に切ります。 2つのベースプレート(大小)の上にポリエステルシートを置きます。 金属シールリングを使用して、ポリエステルシートを所定の位置に固定します。 余分なポリエステル箔を慎重に引っ張って折り目を取り除き、後でサンプルを視覚化し、センタリングしやすくします。 結晶のサイズに対して適切なサイズの開口部(7~30 μm)を持つシリコンチップを選択します。 グローは0.39 mBarで25秒間チップを排出し、15 mAの電流を使用してチップ上にマイクロクリスタルを容易に広げます。 上げられた棒が下を向いているピンセットを使用して、チップローディングステージにシリコンチップを置きます。 マイクロクリスタルスラリーの200 μLをピペットを使用してチップの平らな側に塗布します。 チップのすべての「都市ブロック」をカバーするためにクリスタルスラリーを広げます。 チップが破損している場合は、ポリエステルホイルまたはフィルターピペットチップの小さな部分で穴を覆い、真空を均一に適用できるようにします。 余分な液体がチップを通して吸い込まれるまで、穏やかな真空を適用します。 チップローディングステージからピンセットでチップを取り外します。 余分な液体を取り除くために、フィルターペーパーでチップの下側を慎重にブロットします。 チップホルダーの大きな半分に、チップホルダーの大きな半分に、取り付けたチップを、ガイドマークの平らな側面の間に置きます。 チップホルダーの小さい半分を上に置いてチップを密封します。 チップホルダーの2つの半分が所定の位置にスナップします。後半がフラッシュに座っていない場合は、ホルダーを180°回転して磁石を適切に位置合わせします。 チップホルダーを六六本ボルトで閉じて、チップをしっかりと固定します。注:または「チップレス」チップは、チップホルダー 37のポリエステル箔の2つの層の間に挟まれた結晶スラリー(〜15 μL)の小さなボリュームで、同様の方法でロードすることができ、またはより小さなボリュームは、以前に説明したようにポリエステル箔に直接適用される50μmの厚さの両面接着スペーサーを使用してロードすることができます38.接着スペーサーを使用すると、チップレスチップに複数のサンプル(またはリガンド浸漬などのサンプルの変異体)を積み込むことも可能です。アコースティックドロップ放出(ADE)を利用してシリコンチップをロードする相補的なローディングアプローチも、Diamond39で使用できます。ADEはピペットの負荷より小さい量の水晶スラリーを使用してチップをロードすることを可能にする。スラリーの化学組成と粘度を考慮する必要がありますが、サンプルが不足している場合は特に有用な技術です。 2. ビームラインでのGUIとセットアップ シンプルな EPICS ディスプレイ マネージャ (edm) グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) を使用して、データ収集のすべてのチップアライメントとセットアップを実行します (図 3a)。これにより、ビームライン計測に対するポイント アンド クリック インターフェイスが提供され、Python ベースのデータコレクションの入力パラメータが提供されます。サブウィンドウは、サンプルホルダのサブ領域(図3b)またはレーザー/LEDポンププローブ実験(図3c)から収集するための追加制御を提供します。 3. チップの位置合わせ キネマティックマウントを使用して、ロードしたチップをビームライン( 図4aに示す)のXYZステージに配置します。 進行方向に沿ってステージを引っ張らないように注意してください。運動台の磁石は非常に強いので、これは偶然に非常に簡単に行うことができます。 マウントに近づくと、チップホルダーはわずかな角度(±30°)で保持する必要があります。磁石が接触すると、チップホルダーが床(0°)に平行に回転し、チップホルダーが所定の位置をクリックします(図4b)。 チップをアンロードする場合は、逆パスに従ってください。チップホルダーを引き離す前に、チップをステージから離して回転させ、角度を付けます。 ビームラインのオン軸表示システムとチップアライメントGUIを使用して、チップの左上の受託者を見つけます。受託者は3つの正方形で、2つの小さな正方形と1つの大きさで、互いに直角に(図5a)です。チップは後ろに照らされているので、チップは白い正方形として開口部で暗く見えます。 X、Y、および Z の受託者ゼロを中心にします (図 5b)。X と Y をそれぞれ左右に動かして、上下に合わせます。チップをフォーカスの外に移動して Z を揃えます。 [受託者ゼロを設定]をクリックします。 受託者1(右上、 図5c)と受託者2(左下、 図5d)に対してステップ3.2を繰り返して、すべての受託者をX線ビームに揃えます。 「共進システム を作る」を押してコーディネート行列を生成し、これはチップのオフセット、ピッチ、ロール、ヨーを計算し、チップの後続の動きをすべてチップコーディネートフレームで行えるようにします。 [ ブロック チェック ]をクリックして、各都市ブロックの最初のウェルに XYZ ステージを移動し、チップが適切に位置合わせされていることを視覚的に確認します。 X線のクロスヘアがアパーチャーと並ぶ場合、チップは整列されます。ない場合は、手順 3.2 ~ 3.3 を繰り返します。注: (壊れた受託者) の位置合わせが困難な場合は、チップ上の異なる絞りを使用して「アライメントタイプ」プルダウンメニューを使用できます。固定ターゲットデータ収集には、さまざまな種類のチップを使用できます。チップタイプの「チップタイプ」プルダウンメニューを使用して、異なるチップタイプに対応しています。I24で使用される最も一般的なチップタイプは「オックスフォード」と「カスタム」チップです。チップ上の絞りと受託者の数と間隔は、プルダウンメニュー を介して 定義されたチップディクショナリから読み取られます。カスタムチップは、開口部の間隔をオンザフライで定義することを可能にし、これは薄膜シートオンシートまたは結晶がホルダー37を横切ってランダムに配置される他の「チップレス」タイプのチップに特に有用である。新しい Python GUI は、移動オンクリック機能と自動チップアライメントを提供していますが、この原稿の執筆時点での日常的な使用の準備はまだ整っていません。 4. データ収集の設定 注: データ収集の設定は、調査対象のシステムと実行する実験によって異なります。これは、最も単純なSSX実験から低線量構造の収集、レーザーまたは迅速な混合を使用した時間分解実験まで、異なる時間遅延で複数の完全なデータセットを必要とする反応を開始する。データコレクションを設定するには、次のパラメータを定義する必要があります。 実験変数: フォルダー、ファイル名、露光時間、送信時間、検出器の距離、および開口部ごとのショット数を必要に応じて入力します。 チップタイプ:前述のように、チップタイプを使用中のチップに一致させます。 薄膜またはチップレスチップを使用している場合は、チップタイプを Noneに設定します。 GUI の x と y の両方でステップ数とステップサイズを定義します。 マップの種類を設定する: これにより、データ収集用にチップのサブセクションを選択できます (図 3b)。「なし」は、チップ上のすべての絞りからデータが収集されるということを意味します。「Lite」は、チップ上の選択された都市ブロックからデータが収集されていることを意味します(図3b)。これは、たとえば、チップの領域が不適切にロードされているか、空であることがわかっている場合に役立ちます。「完全」では、個々の絞りをデータ収集に選択できます。この場合、正しいフォーマットのテキスト ファイルを指定する必要があります。詳細とテンプレートは、ビームラインスタッフから入手できます。 ポンププローブ: ポンププローブ実験の種類と希望の時間遅延を選択します。ポンプのトリガー(通常はLEDまたはレーザー)は、特定の実験に特異的であることが多いので、ここでは詳細には説明しません。 「短い」遅延は、ポンプとプローブの間の各開口部に位取りがある場合の実験を指します(すなわち、ポンプ、プローブ、次のサンプルに移動します)。遅延は通常、1 秒または数十ミリ秒の順序で行います。 長い遅延は、開口が2回訪問される励起と訪問(EAVA)戦略を指し、訪問の間に定義された時間遅延(すなわち、ポンプ、移動、ポンプ、移動、プローブ、プローブなど)。時間遅延は、X線露光時間(図3c)と計算され、通常は〜1秒以上である。 5. 一般的なデータ収集方法 注: 実行する実験の種類を定義する主要なパラメーターを次に示します。このセクションでは、プロトコル 3 の「データ収集の設定」の他の設定が定義されていることを前提としています。 シナリオ 1: 低用量データ収集。サンプルホルダー上の選択された各絞りから単一回折像のコレクション。 開口あたりのショット数を 1 に設定します。 ポンププローブを Noneに設定します。 シナリオ 2: 用量シリーズは、サンプルホルダー上の選択された各絞りから順次 n 枚の画像を収集する。チップは各絞りで静止し 、n 個の画像の各セットが収集されます。 1 回の開口あたりのショット数を’n’に設定します。 n=5、10、20、または別の倍数が 10 の場合、処理は単純化されることに注意してください。nが5を<場合、トレンドを確立することは困難です。チップをカバーするのに必要な合計時間と 、n が増えたときに生成されるイメージ ファイルの数を考慮すると便利です。 ポンププローブを Noneに設定します。 シナリオ 3: ポンププローブ法 ポンププローブプルダウンメニューから方法を選択して、レーザー励起コントロールセンターを開きます。 ポンププローブ実験の場合は、 各絞りオプションでレーザードウェルを 充填します。 EAVA の場合は、各絞りとX 線露光でレーザードウェルを埋め、[計算] をクリックします。 必要な遅延時間に対して、edm GUI ポンプ プローブドロップダウンメニューで適切な 繰り返 しオプションを選択します。 