הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר
1John F. Hardesty, MD Department of Ophthalmology and Visual Sciences,Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Neuroscience,Washington University School of Medicine, 3Department of Neuroscience,Washington University School of Medicine, 4Hope Center for Neurological Disorders,Washington University School of Medicine
Summary
הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.
Abstract
הרשתית הופכת אותות אור מהסביבה לאותות חשמליים המופצים למוח. מחלות הרשתית שכיחות וגורמות לליקוי ראייה ועיוורון. הבנת התקדמות מחלות כאלה היא קריטית לגיבוש טיפולים חדשים. מיקרוסקופיית in vivo במודלים של מחלות בבעלי חיים היא כלי רב עוצמה להבנת ניוון עצבי והובילה להתקדמות חשובה לקראת טיפולים במצבים החל ממחלת אלצהיימר ועד שבץ מוחי. בהתחשב בכך שהרשתית היא מבנה מערכת העצבים המרכזית היחיד הנגיש מטבעו על ידי גישות אופטיות, היא מתאימה את עצמה באופן טבעי להדמיית in vivo. עם זאת, האופטיקה הטבעית של העדשה והקרנית מציבה כמה אתגרים לגישה יעילה להדמיה.
פרוטוקול זה מתווה שיטות להדמיית שני פוטונים in vivo של קבוצות ומבנים תאיים ברשתית העכבר ברזולוציה תאית, הישימות הן לניסויי הדמיה אקוטיים והן לניסויים כרוניים. הוא מציג דוגמאות של תאי גנגליון רשתית (RGC), תא אמקרין, מיקרוגליה והדמיה וסקולרית באמצעות חבילה של טכניקות התוויה, כולל וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV), עכברים מהונדסים וצבעים אנאורגניים. חשוב לציין כי טכניקות אלה משתרעות על כל סוגי התאים של הרשתית, ומתוארות שיטות מוצעות לגישה לאוכלוסיות תאיות אחרות שמעניינות אותן. כמו כן מפורטות אסטרטגיות לדוגמה לעיבוד תמונה ידני לתצוגה וכימות. טכניקות אלה ישימות ישירות למחקרים על תפקוד הרשתית בבריאות ובמחלות.
Introduction
הדמיית in vivo של מערכת העצבים המרכזית דורשת בדרך כלל הליכים פולשניים כמו דילול גולגולת והתקנת חלונות זכוכית או עדשות ממסר אופטיות. הרשתית היא המבנה היחיד במערכת העצבים שניתן לצפות בו ישירות ללא צורך בהכנה פולשנית שכן היא מקבלת באופן טבעי אור מהסביבה. קלות הגישה האופטית לרשתית הופכת אותה למערכת מודל אטרקטיבית לחקר מערכת העצבים המרכזית.
הדמיה פלואורסצנטית חיה של הרשתית בעכברים שימשה למעקב אחר מוות RGC במודלים של גלאוקומה 1,2, פגיעה בעצב הראייה 1,3,4 ושבץ 5, כמו גם שינויים בהפעלה מיקרוגליאלית 6,7,8 וכלי דם 9 בתנאים ניווניים. אותות פנימיים יכולים לשמש גם כדי לדמיין פוטורצפטורים 10,11,12 ותאי אפיתל פיגמנט רשתית 13. גישות רבות להדמיית in vivo של הרשתית משתמשות במכשירים מיוחדים מאוד שתוכננו במיוחד למטרות עיניים6 או במערכות אופטיות שעברו שינוי רב כדי לתקן את הסטיות המקוריות של הקרנית והעדשה 8,9,11,12,13,14.
הפרוטוקול הנוכחי מדגים גישה להדמיית in vivo של אותות פלואורסצנטיים ברשתית ברזולוציה תאית, תוך שימוש בשיטה בסיסית של תיקון חלקי לאופטיקה הקדמית של עין העכבר. אסטרטגיה זו דורשת התאמות קלות מאוד לתצורות מיקרוסקופ מולטיפוטון המשמשות בדרך כלל להדמיית in vivo של המוח. מכיוון שגישה זו פשוטה להגדרה, והעכברים נמצאים תחת לחץ מועט, זה תורם לבצע ניסויים בקיטועי זמן על פני משכי זמן אקוטיים וכרוניים כאחד. בנוסף, הליכים גנטיים ואורגניים מבוססי צבע המתייגים רכיבי רשתית בודדים, כולל RGCs, תאי אמקרין, מיקרוגליה וכלי דם, תואמים לטכניקת הדמיה זו ומאפשרים תצפית in vivo של סוגי תאים ומבנים קריטיים לתפקוד הרשתית. כלים אלה יכולים להיות מותאמים כדי לתייג את רוב סוגי התאים העצביים האחרים, כמו גם רכיבי גליה וכלי דם של הרשתית.
