JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
français

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond

Published: February 26, 2021
doi:
10.3791/62200
, , , , , , , , ,
1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences,University of Essex, 3X-ray Science Division,Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences,University of Southampton

Summary

Nous présentons un guide complet sur la préparation des échantillons à cible fixe, la collecte de données et le traitement des données pour la cristallographie synchrotron en série à la ligne de faisceau Diamond I24.

Abstract

La collecte de données en série est une technique relativement nouvelle pour les utilisateurs de synchrotrons. Un manuel d’utilisation pour la collecte de données sur cible fixe chez I24, Diamond Light Source est présenté avec des instructions détaillées étape par étape, des chiffres et des vidéos pour une collecte de données en douceur.

Introduction

La cristallographie synchrotron série (SSX) est une méthode émergente de collecte de données qui a été inspirée par les lasers à électrons libres à rayons X (XFEL)1,2,3. Lors d’un XFEL, un seul motif de diffraction est enregistré à partir d’un cristal de protéine généralement très petit, avant que le cristal ne soit détruit par l’impulsion de rayons X extrêmement brillante. Cela signifie, typiquement, qu’un nouveau cristal doit être introduit dans le faisceau de rayons X pour obtenir un autre motif de diffraction4. Ce besoin de reconstituer continuellement les cristaux a conduit au développement de nombreuses techniques de livraison d’échantillons en série5.

Aux synchrotrons, les méthodes classiques (non sérielles) de cristallographie par rotation sont largement appliquées, exploitant un seul grand cristal qui est tourné dans un faisceau de rayons X à l’aide d’un goniomètre pour collecter un ensemble de données complet pour la solution de structure6. Afin d’augmenter la durée de vie des cristaux afin qu’un ensemble de données complet puisse être collecté7,8, et aussi pour faciliter l’expédition et le transfert automatisé des échantillons, les cristaux sont cryorefroidis à ~ 100 K pour la collecte de données. À des lignes de faisceau microfocus intenses, des stratégies multicristallines sont fréquemment utilisées car les dommages causés par le rayonnement peuvent empêcher la collecte d’un ensemble de données complet à partird’unseul cristal9,10,11. Malgré les limites imposées par les dommages causés par les radiations, le nombre de cristaux utilisés reste relativement modeste et l’approche utilisée est essentiellement identique à l’expérience monocristalline.

SSX, d’autre part, utilise la livraison d’échantillons en série pour obtenir des modèles de diffraction fixes uniques à partir de milliers de cristaux orientés aléatoirement afin de générer un ensemble de données complet. Il est à noter que les techniques en série incorporant la rotation des cristaux sont en cours de développement12,13 bien que nous nous concentrions sur des approches à rotation fixe et nulle. Il existe une grande variété de systèmes de distribution d’échantillons avec différents avantages et inconvénients14, allant de la livraison d’un flux de cristaux dans un jet concentré / visqueux15,16,17, puce microfluidique18,19, ou des cristaux sur une cible fixe telle qu’une puce de silicium gravée20,21 . Typiquement, les cristaux sont maintenus à température ambiante, ce qui permet d’observer une plus grande diversité conformationnelle et fournit un environnement physiologiquement plus pertinent22. SSX permet la collecte d’ensembles de données à très faible dose23, car la dose totale de l’ensemble de données équivaut à une seule courte exposition aux rayons X d’un cristal. Un autre avantage majeur fourni par SSX est l’étude de la dynamique des protéines par des méthodes résolues dans le temps, avec des réactions déclenchées parl’expositionà la lumière laser24,25, 26,27ou par le mélange de cristaux et de ligand / substrat28,29. L’utilisation de cristaux plus petits signifie que la lumière laser peut pénétrer dans l’ensemble du cristal, initiant uniformément la réaction sans absorption multiphotonique pour fournir des intermédiaires de réaction bien définis pour les données de diffraction prises à différents points temporels27. L’utilisation de cristaux plus gros et de méthodes de collecte de données basées sur la rotation souffre d’une profondeur de pénétration laser limitée, d’une activation non uniforme ou multiphotonique, de dommages causés par le rayonnement et d’un temps de surcharge mécanique dans les balayages de données, ce qui entraîne un mélange d’intermédiaires de réaction qui peuvent s’avérer difficiles ou impossibles à interpréter à des vitesses de réaction plus rapides. Les cristaux plus petits offrent un avantage similaire dans les expériences de mélange, car les ligands peuvent diffuser rapidement et plus uniformément dans tout le cristal, permettant à nouveau d’enregistrer des intermédiaires de réaction définis à différents délais30,31,32.

Sur la ligne de faisceau microfocus I24 de Diamond, des expériences de rotation conventionnelle et SSX peuvent être effectuées. Ici, un protocole complet pour la préparation et la collecte d’échantillons SSX à l’aide de cibles fixes à I24 et de protocoles pour l’analyse de données en série chez Diamond sont présentés. Bien que le manuscrit et les vidéos qui l’accompagnent devraient permettre aux utilisateurs de mener à bien une expérience SSX à I24, il convient de noter qu’il s’agit d’un domaine en développement rapide et que les approches évoluent continuellement. Il convient également de noter que des méthodes série sont disponibles dans d’autres sources synchrotron, y compris, mais sans s’y limiter, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI et PXII)34et NSLS (FMX)35. Bien que les spécificités de la collecte et du traitement des données en série diffèrent d’une source à l’autre, les principes fondamentaux resteront les mêmes. Les protocoles ci-dessous doivent être considérés comme représentant un point de départ et une voie d’accès au camp de base plutôt que le sommet de ce qui pourrait être réalisé.