実験がプリ照明ステップを必要とする場合 は、レーザー2ドウェル セクションに記入します。 すべての実験変数が定義された後 、Set パラメータを押して短いリストを作成します。これにより、実験変数がジオブリック コントローラに読み込まれます。これが完了した後 、Start を押すと、検出器が移動し、バックライトが消え、データ収集が開始されます。データ収集を設定する際に、各手順の状態と結果に関するフィードバックを印刷するターミナル ウィンドウを開くと便利です。 6. データ処理 注: 大まかに言えば、データ処理は、フィードバックが必要な緊急度に基づいて3つのグループに分けられます。結晶が存在するかどうか、そして拡散している場合は、どのような数字であるかを示すために、迅速なフィードバックが必要です。これは、データ収集に追い付く必要があります。データのインデックス作成と統合を実行するが、データ収集と同等の時間スケールで実行する必要があります。反射強度を構造解析用の mtz ファイルにマージしてスケーリングし、電子密度マップの生成は最終ステップを表し、まだ遅くなる可能性があります。ここでは、最初の2段階のI24でパイプラインを開始する場合、実験を導くためにリアルタイムのフィードバックが必要であるため、ヒット率やスケーリング統計などの指標は電子密度の検査に代わるものではありません。 クリスタルロで. 迅速なフィードバック データ処理モジュールをロードするには 、モジュールタイプ i24-ssx を任意のビームラインワークステーションの端末にロードします。 ヒット検索分析を実行するには 、端末に i24-ssx /path/to/visit/directory/ と入力します。注 : このウィンドウは 3 つのターミナル ウィンドウを開き、データがディスクに書き込まれると、高度な光源向けの回折統合 (DIALS) 40、41(図 6a) のスポット検索結果をグラフィカルに表示します。 デフォルト設定では、10番目 の画像ごとにスコアを付け、数秒ごとに更新して、計算負荷を最小限に抑えます。 上記のコマンドの最後に引数を追加して、デフォルトを変更します。たとえば、’i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2′ i24-ssxは、他のすべてのイメージでヒット検索を実行します。ただし、これによりクラスター (共有リソース! ) に過度の負担がかかり、処理時間が遅くなる可能性があります。グラフはインデックス化が成功する可能性に基づいて色分けされ、赤は少なくとも15のブラッグスポットが見つかり(インデックス化の可能性が高い)、青色はほとんどまたは有用な回折を示さないことを示す。 スポットファインダーインターフェイス上のスポットをクリックして、DIALS画像ビューアで興味のある回折画像を表示します。 インデックス作成と統合フィードバック注 : dials.still_process機能40,41を使用して、回折データのインデックス作成と統合は DIALS を使用して実行されます。そのため、結晶に関する特定の情報(期待される結晶空間グループ、ユニットセル、実験ジオメトリ)を.philテキストファイルに入れる必要があります。 端末に モジュールロードダイヤルを入力して、ダイヤルモジュールをロード します。 データセットの種類dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil.すべての処理データセットの進捗状況は、stills_monitorスクリプトを実行してmonitor_stills_process.pyと入力して監視できます (モジュールロード i24-ssxを実行し、ディレクトリを現在の訪問に変更した後) (図 6b)。 インデックス付き回折データの単位セル分布(図7a)は、 コマンドctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/パス/ダイヤル/出力/*refined.expt combine_all_input=true これは、以前に説明した42のようにユニットセル多形を識別し、解決するのに特に有用である。 ‘Visualzie’ この分布が、/訪問/処理/_hit_finding/chip.outコマンド python pacman.py を使用して 2D プロット (図 7b) を生成することによって、固定ターゲット全体で変化する場合、 dialS コマンドdials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /パス/ダイヤル/出力/*refined.exptを使用して、すべてのインデックス付き回折データの立体投影を生成します (図 7c)。注: ブラヴァイス格子の対称性が完全な双対として表示される空間グループ対称性よりも高い結晶からの静止データを処理する場合、それは一般的な病理です。データ処理アルゴリズムは、この病理43、44、45、46を解決するために進化しましたが、ユーザーはデータを処理しながらこれを念頭に置くべきです。