Protocol
הערה: ההליך הבא בוצע בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על הריאגנטים, הציוד ובעלי החיים המשמשים במחקר זה. 1. הזרקת וירוסים הקשורים לאדנו הערה: תיוג של תאים ספציפיים ברשתית יכול להתבצע בקווי עכבר מהונדסים של Cre עם דפוסי ביטוי מוגבלים. חלק זה מתאר העברה תוך-גופית של וקטורים AAV המקודדים ביטוי תלוי Cre של חלבון פלואורסצנטי, ובכך מתייגים תאי רשתית ספציפיים. להזריק עכברים (זכר ונקבה), החל מגיל 4 שבועות. הכנת מחט המיקרופיפטההשתמש במושך מיקרופיפטה כדי ליצור מחט נימי זכוכית בורוסיליקט. טען נימי זכוכית במושך המיקרופיפטה ובצע את בדיקת הרמפ, תוך רישום הערך המתקבל. השליכו את נימי הזכוכית המשמשים לבדיקת הרמפ. משוך micropipettes עם ההגדרות הבאות: חום: ערך בדיקת רמפה מינוס 10; משיכה: 55; מהירות: 65; זמן: 120; לחץ אוויר: 500; זמן אוויר בתחילת המשיכה: 20.הערה ייתכן שיהיה צורך להתאים את הגדרות ה- PULL עבור מושכים שונים. תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את קצה המיקרופיפטה הנמשכת במיקום שבו קצה הזכוכית מסיט מעט תחת כוח, ~ 10 מ”מ מקצה החלק המחודד. חותכים בזווית חדה כך שהחתך מייצר קצה משופע. השליכו טיפים בוטים. הכנת מזרק הזרקההכניסו מיקרופיפט מזכוכית חתוכה למקטע של 2 ס”מ של צינורות פלסטיק אתיל ויניל אצטט (EVA) (קוטר פנימי 0.05 אינץ’, קוטר חיצוני של 0.09 אינץ’). חבר את הקצה השני של מקטע צינורות זה לאורך 20 ס”מ של צינורות EVA (קוטר פנימי 0.02 אינץ’, קוטר חיצוני 0.06 אינץ’). חבר את הצינורות למזרק זכוכית 50 μL עם מחט 22 גרם. מוציאים את הבוכנה ממזרק הזכוכית וממלאים בחזרה את המזרק והצינורות המחוברים בשמן מינרלי באמצעות מחט מזרק 25 גרם. השאירו שטח אוויר של 4 מ”מ בקצה המיקרופיפטה. הזרקה תוך-גופית של AAVלבצע הזרקה תוך-גופית בטכניקה אספטית סטנדרטית, תוך שימוש בכפפות כירורגיות סטריליות, מעיל מעבדה נקי, מסכה, שדה סטרילי ומכשירים אוטומטיים על פי פרוטוקולים מוסדיים לניתוח הישרדות. הסר aliquot של וקטור AAV מאחסון ב -80 מעלות צלזיוס ולהפשיר על קרח. לאחר ההפשרה, צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 2,000 × גרם כדי להסיר בועות אוויר. עקוב אחר הנחיות ההרדמה והחומרים המבוקרים של הוועדה המוסדית לניסויים בבעלי חיים. באמצעות מחט היפודרמית של 30 גרם, יש לבצע הזרקה תוך-צפקית (IP) של 0.1 מ”ל/10 גרם משקל גוף של קוקטייל קטמין/קסילזין (10 מ”ג/מ”ל קטמין, 1 מ”ג/מ”ל קסילזין במי מלח, מינון יעיל לעכבר: 100 מ”ג/ק”ג קטמין, 10 מ”ג/ק”ג קסילזין). החזירו את העכבר לכלוב שלו ותנו 5 דקות להרדמה להיכנס לתוקף. באמצעות מחט היפודרמית של 30 גרם, יש לבצע הזרקה תת-עורית של 0.1 מ”ל/10 גרם משקל גוף של מלוקסיקם (0.5 מ”ג/מ”ל ב-0.9% נתרן כלורי). בדוק את עומק ההרדמה על ידי אישור אובדן רפלקס הקרנית ורפלקס הגמילה לצביטת הזנב והבוהן. אם רפלקס הקרנית נמשך לאחר אובדן רפלקס נסיגת הזנב והבוהן, יש למרוח ירידה של 0.5% בתמיסת פרופרקאין על כל עין ולהמתין 10 שניות. הנח את העכבר על צדו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. השתמש במהדק המוסטטי מיני בולדוג כדי לתפוס את העור מעולה ונחות מהמסלול, ולאבטח את המהדק בקנטוס המדיאלי כדי להזיז חלקית את כדור הארץ אל מחוץ למסלול. לנקב את סקלרה לרוחב עם micropipette לחתוך מחובר מזרק זכוכית, ~ 1-2 מ”מ אחורי לימבוס. הימנע מהפרעה לכלי הדם העוברים באופן היקפי מיד אחורית ללימבוס. בצעו את הנקב בזווית הניצבת לסקלרה, והחזירו מעט את המיקרופיפטה מיד לאחר ניקוב הסקלרה כדי למנוע פגיעה בעדשה. השתמש בבוכנה של מזרק הזכוכית כדי למשוך 1-2 μL של הומור זגוגי, המתאים בערך לנפח הנוזל המיועד להזרקה. למשוך את micropipette מן העין, ולהוציא את ההומור הזגוגי הוסר. מלאו את קצה המיקרופיפטה ב-1-2 μL של AAV, והשאירו ~ 4 מ”מ של מרווח אוויר בין הווקטור הנגיפי לשמן המינרלי כדי למנוע ערבוב. הכנס את המיקרופיפטה לחור בסקלרה שנוצרה על ידי הנקב הראשון, ולחץ באיטיות על הבוכנה של מזרק הזכוכית כדי להזריק את הווקטור הנגיפי במהלך 20-30 שניות. דמיינו את רמת הנוזל של הווקטור הנגיפי בקצה המיקרופיפטה, והקפידו להפסיק להזריק לפני שאוויר כלשהו נכנס לעין. החזיקו את המיקרופיפטה באותה תנוחה במשך 10 שניות, ואז החזירו את המיקרופיפטה. הסר את המהדק המוסטטי של הבולדוג. יש למרוח אוקסיטטרציקלין/פולימיקסין B משחת עיניים אנטיביוטית על העין המוזרקת. הניחו את העכבר על כרית חימום, ועקבו אחר התאוששותו מההרדמה (ראו 3.4.3). להחזיר את העכבר לדיור שלו, ולבצע טיפול לאחר הניתוח בהתאם להנחיות המוסד. יש להמתין 2-3 שבועות לביטוי בתיווך ויראלי של פלואורופורים לפני ההדמיה. 