Ce protocole suppose que les utilisateurs ont un système de protéines ou de petites molécules cristallines, à partir duquel une boue de microcristaux de l’ordre de 0,5-2,0 mL avec une bonne densité de microcristaux par mL a été produite. Les protocoles d’obtention des boues cristallines ont été décrits précédemment 36. De nombreux types de cibles fixes sont disponibles, les plus couramment utilisés chez I24 utilisent une puce de silicium définie avec précision. Afin de se différencier des autres configurations de puces, ci-dessous et dans l’interface de ligne de faisceau, on parle de « puce Oxford ». Comme décrit précédemment, la disposition de la puce Oxford comprend 8×8 « pâtés de maisons », chacun contenant 20×20 ouvertures pour un total de 25 600 ouvertures20,21.

Protocol

1. Préparation et chargement d’une puce REMARQUE: Le processus se produit dans un environnement à humidité contrôlée (Figure 1), généralement entre 80% et 90% ou plus d’humidité relative, pour empêcher les cristaux de protéines de se dessécher. Une fois chargés et scellés, les cristaux peuvent survivre jusqu’à 24 heures. Cependant, cela peut varier considérablement d’un système cristallin à l’autre. À l’intérieur de la chambre, une pompe à vide de faible puissance fixée à un étage de chargement pour contenir une puce desilicium (Figure 1),une puce de silicium, un porte-puce avec feuille de polyester (Figure 2), une pipette p200, des embouts de pipette de 200 μL, une pince à épiler, du papier filtre et la boue de cristal de protéine sont nécessaires. Préparez un porte-puce. Découpez deux feuilles de papier de polyester en carrés d’environ 6 cm x 6 cm. Posez les feuilles de polyester sur les deux plaques de base (grandes et petites). Fixez les feuilles de polyester en place à l’aide des bagues d’étanchéité métalliques. Tirez soigneusement sur l’excès de feuille de polyester pour enlever les plis afin de faciliter la visualisation et le centrage des échantillons plus tard. Choisissez une puce de silicium avec des ouvertures de taille appropriée (7-30 μm) par rapport à la taille des cristaux. La lueur décharge la puce pendant 25 secondes à 0,39 mBar et en utilisant un courant de 15 mA pour permettre une propagation facile des microcristaux sur la puce. Placez la puce de silicium sur l’étage de chargement de la puce à l’aide d’une pince à épiler avec les barres surélevées vers le bas. Appliquez 200 μL de la boue de microcristallin sur le côté plat de la puce à l’aide d’une pipette. Étalez la boue de cristal pour couvrir tous les « pâtés de maisons » de la puce. Si la puce est endommagée, couvrez les trous avec un petit morceau de feuille de polyester ou une pointe de pipette filtrante pour vous assurer qu’un vide uniforme peut être appliqué. Appliquez un vide doux jusqu’à ce que tout l’excès de liquide ait été aspiré à travers la puce. Retirez la puce de l’étape de chargement de la puce à l’aide d’une pince à épiler. Épongez soigneusement le dessous de la puce avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide. Placez la puce chargée sur la plus grande moitié du porte-puce entre les marques de guidage côté plat vers le bas. Scellez la puce en plaçant la petite moitié du porte-puce sur le dessus. Les deux moitiés du porte-puce s’enclencheront en place. Si la seconde moitié n’est pas au ras de l’eau, faites tourner le support de 180 ° pour aligner correctement les aimants. Vissez le porte-puce fermé avec des boulons hexagonaux pour fixer la puce solidement en place.REMARQUE: Alternativement, une puce « sans puce » peut être chargée de la même manière, avec un plus petit volume de boue cristalline (~ 15 μL) pris en sandwich entre les deux couches de feuille de polyester dans le porte-puce 37, ou un volume plus petit peut être chargé à l’aide d’une entretoise adhésive double face de 50 μm d’épaisseur appliquée directement sur la feuille de polyester comme décrit précédemment 38 . L’utilisation d’entretoises adhésives permet également de charger plusieurs échantillons (ou des variantes d’échantillons tels que des trempages de ligand) sur chaque puce sans puce. Une approche de chargement complémentaire exploitant l’éjection de goutte acoustique (ADE) pour charger des puces de silicium peut également être utilisée chez Diamond39. ADE permet de charger des copeaux en utilisant de plus petits volumes de boue cristalline que le chargement par pipette. C’est une technique particulièrement utile lorsque les échantillons sont rares, bien que la composition chimique et la viscosité de la boue doivent être prises en considération. 2. Interface graphique et configuration à la ligne de faisceau Effectuez tout l’alignement et la configuration de la puce pour la collecte de données via une interface utilisateur graphique (GUI) EPICS Display Manager (edm) simple(Figure 3a). Cela fournit une interface pointer-cliquer pour l’instrumentation de ligne de faisceau et fournit des paramètres d’entrée pour la collecte de données basée sur Python. Les sous-fenêtres fournissent un contrôle supplémentaire pour la collecte à partir de sous-régions d’un porte-échantillon (Figure 3b) ou d’expériences de pompe-sonde laser/LED (Figure 3c). 