2. הגדרת מיקרוסקופ הערה: שרטוט של נתיב האור במיקרוסקופ מוצג באיור 1. ציוד “פועל תמיד”: מכשירים אלה צריכים להישאר תמיד דולקים אלא אם כן הם עוברים התאמה או תחזוקה. הגדר את הטמפרטורה הגבוהה של מערכת קירור הלייזר ל -20.0 °C. הפעל את הכוח הראשי ללייזר Ti:Sapphire המהיר במיוחד, אפשר זמן להשלמת תהליכי ההפעלה של המערכת וסובב את מקש “הפעלת לייזר” למצב “מופעל”. תצורת נתיב אור פליטההגדר את נתיב איסוף הפליטה הפלואורסצנטית לדגימת אורכי גל באמצעות ערכות מסננים מתאימות של דיכרואיק ופס פס עבור הפלואורופורים המעניינים.הערה: בכתב יד זה, הדמיית Twitch2b השתמשה בקוביית מסנן המורכבת מ-505 דיכרואיק מעבר ארוך וזוגות מסנני מעבר 480/40 ו-535/30 פסים. GFP צולם באמצעות קוביית מסנן אדומה/ירוקה המורכבת ממסנן מעבר ארוך של 560 עם מסנני מעבר של 525/50 ו-605/70. אוונס בלו צולם באמצעות מסנן 560 מעברים קצרים. שינוי מסנני הפליטה חושף את נתיב אור הפליטה לאור חדר תועה שעלול לפגוע בצינורות פוטומולטיפלייר (PMTs). ודא ש- PMT כבוי, וכבה את אורות החדר לפני שינוי נתיב האור שנאסף, שכן חשיפה לאור עלולה להשפיע לרעה על תפקוד PMT. התחלת רכישת תמונותהערה: חשיפה ישירה ללייזר בעל שני פוטונים מסוכנת, במיוחד לעין, שכן אור אדום רחוק לא יגרום לתגובת מצמוץ. יש להקפיד על כך שהלייזר סגור לאורך נתיב האור, וקיימות כספות כשל כדי להגן על המשתמש מפני חשיפה דרך חלקי העין או פליטות ממטרת המיקרוסקופ. על המשתמשים להבין באילו תנאים הלייזר יפלוט מהמטרה, ולנקוט באמצעי זהירות נאותים שלא לחשוף את עצמם לסכנות כאלה.הפעל את התקן איסוף הנתונים, המחשב, תא פוקלס, בקר המיקרוסקופ והבמה, בקר התריס המכני וההספק הראשי של PMT. שמור על PMTs במצב “מושבת” עד שיהיו מוכנים לרכישת תמונה ויהיו מוגנים מפני אור תועה. פתח את ממשק בקרת הלייזר במחשב ובתוכנת רכישת התמונות. הפעל את הלייזר מממשק המחשב והבטח נעילת מצב. הגדר את אורך גל הלייזר הרצוי. ודא שאור הלייזר נכנס לתא פוקלס על ידי פתיחת תריס הלייזר, ואפשר 30 דקות לעוצמת הלייזר להתייצב. מדידת עוצמת הלייזר ביעד וקביעת אחוז לייזר מקסימליהערה: קרינת לייזר נפלטת מהעדשה האובייקטיבית במהלך מדידת הספק. סגור את וילון מארז המיקרוסקופ, והשתמש בהגנה מתאימה על העיניים לפני הפעלת תריס ההדמיה. מדוד את עוצמת הלייזר בזמן ההתקנה הראשונית של המערכת כדי לקבוע את עקומת תפוקת ההספק עבור כל אורך גל מעניין ומדי חודש לאחר מכן כדי לוודא את יציבות כוח העירור.הפעל את מד ההספק האופטי ובחר את אורך גל המדידה המתאים לאורך גל הלייזר. מניחים את גלאי מד הכוח האופטי על שלב המיקרוסקופ ומתמרנים אותו ישירות מתחת לעדשה האובייקטיבית במידות X-Y. באמצעות כונן המיקוד הממונע Z-dimension, הנמיכו את העדשה האובייקטיבית עד שגלאי מד הכוח יהיה ~1 מ”מ מתחת לעדשה האובייקטיבית. מעבר מתאורה אפיפלואורסצנטית ללייזר כנתיב אור העירור של המיקרוסקופ. הפעל את התריס המכני. בתוכנת רכישת התמונה, התחל סריקה נקודתית כדי לפתוח את תריס ההדמיה, ושלח את הלייזר למד הכוח האופטי. הגדר את עוצמת הלייזר ל- 100% בתוכנת הסריקה. מטב את מיקומי X-Y ו-Z של גלאי מד ההספק עד להשגת מדידת עוצמת הלייזר הגבוהה ביותר. מדוד את עוצמת הלייזר ביעד מ-0.1% ל-100% בתא פוקלס, תוך ביצוע מדידות במרווחים של 10%. רשום את אחוז תא פוקלס המתאים להספק של 45 mW במטרה. הגדר אחוז זה כעוצמת הלייזר המרבית בתוכנת רכישת התמונה.הערה: ההספק הגבוה ביותר שנצפה עבור הדמיית רשתית של עכבר in vivo ללא נזק נראה לעין לרקמת המטרה היה 45 mW, כפי שנבחן על ידי צביעה היסטולוגית שבועיים לאחר ההדמיה. נזק ברור ברשתית ניכר לאחר הדמיה עם 55 mW במטרה. השבת את תריס ההדמיה והחזר את נתיב אור העירור לאפיפלואורסצנציה. 3. הכנת עכבר לרכישת תמונה עכבר מרדים להדמיההערה: הקפידו על נטרול תקין של פסולת גז כדי להפחית את החשיפה לאיזופלורן. יש לוודא שיציאת הפליטה של תא אינדוקציה בהרדמה מחוברת למיכל מסנן גז מנקה פסיבי, וששקע חרטום ההרדמה של העכבר מחובר למיכל מסנן גז נטרול פעיל עם ואקום המסופק על ידי מנגנון פינוי גז. עקוב אחר הנחיות היצרן לניטור משקל מיכל המסנן להחלפה.הרדימו את העכבר באמצעות קוקטייל קטמין/קסילזין כמתואר לעיל בשלב 1.3.3. לחלופין, השרה הרדמה באמצעות שאיפת איזופלורן אם משתמשים גם באיזופלורן לשמירה על הרדמה (סשן הדמיה > 30 דקות). הגדר את מכשיר ההרדמה של בעלי חיים קטנים כדי למלא את תא האינדוקציה עם 5% isoflurane מעורבב עם אוויר החדר בקצב זרימה של 0.5 L / min. הניחו את העכבר בתא האינדוקציה, ואפשרו לעכבר 15 שניות להיות מורדם. החלף את מכשיר האידוי איזופלורן ל -0%, והפנה את זרימת ההרדמה אל האף. בצע 5 שניות “O2 סומק” של תא האינדוקציה. הוציאו את העכבר מתא האינדוקציה, והדקו אותו במחזיק הראש (ראה סעיף 3.3), תוך חיבור האף. יש להשתמש בתערובת של 1% איזופלוראן עם אוויר החדר בקצב זרימה של 0.5 ליטר לדקה לשמירה על הרדמה. עקוב אחר קצב הנשימה במרווחים של 5 דקות לאורך ההרדמה, וכוונן את אחוז האיזופלורן כדי לשמור על קצב נשימה של ~ 60 נשימות לדקה.הערה: הגדרות אלה (% איזופלורן, קצב זרימה) יכולות לשמש גם לתחזוקת הרדמה המושרה על ידי קוקטייל קטמין/קסילזין. התרחבות אישוןהכינו תמיסה של 1% עם אטרופין ו-2.5% עם פנילפרין הידרוכלוריד במים. יש לאחסן את תמיסת המרחיב בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. באמצעות טפטפת פיפטה חד פעמית, יש למרוח טיפה של תמיסת המרחיב על כל עין שתצטלם. כבו את אורות החדר, והמתינו 5 דקות עד שהתלמיד יתרחב. כאשר האישון מורחב, הכתימו את תמיסת המרחיב עם רקמה נטולת מוך.הערה: ודא שתמיסת המרחיב אינה נכנסת לנחיריים. יש למרוח על כל עין טיפה גדולה של ג’ל סיכה לעיניים. אם יש לדמות את שתי העיניים, יש למרוח חתיכה קטנה של סרט הצמדה מפלסטיק על ג’ל העיניים על העין שאינה מדמיינת כדי למנוע התייבשות. אם אתם מדמיינים עין אחת בלבד, מרחו על העין משחת עיניים עם חומר סיכה שלא תצטלם. מיקום עכבר להדמיהכדי לאבטח את העכבר במחזיק ראש ההדמיה, סובב את הזרוע הראשית של מחזיק הראש עד שמוטת האוזניות מוטה בזווית של 60° או יותר מתחת לאופק. אבטחו את פין תעלת האוזן התחתונה במצב המורחב פנימה ואת פין תעלת האוזן העליונה במצב נסוג. כשהעכבר פונה למוט הנשיכה, הרכיבו אוזן אחת על הסיכה התחתונה המורחבת, והכניסו את הסיכה לתעלת האוזן. שחררו את הבורג המהדק את פין תעלת האוזן העליונה, והרחיבו את הסיכה לתעלת האוזן השנייה. הדקו את הבורג כדי לאבטח את הראש. החלק את סרגל הנשיכה לכיוון ראש העכבר. הרם בעדינות את ראש העכבר, ולאחר מכן הורד את החותכות המקסילריות של העכבר לתוך החור של מוט הנשיכה. החזירו את מוט הנשיכה בכוח עדין כדי לאבטח את ראש העכבר, והדקו את מיקום מוט הנשיכה על ידי הידוק הבורג. אם אתם משתמשים באיזופלורן, החליקו את האף דרך החריץ שלו על מוט הנשיכה לפני שאתם מאבטחים את החותכות של העכבר. אבטחו והדקו את תנוחת מוט הנשיכה כמו בשלב 3.3.3. הדקו את האף באמצעות שני הברגים על פניו העליונים עד שהוא מתאים היטב לאף העכבר, אך אינו מכווץ את החוטם. מעבירים את העכבר, במחזיק הראש, לשלב המיקרוסקופ שמתחת למטרה. סובבו את הזרוע הראשית של מחזיק הראש עד שהאישון של העין יהיה ישר כלפי מעלה, בקו אחד עם נתיב האור (איור 2). הנח כיסוי #1.5 במחזיק המסנן הקומפקטי, והצמד את המחזיק לשלב המיקרוסקופ. הנמיכו את הכיסוי לכיוון העין, תוך יצירת מגע עם ג’ל העיניים של חומר הסיכה, כך שהכיסוי נמצא אופקית מעל הקרנית (איור 2). יש לוודא שכיסוי הכיסוי אינו נוגע בקרנית.הערה: במיקרוסקופ, ודא שנתיב אור העירור מוגדר לאפיפלואורסצנציה ונתיב אור הפליטה מוגדר לעינית. הפעל את המאיר האפיפלואורסצנטי בעוצמה הנמוכה ביותר שלו ופתח את תריס התאורה. בחר את אורך הגל המאיר האפיפלואורסצנטי ואת מסנן הפלואורסצנציה המתאים לפלואורופור המצולם. תמרנו את הבמה בממדי X-Y והמטרה במצב Z באמצעות בקרת הבמה והנעת המיקוד הממונעת עד שאור העירור בשדה הרחב יכסה את הקרנית במלואה. במבט דרך העינית, המשיכו להתאים את מיקום ה-Z של השלב עד שהתאים הפלואורסצנטיים או המבנים ברשתית ייכנסו לפוקוס. הגדל את עוצמת התאורה האפיפלואורסצנטית אם אות הדגימה אינו בהיר מספיק כדי לפתור תאים בודדים או מבנים בעלי עניין דרך העינית.הערה: אם אתם מתקשים לאתר את הרשתית, הקשתית היא נקודת ציון בעלת ניגודיות גבוהה שיש לעגן עליה ולאחר מכן להתמקד כלפי מטה לכיוון הרשתית. שלב זה יאפשר גם לוודא שהאישון מורחב באופן מקסימלי. השג אזור הדמיה על ציר באמצעות עדשת העכבר. כוונן את זווית העכבר באמצעות דרגות החופש השונות על מחזיק הראש עד שתתרחש רק הרחבה או כיווץ של אור מחוץ למיקוד בעת התאמת מישור המוקד. כבה את המאיר האפיפלואורסצנטי וסגור את תריס התאורה.