3. Alignement de la puce Placez la puce chargée sur l’étage XYZ à la ligne de faisceau (illustrée à la figure 4a) à l’aide des supports cinématiques. Prenez soin d’éviter de tirer les étapes le long de leur direction de déplacement. Les aimants dans les supports cinématiques sont assez forts, ce qui peut être fait assez facilement par accident. À l’approche de la monture, le porte-puce doit être maintenu à un léger angle (±30°). Lorsque les aimants entrent en contact, laissez le porte-puce tourner parallèlement au sol (0°) et le porte-puce clique en place (Figure 4b). Lors du déchargement d’une puce, suivez un chemin inverse. Faites pivoter et inclinez la puce loin des étages avant de retirer le porte-puce. À l’aide du système de visualisation sur axe de la ligne de faisceau et de l’interface graphique d’alignement de la puce, localisez la fiduciale supérieure gauche de la puce. Les fiducials sont trois carrés, deux petits et un grand, perpendiculaires l’un à l’autre(Figure 5a). La puce est rétro-éclairée de sorte que la puce apparaîtra sombre avec des ouvertures sous forme de carrés blancs. Centre sur le zéro fiduciaire dans X, Y et Z (Figure 5b). Alignez X et Y en vous déplaçant respectivement vers la gauche / droite et vers le haut / vers le bas. Alignez Z en déplaçant la puce dans et hors de la mise au point. Cliquez sur Définir fiducial zéro. Répétez l’étape 3.2 pour fiducial one (en haut à droite, Figure 5c) et fiducial two (en bas à gauche, Figure 5d) pour aligner tous les fiducials avec le faisceau de rayons X. Générez une matrice de coordonnées en appuyant sur make co-ordinate system, cela calcule le décalage, le tangage, le roulis et le lacet de la puce par rapport aux étages permettant à tous les mouvements ultérieurs d’être effectués dans le cadre de coordonnées de la puce. Cliquez sur Vérification des blocs pour déplacer l’étape XYZ vers le premier puits de chaque bloc de ville pour la confirmation visuelle que la puce est bien alignée. Si le réticule à rayons X s’aligne avec les ouvertures, la puce est alignée. Si ce n’est pas le cas, répétez les étapes 3.2 à 3.3.REMARQUES: En cas de difficulté d’alignement (fiducials cassés), différentes ouvertures sur la puce peuvent être utilisées pour l’alignement à l’aide du menu déroulant « type d’alignement ». De nombreux types de puces sont disponibles pour la collecte de données sur cible fixe. Différents types de puces sont pris en charge grâce à l’utilisation du menu déroulant « Type de puce ». Les types de puces les plus couramment utilisés chez I24 sont les puces « Oxford » et « personnalisées ». Le nombre et l’espacement des ouvertures et des fiducials sur la puce sont lus à partir d’un dictionnaire de puces défini via le menu déroulant. La puce personnalisée permet de définir l’espacement de l’ouverture à la volée, ce qui est particulièrement utile pour les feuilles à couche mince ou d’autres puces de type « sans puce » où les cristaux sont situés au hasard sur le support37. Une nouvelle interface graphique Python, offrant une fonctionnalité de déplacement sur clic et un alignement automatisé des puces, est actuellement en cours de développement, mais n’est pas encore prête pour une utilisation de routine au moment de la rédaction de ce manuscrit. 4. Mise en place de la collecte de données REMARQUE : La configuration de la collecte des données dépend du système étudié et de l’expérience à effectuer. Cela peut aller de l’expérience SSX la plus simple, collectant une structure à faible dose, à une expérience résolue dans le temps utilisant des lasers ou un mélange rapide pour initier une réaction qui nécessitera plusieurs ensembles de données complets à différents délais. Pour configurer une collecte de données, les paramètres suivants doivent être définis. Variables expérimentales : Remplissez le dossier, le nom du fichier, le temps d’exposition, la transmission, la distance du détecteur et le nombre de prises de vue par ouverture, le cas échéant. Type de puce: Comme décrit ci-dessus, faites correspondre le type de puce à la puce utilisée. Si un film mince ou une puce « sans puce » est utilisé, définissez le type de puce sur Aucun. Définissez le nombre d’étapes et la taille des étapes en x et y dans l’interface graphique. Définir le type de carte : cela permet de sélectionner des sous-sections d’une puce pour la collecte de données (Figure 3b). « Aucun » signifie que les données sont collectées à partir de chaque ouverture sur une puce. « Lite » signifie que les données sont collectées à partir de blocs urbains sélectionnés sur la puce (Figure 3b). Cela peut être utile si, par exemple, une région d’une puce est connue pour être mal chargée ou vide. « Full » permet de sélectionner des ouvertures individuelles pour la collecte de données. Dans ce cas, un fichier texte correctement formaté doit être fourni. Les détails et un modèle peuvent être obtenus auprès du personnel de la ligne de faisceau. Pompe-sonde : Sélectionnez le type d’expérience de sonde de pompe et le délai souhaité. Le déclenchement de la pompe (généralement une LED ou un laser) est souvent spécifique à une expérience particulière, il ne sera donc pas décrit en détail ici. Les délais « courts » font référence aux expériences où il y a un séjour à chaque ouverture entre la pompe et la sonde (c.-à-d. pompe, sonde, « passer à l’échantillon suivant »). Les retards sont généralement de l’ordre de 1 seconde ou de dizaines de millisecondes. Les retards de Long font référence à une stratégie d’excitation et de visite à nouveau (EAVA), où les ouvertures sont visitées deux fois, avec un délai défini entre les visites (c.-à-d. pomper, déplacer, pomper, déplacer, sonder, déplacer, sonder, etc.). Le délai est calculé et les temps d’exposition aux rayons X(Figure 3c)et il est généralement d’environ 1 seconde ou plus. 5. Méthodes courantes de collecte de données REMARQUE: Les paramètres clés suivants définissent le type d’expérience en cours. Cette section suppose que les autres paramètres du protocole 3 « Configuration de la collecte de données » ont été définis. Scénario 1 : Collecte de données à faible dose. Collecte d’une seule image de diffraction à partir de chaque ouverture sélectionnée sur le porte-échantillon. Définissez le nombre de prises de vue par ouverture sur 1. Réglez la sonde de pompe sur Aucun. Scénario 2 : Une série de doses, recueillant n images séquentiellement à partir de chaque ouverture sélectionnée sur le porte-échantillon. La puce est stationnaire à chaque ouverture tandis que chaque ensemble de n images est collecté. Réglez le nombre de prises de vue par ouverture sur ‘n’. Notez que le traitement est simplifié si n= 5, 10, 20 ou un autre multiple de 10. Il est difficile d’établir des tendances