הערה: פרלקסה משמעותית של X-Y של אור מחוץ למיקוד בעת גלילה דרך מישורי המוקד בכיוון Z מצביעה על כך שהרשתית אינה על ציר ביחס לנתיב האור המדמה. 4. רכישת תמונה של שני פוטונים פרמטרים של הגדרה ורכישה של תמונותהערה: כבו את אורות החדר וכסו מקורות אור תועים בחדר. ודא שתאורת האפיפלואורסצנציה כבויה ותריס התאורה סגור.החלף את נתיב אור העירור לנתיב אור הלייזר והפליטה ל- PMTs. בתוכנת רכישת התמונות, הגדר גודל מסגרת של 512 x 512 וממוצע מסגרת של 3. הגדר את השלבים לכל פרוסה ל- -8 מיקרומטר. הקצה z-step כדי להתחיל בראש הערימה ולהתקדם כלפי מטה, תוך מזעור הפעלת לייזר של שני פוטונים של פוטורצפטורים.הערה: ניתן להקטין את גודל הצעד כדי להגדיל את רזולוציית Z במחיר של זמן הדמיה מוגבר, אך צעדים של 8 מיקרומטר מספיקים כדי לפתור את הסומטה של התא בתצורת הדמיה זו. הפעל והפעל את ה- PMTs. התאם את מתח ה-PMT ל-680 V. הפעל את תריס העירור.הערה: רכיבי PMT מופעלים רגישים לנזק קל. ודא שתאורת האפיפלואורסצנציה כבויה, וילון מארז המיקרוסקופ נמשך ואורות החדר כבויים. התחל תצוגה מקדימה חיה של התמונה של רקמת היעד, החל מעוצמת לייזר של 1%. כוונן באופן אוטומטי את בהירות התצוגה כדי להציג באופן חזותי את התאים או המבנים המעניינים. כוונן אוטומטית את שלב הסריקה. אם רקמת המטרה עמומה או לא ברורה, הגדל את אחוז כוח הלייזר עד שהמבנים יהיו גלויים מבלי לעבור את הגבול שנקבע בשלב 2.4.4 המתאים ל-45 mW.הערה: לתמונה של 16 סיביות, ערך תצוגה של ~1000 בשעת התאמה אוטומטית של הבהירות במישור Z המכיל מבנים מעניינים מציין בהירות מספקת של הדגימה. תמרנו את שלב המיקרוסקופ בכיוון X-Y כדי להתמקד באזור ההדמיה הרצוי, ולאחר מכן נווטו למישור Z עם המבנים בעלי העניין במיקוד.הערה: הדמיה הסמוכה לראש עצב הראייה מאפשרת לו לשמש כנקודת ציון חד משמעית לניסויי הדמיה כרוניים. אם מדובר בניסוי בהילוך מהיר כרוני, יש לפתוח תמונה קודמת במחשב הרכישה, ולהשתמש בה כהפניה כדי למצוא את אותו תחום עניין. ודא שזווית ההדמיה דומה לזו של תמונות קודמות כדי לרכוש את אותה קבוצת תאים עם פרלקסה מינימלית.הערה: התאמה נוספת של מיקום ראש העכבר נדרשת ככל הנראה כדי לדמות את אותם תאים כמו בנקודות זמן קודמות (איור 3). קבע את מגבלות ה- Z של ערימת ההדמיה על-ידי ניווט למישורי ה- Z העליונים והתחתונים ביותר המעניינים אותך, ורכוש את התמונה. עם השלמת רכישת התמונה, השבת את PMTs ואת תריס הפליטה. החלף את נתיב אור הפליטה בחזרה לעינית, ואת נתיב אור העירור לתאורת אפיפלואורסצנציה. הסר את העכבר משלב המיקרוסקופ. כיבוי תוכנה וחומרה של המערכתצא מתוכנת רכישת התמונות. כבה את הלייזר בממשק המחשב. כבה את החומרה בסדר הפעלה הפוך, למעט ציוד “פועל תמיד”. שחזור עכברהסר את מחזיק הראש והעכבר משלב המיקרוסקופ. אם רלוונטי, הגדר את מאדה האיזופלוראן ל -0%. הסר את העכבר ממחזיק הראש. נגבו בעדינות את ג’ל העיניים עם רקמה נטולת מוך, ומרחו משחת עיניים לבנה עם שמן פטרולאטום-מינרלי על שתי העיניים. הניחו את העכבר על כרית החימום במחזור המים החמים (מוגדרת לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס), המשיכו לטפל בעכבר ולנטר את קצב הנשימה שלו עד שהעכבר יתעורר ויחזיר לעצמו את הקיבולת האמבולטורית. החזר את העכבר למארז שלו. במידת הצורך, יש להעריך את פעילות בעלי החיים ואת התחלואה ב-24 שעות לאחר ההזרקה התוך-גופית. עם השלמת המחקר, להרדים את העכבר עם מנת יתר של tribromoethanol (250 מ”ג / ק”ג) ולבצע זלוף שריר הלב עם 4% paraformaldehyde כדי לשמר רקמת הרשתית. 5. עיבוד וניתוח תמונה ביטול הפחתה ומיזוג של נתונים רב-ערוצייםמכיוון שתוכנות מסוימות לרכישת תמונות מאחסנות תמונות רב-ערוציות בתבנית משולבת, פתח את קובץ התמונה .tif באמצעות תוכנה, כגון פיג’י (https://imagej.net/Fiji), כדי להפריד בין הערוצים. בתפריט תמונה של פיג’י, בחר אוספים | כלים | דאינטרלייב. הזן את מספר הערוצים המרכיבים את התמונה ולחץ על OK. כדי למזג את הערוצים המופרדים לקובץ יחיד, עבור אל תמונה | צבע | מיזוג ערוצים. מקמו את ערוצי התמונה ללא הפרדות צבע בערוצי צבע נפרדים, ולחצו על הלחצן ‘אשר ‘ ליצירת תמונה רב-ערוצית ללא הפרדות צבע. שמרו תמונה ללא הפרדות צבע זו כקובץ .tif חדש. כימות עוצמת הפלואורסצנציה בתמונות רב-ערוציותהערה: ניתן לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה בתוך אזורי עניין ייעודיים (ROIs) במישורי תמונה יחידה באמצעות פיג’י. ניתן לכמת את קריאות היחס על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות בערוצים שונים של תמונה מורכבת באותו ROI. עבור ניסויי הדמיה כרוניים, עדיף להשתמש בביוסנסורים המבוססים על יציאות עירור או יחס פליטה.בפיג’י, עבור אל ניתוח | כלים | מנהל ROI. פתחו את התמונה ללא הפרדות צבע בפיג’י. גלול אל פרוסת z המתאימה למבנה העניין, והשתמש בכלי הבחירה (כגון בחירת מלבן, בחירה סגלגלה, בחירת מצולע) כדי לחלק את הרווחים לרמות. לחץ על T במקלדת כדי להוסיף כל בחירה למנהל החזר ההשקעה. עם השלמת בחירת החזר ההשקעה, לחץ על מדידה במנהל ההחזר על ההשקעה כדי לרשום נתונים שונים מ- ROIs כגון שטח וערך עוצמה ממוצעת. העתק את המדידות של הערוץ הנוכחי שנבחר שהוקלט בחלון ‘תוצאות ‘ לגיליון אלקטרוני. עברו לערוץ הבא בחלון התמונה ‘ללא הפרדות צבע ‘ ולחצו על ‘ מדידה’ כדי לקבל מדידות עבור ערוץ זה באותה קבוצה של ממשקי מוח. בתוך מנהל החזר ההשקעה, עבור אל עוד | שמור ושמור את ה- ROIs כקובץ .zip. הקרנות בעוצמה מרבית לתצוגהכדי ליצור תצוגות של נתוני התמונה, השתמש בפונקציה Z-project בפיג’י. בתפריט תמונה , בחר אוסף | פרויקט Z. בחר רק את המסגרות שבהן נמצאים תחומי עניין כדי להקטין את הרקע. אם יש צורך בהסרת רעש יריית PMT, השתמש בפונקציית המסנן החציוני. בתפריט תהליך , בחר תהליך | מסננים | חציון. בחר ערך של 1.0 כדי לשמור על פרטים מרחביים. כדי ליצור הקרנות בעוצמה מרבית המתמקדות בתאים בודדים, חזור על תהליך זה ובחר רק את מסגרות התמונה המתאימות לתא המעניין.הערה: זה יכול לשפר מאוד את היכולת לפתור סבכים תאיים (איור 4). מדידות של עוצמת פלואורסצנציה צריכות להתבצע במישורים של תמונה בודדת ולא בתחזיות עוצמה מקסימלית.
Representative Results
ניתן להשתמש בגישות שונות לתיוג צבעים מהונדסים, וקטורים ויראליים או אנאורגניים כדי להמחיש באופן ספציפי מספר סוגים ומבנים של תאי רשתית in vivo באמצעות התאמה פשוטה של מיקרוסקופ רב-פוטוני בסיסי. כדי להמחיש תאי RGCs ותאי אמקרין, עכברים מהונדסים VGlut2-Cre ו-VGat-Cre, בהתאמה, קיבלו זריקה תוך-גופית של מבנה ביטוי AAV תלוי Cre המקודד Twitch2b, חיישן Ca 2+ מבוסס תהודה פלואורסצנטית ציטופלסמית (FRET) המכיל חלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב (CFP ו-YFP, בהתאמה) ואת תחום הקישור Ca2+ של טרופונין15 . בעכברי VGlut2-Cre, ניתן להבחין בבירור בסומות RGC, ולעתים קרובות ניתן להבחין בפאסיקלים של אקסונים (איור 3). יש לציין שהמסלול של האקסונים והדימוי השלילי של כלי הדם מאפשר לזהות בקלות רבה את ראש עצב הראייה בעכברי VGlut2-Cre, וזה שימושי כציון דרך בניסויי הדמיה כרונית (איור 3). למרות שתאי אמקרין נראים פחות בהירים מתאי RGCs, אולי בשל גודלם הקטן יותר של סומה ו/או התמרת AAV יעילה פחות, הסומה שלהם עדיין ניכרת בקלות בשכבה הגרעינית הפנימית. בניגוד ל-RGCs, נויטריטים של תאי אמקרין נצפים לעתים קרובות יותר בשכבות הפלקסיפורמיות הפנימיות (איור 4). ניתן לדמות מיקרוגליה רשתית בקו העכבר המהונדס Cx3cr1-GFP6. מיקרוגליה מקשרת עם כלי הדם, מה שמאפשר למצוא את אותו אזור בניסויי הדמיה בהילוך מהיר. ניתן להשתמש בגישה זו כדי לעקוב אחר הדינמיקה של תהליכי מיקרוגליה עדינים, הליך בעל רזולוציה מרחבית טובה יותר בתמונות במישור יחיד, או אם מוכנים הקרנות בעוצמה מקסימלית המתמקדות בתאים בודדים (איור 5). הרזולוציה הצירית הירודה הנגרמת על ידי סטייה אופטית דרך עדשת העכבר מונעת בדיקה של פרטים עדינים בממד z. כדי לקבוע אם טכניקת הדמיה זו יכולה לצפות בשינויים ניווניים באולטרה-מבנה התאים, 1 μL של 50 mM N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) הוזרק לתוך הזגוגית כדי לגרום לנגע אקסיטוטוקסי. יום לאחר ההזרקה, המיקרוגליה הדגימה תהליכים קצרים או מורפולוגיה אמבואידית (איור 5) בהתאם לדוחות קודמים16. יש לציין כי תאים בקו המהונדס Cx3cr1-GFP הציגו ביטוי חלבונים פלואורסצנטי אחיד ומלא יותר על פני קבוצת התאים מאשר בניסויים עם העברה בתיווך AAV של קלטות ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים. יש לקחת בחשבון את היתרונות של תיוג מגוון ודליל לעומת תיוג מלא ואחיד