si n < 5. Il est utile de considérer le temps total nécessaire pour couvrir une puce et le nombre de fichiers image produits lorsque n est augmenté. Réglez la sonde de pompe sur Aucun. Scénario 3 : Méthodes pompe-sonde Sélectionnez une méthode dans le menu déroulant Sonde de pompe pour ouvrir le Centre de contrôle de l’excitation laser. Pour une expérience de sonde de pompe, remplissez l’option Laser Dwell à chaque ouverture. Pour EAVA, remplissez le Laser Dwell à chaque ouverture et exposition aux rayons X et cliquez sur Calculer. Sélectionnez l’option Répéter appropriée dans le menu déroulant de la sonde de pompe edm GUI pour le délai souhaité. Si l’expérience nécessite une étape de pré-éclairage, remplissez la section Laser 2 Dwell. Une fois toutes les variables expérimentales définies, appuyez sur Définir les paramètres et créez une liste restreinte. Cela charge les variables expérimentales sur le contrôleur de géobrique. Une fois cela fait, appuyez sur Démarrer pour déplacer le détecteur vers l’intérieur, le rétroéclairage et démarrer la collecte de données. À tous les stades de la mise en place de la collecte de données, il est utile d’ouvrir une fenêtre de terminal où les commentaires sur l’état et le résultat de chacune des étapes sont imprimés. 6. Traitement des données REMARQUE: D’une manière générale, le traitement des données peut être divisé en trois groupes en fonction de l’urgence avec laquelle la rétroaction est requise. Une rétroaction rapide est nécessaire pour montrer si les cristaux sont présents et diffract, et si oui, en quel nombre. Cela devrait suivre le rythme de la collecte de données. Effectuer l’indexation et l’intégration des données qui peuvent être plus lentes mais doivent toujours être effectuées sur des échelles de temps comparables avec la collecte de données. La fusion et la mise à l’échelle des intensités de réflexion dans un fichier mtz pour la solution de structure et la génération de cartes de densité d’électrons représentent l’étape finale et peuvent être encore plus lentes. Ici, le démarrage des pipelines à I24 pour les deux premières étapes seulement sera discuté, car ils sont nécessaires pour une rétroaction en temps réel pour guider votre expérience, mais notez que des mesures telles que les taux de réussite et les statistiques de mise à l’échelle ne remplacent pas l’inspection de la densité d’électrons, ce qui peut fournir la seule confirmation qu’un ligand s’est lié, ou qu’une réaction s’est produite, en cristallo. Rétroaction rapide Pour charger les modules de traitement de données, type module charger i24-ssx dans le terminal sur n’importe quel poste de travail de ligne de faisceau. Pour exécuter l’analyse de recherche de résultats, tapez i24-ssx /path/to/visit/directory/ dans le terminal : i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/REMARQUE: Cela ouvre trois fenêtres de terminal et, une fois les données écrites sur le disque, une représentation graphique des résultats de recherche de points de l’intégration par diffraction pour les sources lumineuses avancées (DIALS) 40,41(Figure 6a). Les paramètres par défaut marquent toutes les10 èmes images et s’actualisent toutes les quelques secondes pour minimiser la charge de calcul. Modifiez la valeur par défaut en ajoutant un argument à la fin de la commande ci-dessus. Par exemple, ‘i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2’ i24-ssx exécuterait la recherche de résultats sur toutes les autres images. Cependant, cela peut exercer une pression excessive sur le cluster (une ressource partagée!) et ralentir les temps de traitement. Le graphique est codé par couleur en fonction de la probabilité d’une indexation réussie, le rouge montre qu’au moins 15 points de Bragg ont été trouvés (bonne chance d’indexation), le bleu montre peu ou pas de diffraction utile. Affichez les images de diffraction d’intérêt dans la visionneuse d’images DIALS en cliquant sur les spots sur l’interface du spot finder. Commentaires sur l’indexation et l’intégrationREMARQUE: L’indexation et l’intégration des données de diffraction sont effectuées avec DIALS à l’aide de la fonction dials.still_process 40,41. En tant que tel, des informations spécifiques relatives à votre cristal (groupe d’espace cristallin attendu, cellule unitaire et géométrie d’expérience) doivent être placées dans un fichier texte .phil. Chargez les modules DIALS en tapant les cadrans de chargement des modules dans un terminal. Pour commencer à traiter un jeu de données, tapez dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. La progression de tous les jeux de données en cours de traitement peut être surveillée en exécutant le script stills_monitor en tapant monitor_stills_process.py (après avoir effectué le chargement du module i24-ssx et changé de répertoire en visite en cours) ( Figure6b). La distribution des données de diffraction indexées par cellule unitaire (Figure 7a) peut être surveillée à l’aide de la commande ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true Ceci est particulièrement utile pour identifier et résoudre les polymorphes de cellule unitaire comme discuté précédemment 42. ‘Visualzie’ si, et comment, cette distribution varie sur une cible fixe en produisant un tracé 2D (Figure 7b) à l’aide de la commande python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out. Produire des projections stéréographiques de toutes les données de diffraction indexées (Figure 7c) à l’aide de la commande DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt.REMARQUE: C’est une pathologie courante lors du traitement des données d’alambics à partir de cristaux où la symétrie du réseau de Bravais est supérieure à la symétrie du groupe d’espace que les données fusionnées apparaissent comme un jumeau parfait. Les algorithmes de traitement des données ont évolué pour résoudre cette pathologie 43,44,45,46, mais les utilisateurs doivent en être conscients lors du traitement de leurs données.

Representative Results

Collecte et séries de données à faible doseDes données sur les faibles doses (étape 5.1 : scénario 1) et les séries de doses (étape 5.2 : scénario 2) ont été recueillies sur les microcristaux de nitrite de cuivre réductase à I24 et ont été publiées précédemment 42. Tous les échantillons ont été préparés comme décrit à l’étape 1, les données recueillies conformément aux étapes 3, 4 et 5 et traitées à l’aide de méthodes à l’étape 6. Dans ce travail, une série de doses rapides a été recueillie avec 20 images de diffraction prises à chaque ouverture (c.-à-d. n= 20 dans l’interface graphique de collecte de données montrée ci-dessus) avant de passer à un nouvel échantillon. À partir de ces données, une distribution bimodale de cellules unitaires dans le groupe spatial P213 a été identifiée (a = b = c = 97,25 Å et a = b = c = 96,38 Å). L’identification et la séparation de ces polymorphes unité-cellule pour le traitement ont montré une nette amélioration des indicateurs de qualité des données et ont révélé deux structures différentes dans une boucle flexible entre les résidus 189-193 au lieu de l’état mixte observé lors du traitement de toutes les données ensemble. L’identification de tels polymorphes pourrait faire toute la différence dans une étude structurelle délicate résolue dans le temps où seuls de petits changements structurels sont attendus. En outre, les séries de doses recueillies ont révélé un changement de cellule unitaire dose-dépendante dans le cristal, avec une dose accrue déplaçant la population en faveur de la plus grande cellule unitaire. Des travaux similaires ont été effectués par Ebrahim et al (2019)47, où une série de doses (étape 5.2: scénario 2) a été recueillie à partir d’une peroxydase hémique de type colorant de Streptomyces lividans (DtpAa) pour comparer les structures à faible dose de SSX (étape 5.1: scénario 1) avec celles mesurées dans le même système cible fixe à l’aide de SFX. Les données SFX ont été collectées à la ligne de faisceau SACLA BL2 EH3 avec une longueur d’impulsion de 10 femtosecondes et un taux de répétition de 30 Hz. La durée d’impulsion de 10 femtosecondes garantit que les effets dépendants de la dose ne sont pas présents dans les données SFX. Les données SFX ont été comparées aux données SSX recueillies sur la ligne de faisceau I24, où 10 expositions séquentielles de 10 millisecondes ont été mesurées à chaque position de l’échantillon (c.-à-d. n= 10). La migration dose-dépendante d’une molécule d’eau coordonnée par le fer hémique loin du fer a été observée, ainsi qu’un changement conformationnel dans l’un des groupes propionate d’hème de la série de doses SSX. Bien qu’elle ne soit pas exempte de dommages comme la structure SFX, la série de doses a permis d’extrapoler la longueur de liaison Fe-O d’un ensemble de données à dose nulle (hème ferrique), ce qui correspond à une erreur expérimentale à la valeur obtenue à partir de SFX. Les méthodes de collecte de données de cristallographie en série décrites ici peuvent également être facilement adaptées pour fournir de nouveaux environnements d’échantillonnage pour, par exemple, étudier les structures protéiques anaérobies à température ambiante. Comme indiqué dans Rabe et al 2020 48, le chargement d’un échantillon « feuille sur feuille », ou « puce sans puce », avec différents films d’étanchéité dans une chambre anérobie permet la collecte à température ambiante de données structurelles à partir d’échantillons sensibles au dioxygène. Sonde de pompeBien que les résultats représentatifs suivants n’aient pas été recueillis à Diamond Beamline I24, ces méthodes ont été développées en étroite collaboration entre les installations du programme iNEXT pour travailler à des méthodes standard dans le développement de méthodes de cristallographie en série. Beamline I24 propose, ou proposera bientôt, des méthodes de collecte équivalentes à celles décrites ci-dessous pour effectuer de telles expériences en utilisant les méthodes décrites dans les protocoles ci-dessus. Sonde de pompe: mélange rapideLe mélange rapide SSX a été effectué à la ligne de faisceau T-REXX à PETRA III par Mehrabi et al (2019) 28 à l’aide d’un injecteur de gouttelettes piézo-entraîné pour initier des réactions sur des cibles fixes. Ce travail présente une preuve de principe sur l’expérience de mélange de puces liant GlcNac3à des microcristaux de lysozyme, la liaison se produisant dans les 50 ms d’une goutte de 75 pL appliquée à l’échantillon. Cette étude a été suivie d’une série à 7 structures résolues dans le temps de l’activité de l’isomérase xylose, démontrant une liaison au glucose dans les 15 ms et la formation d’une conformation en anneau ouvert dans la molécule de glucose après un délai de 60 secondes. Une configuration équivalente pour l’injection de gouttelettes est actuellement en cours de développement pour une utilisation sur I24. Pompe-Sonde: Activation de la lumièreUne expérience en série de pompe-sonde activée par la lumière est présentée dans Schulz et al (2018) 49. La fluoroacétate déshydrogénase a été imbibée de fluoroacétate photocaged et pompée avec une lumière laser de 320 à 360 nm pour produire des structures à 4 points temporels (t = 0, 30, 752 et 2 052 ms). La structure de l’état de repos (0 ms) montre un site actif vide, à l’exception de quelques molécules d’eau, et une densité équivalente entre les domaines de la calotte des deux sous-unités protéiques. 30 ms et 752 ms après activation lumineuse, une réduction significative de la densité électronique peut être observée dans le domaine de la calotte de la sous-unité B par rapport à la sous-unité A. La réduction de la densité électronique dans le domaine de la coiffe de la sous-unité B coïncide avec l’apparition du fluoroacétate dans le site actif de la sous-unité A à 752 ms. L’ensemble de données final à 2 052 ms montre un réarrangement structurel supplémentaire du ligand, soupçonné de faciliter la géométrie correcte pour l’attaque SN2, et la formation potentielle d’un état intermédiaire dans la réaction. Sur I24, un système laser Pharos portable réglable de 210 à 2500 nm fournissant des impulsions femtosecondes peut être utilisé pour l’activation de la lumière. Les premières expériences ont montré l’activation réussie d’une photocage en utilisant une excitation de 308 nm avec liaison du ligand libéré à la protéine cible observée. Au moment de la rédaction du présent rapport, l’intégration dans le système de sécurité du personnel de la ligne de faisceau est en cours et des expériences de routine pour les utilisateurs sont prévues au début de 2021. Pour les expériences où des impulsions de lumière moins intenses sont nécessaires, l’activation de la lumière avec des LED contrôlées par TTL a été effectuée avec succès. Figure 1: Équipement de chargement d’échantillons en place à la source lumineuse Diamond. L’installation se compose d’une pompe à vide ( a ),d’uneboîte à gants (b) et d’un humidificateur (c). Dans la boîte à gants, la pression de vide est utilisée pour agir sur une puce chargée de boue cristalline maintenue dans un blocd’échantillon (d)attaché à une fiole büchner(e,flèche verte), via un régulateur de pression(f,flèche jaune) attaché à un robinet d’arrêt(g,flèche bleue). L’air humide est pompé dans la tente via un tube en plastique fixé à l’humidificateur (h), et mesuré à l’aide d’un hygromètre (i). Les composants sont maintenus en place à l’aide de supports de serrage (j). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2: Porte-échantillons. Ils utilisent un joint torique métallique ( a ) pour serrerunfilm de polyester sur une moitié supérieure (b) et inférieure (c), la moitié inférieure arborant des supports magnétiques (d) qui sont utilisés pour attacher le porte-échantillon aux étages d’échantillonnage. Le film de polyester (6 μm(e)ou 3 μm(f))ainsi que les joints toriques en caoutchouc (flèches blanches) empêchent une puce chargée en cristal de sécher rapidement dans un porte-échantillon fermé hermétiquement avec des boulons hexagonaux(g). Les copeaux sont nettoyés à l’aide de bains séquentiels de 15 minutes dans dH2O, 1 M HCl et dH2O(h). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3: Interface graphique de collecte de données pour lacollecte de données à cible fixe à I24. (a) Montre l’interface principale utilisée pour aligner les puces et définir les paramètres de collecte de données, (b) est l’interface de cartographie légère utilisée pour définir les sous-régions d’une puce pour la collecte de données et (c) est une interface pour définir les paramètres pour l’éclairage laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4: Le processus de montage d’un porte-puce sur les étages comme décrit à l’étape 3, point 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5: Alignement des puces. Une puce est alignée en cliquant sur trois marqueurs fiducial sur la puce indiquée dans (a). Les vues des fiducials 0, 1 et 2 à travers le système de visualisation sur axe de la ligne de faisceau sont présentées aux pointsb),c)etd). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6: Affichage des résultats du traitement automatique lancé comme décrit à l’étape 6.1. Un graphique de taux de réussite mis à jour s’affiche (a, encart). Si vous cliquez sur un ‘hit’ sur l’image de diffraction correspondante, elle s’affiche dans la visionneuse d’images des cadrans. Le taux de réussite pour la collecte de données actuelle est indiqué (29,6 % dans cet exemple). Le panneau (b) montre un exemple de fenêtre montrant les taux actuels d’indexation et d’intégration des données collectées jusqu’à présent lors de la visite qui sont mises à jour en temps réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7: Analyse plus approfondie des données. La visualisation des paramètres des cellules unitaires peut révéler des polymorphes (a). Les paramètres unitaires moyens des cellules sont calculés; cependant, cela ne s’étend pas encore aux moyennes individuelles pour les polymorphes. La visualisation d’un petit sous-ensemble de données (les données présentées sont un sous-ensemble de 793 cristaux de nitrite de cuivre réductase à partir des données décrites dans Ebrahim et al 2019) est souvent suffisante pour révéler les tendances. Des diagrammes 2D de paramètres utiles peuvent également être produits pour révéler les variations qui surviennent en raison des effets de charge ou de déshydratation qui pourraient être traités pour les prochaines collectes de données (b). Les projections stéréographiques peuvent révéler la présence, ou l’absence, d’orientations préférées alimentant le protocole de chargement (c). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La collecte de données synchrotron série est une technique relativement nouvelle sur les lignes de faisceau MX, comblant l’écart entre les collectes de données ultra-rapides actuellement effectuées dans les XFEL et les MX traditionnelles basées sur le synchrotron. Ce manuscrit vise à donner un aperçu de la façon de collecter avec succès des données série à cible fixe à la ligne de faisceau I24, à la source de lumière Diamond pour les faibles doses, aux séries de doses et aux expériences résolues dans le temps. Comme pour la cristallographie standard, la préparation de l’échantillon est une solution majeure de goulot d’étranglement dans la structure. SSX n’est pas différent, et la préparation d’une boue cristalline homogène en quantité suffisante n’a pas encore bénéficié de plusieurs décennies d’étude et de raffinement comme la croissance de gros cristaux de protéines simples. Toutefois, la préparation de ces boues n’entre pas dans le cadre du présent document et a été résuméeailleurs 36. L’étape critique de l’approche décrite ici implique l’utilisation prudente de l’échantillon disponible à l’aide d’interfaces graphiques faciles à utiliser (étape 3) et de pipelines de traitement de données automatisés (étape 6) pour informer le chargement de la puce (étape 1) et la façon dont une expérience doit se dérouler.

Le pipeline de rétroaction rapide est un outil puissant qui permet aux utilisateurs d’évaluer les taux de réussite initiaux lors de la collecte de données afin d’informer les protocoles de chargement de puces ultérieurs pour une collecte de données réussie. Lorsqu’ils sont confrontés à un faible taux de réussite (<5 %), les utilisateurs risquent de collecter des données incomplètes et/ou de perdre du temps de faisceau avec des collections supplémentaires. Dans ce cas, l’échantillon pourrait être regroupé, concentré par centrifugation douce, et/ou des volumes plus importants pourraient être chargés à l’étape 1.5. Un taux de réussite plus élevé est généralement favorable, cependant, il existe un point de rendement décroissant où la surcharge conduit à plusieurs cristaux dans le même puits. DIALS est capable de traiter des données de diffraction multi-réseaux50, mais une préoccupation plus grande que l’indexation et l’intégration est l’effet néfaste que le regroupement de cristaux peut avoir sur l’activation uniforme des cristaux par la lumière laser ou le mélange rapide pour des expériences précises résolues dans le temps. Il convient donc de veiller tout particulièrement à éviter de surcharger les cibles fixes pour les expériences résolues dans le temps.

L’étape de traitement de l’indexation et de l’intégration produit un tracé avec la croix centrale représentant la direction du faisceau, chaque point représentant la direction de la réflexion hkl 001 des réseaux individuels et l’anneau extérieur du cercle représentant une rotation de 90 ° de l’axe du faisceau. Cela montrera si vos cristaux ont une orientation préférée, ce qui peut avoir un impact sur l’exhaustivité des données et indiquer la nécessité de collecter plus de données ou de modifier le protocole de chargement. Dans le panneau de gauche de la figure 7c, l’effet de surcharge d’une puce avec des cristaux HEWL est montré. Au fur et à mesure que les ouvertures se remplissent de plus de cristaux, elles collent aux parois inclinées des ouvertures plutôt que de se caler à la base dans une orientation aléatoire. Les deux ellipses orthogonales sont le résultat de cristaux couchés sur les parois internes de la puce qui sont à ~35° par rapport à la direction du faisceau. Cela réduit le volume de cristaux chargés, réduit le taux de frappe et réduit considérablement la fraction de cristaux se trouvant dans ces plans préférés.

Il convient de noter que d’autres approches en série sont disponibles chez I24, telles que les extrudeuses LCP et les puces microfluidiques. Ceux-ci utilisent des interfaces graphiques similaires et les mêmes pipelines de traitement, de sorte qu’une grande partie de ce qui précède restera applicable même si une technique différente est utilisée. Un certain nombre d’approches série existent pour SSX et SFX au-delà de l’approche de cible fixe décrite ici, chacune présente certains avantages par rapport à l’autre en fonction de l’expérience à effectuer et de la ligne de faisceau utilisée pour l’expérience. Comme les approches en série évoluent rapidement, il est conseillé de consulter les pages Web de la ligne de faisceau (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) pour les mises à jour récentes et de parler au personnel de la ligne de faisceau le plus tôt possible lors de la planification du temps de faisceau. L’accès à I24 pour les expériences standard et série est gratuit au point d’utilisation. Pour les utilisateurs du Royaume-Uni et de l’UE, les frais de voyage et d’hébergement sont en partie couverts par iNEXT Discovery.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’iNEXT-Discovery (Grant 871037) financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne.

Materials

Chip Holders Custom Built N/A In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers SWISCII N/A LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II Delta Tau N/A A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts ThorLabs KB25/M Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump Merck Z262285-1EA Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm Fisher Scientific 15360562 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm Fisher Scientific 04-675-4 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System Ted Pella, INC. 91000 A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips University of Southampton N/A Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages Smaract N/A XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) 1byOne B01DENO0EQ Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  2. Diederichs, K., Wang, M., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 239-272 (2017).
  3. Pearson, A. R., Mehrabi, P. Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 65, 168-174 (2020).
  4. Chapman, H. N., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Structure Determination Using X-Ray Free-Electron Laser Pulses. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 295-324 (2017).
  5. Chavas, L. M., Gumprecht, L., Chapman, H. N. Possibilities for serial femtosecond crystallography sample delivery at future light sources. Structural Dynamics. 2 (4), 041709 (2015).
  6. Dauter, Z., Wlodawer, A. Progress in protein crystallography. Protein & Peptide Letters. 23 (3), 201-210 (2016).
  7. Owen, R. L., Rudiño-Piñera, E., Garman, E. F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4912-4917 (2006).
  8. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 907-911 (2019).
  9. Axford, D., et al. In situ macromolecular crystallography using microbeams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, 592-600 (2012).
  10. Warren, A. J., Axford, D., Paterson, N. G., Owen, R. L. Exploiting Microbeams for Membrane Protein Structure Determination. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 105-117 (2016).
  11. Sanishvili, R., Fischetti, R. F., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Applications of X-Ray Micro-Beam for Data Collection. Protein Crystallography: Methods and Protocols. , 219-238 (2017).
  12. Wierman, J. L., et al. Fixed-target serial oscillation crystallography at room temperature. IUCrJ. 6 (2), 305-316 (2019).
  13. Maeki, M., et al. Room-temperature crystallography using a microfluidic protein crystal array device and its application to protein-ligand complex structure analysis. Chemical Science. 11 (34), 9072-9087 (2020).
  14. Grunbein, M. L., Nass Kovacs, G. Sample delivery for serial crystallography at free-electron lasers and synchrotrons. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 178-191 (2019).
  15. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  16. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 71, 387-397 (2015).
  17. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4, 400-410 (2017).
  18. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 406-412 (2019).
  19. Monteiro, D. C. F., et al. 3D-MiXD: 3D-printed X-ray-compatible microfluidic devices for rapid, low-consumption serial synchrotron crystallography data collection in flow. IUCrJ. 7, 207-219 (2020).
  20. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  21. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  22. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, (2015).
  23. de la Mora, E., et al. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  24. Barends, T. R., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science. 350 (6259), 445-450 (2015).
  25. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  26. Standfuss, J., Spence, J. Serial crystallography at synchrotrons and X-ray lasers. IUCrJ. 4 (2), 100-101 (2017).
  27. Grünbein, M. L., et al. Illumination guidelines for ultrafast pump-probe experiments by serial femtosecond crystallography. Nature Methods. 17 (7), 681-684 (2020).
  28. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  29. Beyerlein, K. R., et al. Mix-and-diffuse serial synchrotron crystallography. IUCrJ. 4, 769-777 (2017).
  30. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. , 167276 (2013).
  31. Kupitz, C., et al. Structural enzymology using X-ray free electron lasers. Structural Dynamics. 4 (4), 044003 (2017).
  32. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  33. Shilova, A., et al. Current status and future opportunities for serial crystallography at MAX IV Laboratory. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (5), 1095-1102 (2020).
  34. Huang, C. -. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallographica Section D. 71 (6), 1238-1256 (2015).
  35. Gao, Y., et al. High-speed raster-scanning synchrotron serial microcrystallography with a high-precision piezo-scanner. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (5), 1362-1370 (2018).
  36. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  37. Doak, R. B., et al. Crystallography on a chip – without the chip: sheet-on-sheet sandwich. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 1000-1007 (2018).
  38. Axford, D., Aller, P., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J. Applications of thin-film sandwich crystallization platforms. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 72, 313-319 (2016).
  39. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), 1820-1825 (2019).
  40. Brewster, A. S., et al. Improving signal strength in serial crystallography with DIALS geometry refinement. Acta Crystallographica Section D. 74 (9), 877-894 (2018).
  41. Winter, G., et al. DIALS: implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  42. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 151-159 (2019).
  43. Brehm, W., Diederichs, K. Breaking the indexing ambiguity in serial crystallography. Acta Crystallographica Section D. 70 (1), 101-109 (2014).
  44. White, T. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 219-233 (2019).
  45. Shi, Y., Liu, H. EM-detwin: A Program for Resolving Indexing Ambiguity in Serial Crystallography Using the Expectation-Maximization Algorithm. Crystals. 10 (7), 588 (2020).
  46. Gildea, R. J., Winter, G. Determination of Patterson group symmetry from sparse multi-crystal data sets in the presence of an indexing ambiguity. Acta Crystallographica Section D. 74 (5), 405-410 (2018).
  47. Ebrahim, A., et al. Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation-sensitive metalloproteins. IUCrJ. 6 (4), 543-551 (2019).
  48. Rabe, P., et al. Anaerobic fixed-target serial crystallography. IUCrJ. 7 (5), 901-912 (2020).
  49. Schulz, E. C., et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 15 (11), 901-904 (2018).
  50. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70 (10), 2652-2666 (2014).

Tags

Serial Data CollectionFixed TargetSerial Synchrotron CrystallographySSXLow DoseRoom TemperatureProtein DynamicsSilicon ChipPolyester FoilChip HolderChip LoadingMicrocrystal SlurryVacuumAlignmentKinematic MountXYZ StageOn-axis Viewing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Horrell, S., Axford, D., Devenish, N. E., Ebrahim, A., Hough, M. A., Sherrell, D. A., Storm, S. L. S., Tews, I., Worrall, J. A. R., Owen, R. L. Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (168), e62200, doi:10.3791/62200 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image