בעת תכנון ניסויים. כדי לתייג את כלי הדם ברשתית כפי שתואר קודםלכן 8, עכברים הוזרקו תוך צפק עם 200 μL של צבע כחול אוונס (20 מ”ג/מ”ל במלח סטרילי) 30-60 דקות לפני ההדמיה. זה הוביל לסימון חזק של כלי דם שנובעים מראש עצב הראייה (איור 6). באופן מפתיע, האות הפלואורסצנטי של זריקה אחת נמשך לפחות שבעה ימים. שתי שיטות שונות שימשו להערכת הממדים של תמונות in vivo. ראשית, אותם אזורי רשתית צולמו ב-in vivo ולאחר קיבוע בשלמות רשתית שטוחה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 7). זוגות תאים אקראיים נבחרו מתוך ארבע דגימות in vivo שונות, והמרחק האמיתי בין זוגות תאים נמדד בסריקות קונפוקליות והותאם למרחק פיקסלים in vivo כדי לקבל גודל פיקסל ממוצע של 0.99 מיקרומטר עם הגדלה דיגיטלית אחת. שימוש בשיטות דומות בקורלציה של תמונות in vivo עם סריקות שלמות קונפוקליות גילה כי מיקום ראש יחיד מאפשר הדמיה עלפני כ-650 מ”מ 2 של רשתית. מיקום מחדש של מחזיק הראש לאורך ציר פיתול אחד יכול לאפשר גישה לאזור ליניארי של הרשתית באורך 2.2 מ”מ (לא מוצג). יתר על כן, מיקרו-כדורים פלואורסצנטיים בקוטר 1 או 2 מיקרומטר הוזרקו לעיני עכברים וקוטרם נמדד כחצי מקסימום רוחב מלא של סריקות קו מתמונות in vivo עם זום דיגיטלי 10x. זה נתן הערכת גודל פיקסלים מעט גדולה יותר, אך עם שונות רבה יותר (איור 7). באופן כללי, הדמיה קונפוקלית של דגימות שלמות לאחר השלמת ניסויי in vivo היא השיטה העקבית ביותר להקצאת קנה מידה לתמונות בודדות, שכן שונות בתכונות הקרנית והעדשה עשויה לשנות את קנה המידה של התמונה מדגם לדגימה. איור 1: סכמת נתיב אור. המרכיבים הבסיסיים של מיקרוסקופ שני פוטונים המשמשים בפרוטוקול זה כוללים תא פוקלס לוויסות עוצמת הלייזר, זוג עדשות כדי להקטין את קוטר קרן הלייזר כדי להתאים את הצמצם האחורי של מטרת המיקרוסקופ, וזוג מראות סריקת galvo להיגוי קרן. זוג מראות היגוי קיימות לפני כל רכיב אופטי מרכזי. המיקוד נשלט על ידי מנוע שמניע את תושבת המטרה. ניתן להתאים אישית את נתיב אור הפליטה עבור פלואורופורים שונים על ידי החלפת מסנני דיכרואיק ומחסום. מוצגת הגדרה כללית להדמיית ציאן/צהוב/אדום שבה מראה דיכרואית קצרה מכוונת אור אדום ל-PMT הראשון, ומראת דיכרואית בעלת מעבר ארוך בשילוב עם מסנני מעבר פס מתאימים משמשת להפרדת פליטות ציאן וצהוב. קיצור: PMT = צינור פוטומולטיפלייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: מיקום עכברים להדמיית in vivo. כדי למקם את העכבר עם האישון על ציר עם נתיב האור, העכבר המרדים מרוסן תחילה במחזיק ראש, הראש מסובב וזווית, טיפה גדולה של ג’ל עיניים סיכה מונחת על העין, והעכבר מונח על הבמה. כיסוי מותקן במחזיק הכיסוי בניצב לנתיב האור ומורד כלפי מטה לכיוון העין. הכיסוי לא צריך ליצור קשר עם הקרנית או עם ראש העכבר (משמאל), אשר יהיה ברור אם הכיסוי מוסט. עם זאת, הכיסוי צריך להיות גם קרוב מספיק כדי למנוע מותניים של טיפה (ימין), כי זה יהיה השפעה demagnifying על הדגימה. לאחר החלת טבילת הג’ל ואבטחת הכיסוי, יש להעביר את הבמה למקומה ישירות מתחת למטרת המיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: הדמיה של תאי גנגליון ברשתית. לתצוגת תמונה, נוצרות הקרנות בעוצמה מרבית עם מישורי z המכילים תאים מעניינים, והתמונות המתקבלות מסוננות בחציון כדי להסיר רעשי צילום PMT. מוצגות שתי דוגמאות לתאי גנגליון ברשתית המסומנים על ידי הזרקת AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b לעכברים מהונדסים VGlut2-Cre, במיוחד אות CFP. תמונות נרכשו במפגשים בהפרש של ארבעה ימים זה מזה, ונקודות ציון וסקולריות שימשו כדי לחזור לאותו אזור ליד ראש עצב הראייה. ראש עצב הראייה מכוון לתחתית התמונה. למרות ששתי הדגימות מראות שונות מסוימת בכיוון (אזורים עם ירידה בעוצמה מסומנים בחצים), רוב התאים נמצאים בשתי נקודות הזמן. סרגל קנה מידה = כ- 50 מיקרומטר. קיצורים: PMT = צינור פוטומולטיפלייר; AAV = וירוס הקשור לאדנו; EF1α = גורם התארכות-1alpha; FLEX = כריתת היפוך; VGlut2 = טרנספורטר גלוטמט שלפוחית 2; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: הדמיית תאי אמקרין. תאי Amacrine סומנו על ידי הזרקת AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b לעכברים מהונדסים VGat-Cre. אות CFP של Twitch 2b מוצג במיוחד. הקרנות קטנות בעוצמה מקסימלית המתמקדות במעמקי השכבה הגרעינית הפנימית מצביעות על סומות של תאי אמקרין, בעוד שהתמקדות בפרספקס הפנימי פותרת נוריטים של תאי אמקרין (חץ). ראש עצב הראייה מכוון לכיוון ימין של התמונה. סרגל קנה מידה = כ- 50 מיקרומטר. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; EF1α = גורם התארכות-1alpha; FLEX = כריתת היפוך; VGat = טרנספורטר חומצה גמא-אמינו-בוטירית שלפוחיתית; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן; INL = שכבה גרעינית פנימית; IPL = שכבת פלקסיפורם פנימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: הדמיה של מיקרוגליה. קו העכבר המהונדס Cx3cr1-GFP שימש לתיוג מיקרוגליה. הקרנה בעוצמה מרבית של נפח הסריקה המלא מראה מיקרוגליה רבים, חלקם עם פרטי תהליך עדינים הניתנים לפתרון. שים לב שלתאים לכיוון השמאלי התחתון של השדה יש פחות עיוות בהקרנה המרבית מאשר בתאים לכיוון הימני העליון עקב פרלקסה באזור זה. היטלים בעוצמה מקסימלית המכילים רק את התא המעניין מפחיתים באופן משמעותי פרלקסה זו (מרכז, תיבה בצבעים המתאימים). יתר על כן, אסטרטגיית הדמיה זו יכולה לתעד את הדינמיקה של שיפוץ תהליך מיקרוגליה עדין (לוחות תחתונים). באופן יחסי, ניתן לראות מיקרוגליה רבים עם תהליכים קצרים או מורפולוגיה אמבואידית יום אחד לאחר נגע אקסיטוטוקסי על ידי הזרקה תוך-גופית של 50 mM NMDA (מימין). סרגל קנה מידה = כ- 50 מיקרומטר. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; Cx3cr1 = קולטן כימוקין Cx3 1; NMDA = N-מתיל-D-אספרטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: תיוג ציוני דרך של כלי דם. לעכברים הוזרקו 200 μL של 20 מ”ג/מ”ל אוונס כחול תוך-צפק 30-60 דקות לפני פגישת ההדמיה הראשונה. תחזיות בעובי מלא בעוצמה מקסימלית מדגימות פלואורסצנטיות מתמשכת בכלי הדם ברשתית שנמשכה לפחות שבעה ימים. סרגל קנה מידה = כ- 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: מידות התמונה. תאי גנגליון רשתית שסומנו על ידי הזרקת AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b לעכברים מהונדסים VGlut2-Cre צולמו in vivo, ואותו אזור צולם לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית לאחר קיבוע והכנה מלאה של הרשתית. תעלת חלבון פלואורסצנטית צהובה מוצגת עבור שניהם. זוגות חצים צבעוניים מציינים את אותו תא בשתי ההכנות (חלוניות עליונות). תמונה חד-מישורית של מיקרו-כדורים פלואורסצנטיים בקוטר 2 מיקרומטר שהוזרקו תוך ויטריאליים ומצולמים in vivo (פאנל שמאלי תחתון). מיקרוספרות לא התיישבו ולכן היו בתנועה מתמדת מה שהפך את מדידת הרזולוציה הצירית לבלתי אפשרית. גדלי פיקסלים המחושבים ממדידות חצי מקסימליות ברוחב מלא של מיקרוספרות פלואורסצנטיות in vivo או מדידות קונפוקליות קורלטיביות שנלקחו מ-2-4 רשתיות לקבוצה (מימין למטה). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; EF1α = גורם התארכות-1alpha; FLEX = כריתת היפוך; VGlut2 = טרנספורטר גלוטמט שלפוחית 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 8: פעילות סידן המושרה על-ידי סריקה של שני פוטונים. תאי גנגליון רשתית המסומנים על ידי הזרקת AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b לעכברים מהונדסים VGlut2-Cre, YFP הוא מגנטה פסאודו-צבעונית וירוק CFP, המצולמים במישור יחיד כסדרת זמן ב-4.22 הרץ. לכל ה-RGCs היה יחס התחלתי דומה של YFP/CFP. רובם הגיבו בעלייה ביחס FRET (לא כולל התא הכתום), ואחד מהם שמר על יחס YFP/CFP גבוה לאורך כל סדרת הזמן (תא צהוב). יחסי YFP/CFP נורמלו לממוצע המסגרת הראשונה, ועיגולים צבעוניים תואמים לעקבות צבעוניים. כוכביות מציינות נקודות זמן עם תמונות מייצגות המוצגות משמאל. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; EF1α = גורם התארכות-1alpha; FLEX = כריתת היפוך; VGlut2 = טרנספורטר גלוטמט שלפוחית 2; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן; RGCs = תאי גנגליון ברשתית; FRET = העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
הליך ההדמיה הדו-פוטוני המתואר כאן מאפשר הדמיה אורכית in vivo של רשתית העכבר. תמונות חוזרות של אותו אזור של הרשתית ניתן לקבל לתקופה רצופה של עד 6 שעות או יותר תחת isoflurane. ניתן גם לדמות את העכבר בימים שונים באמצעות ציוני דרך תאיים וכלי דם כדי לאתר את אותו אזור הדמיה (איור 3). השימוש בטבילת ג’ל שקופה בשילוב עם זכוכית כיסוי למטרה זו יושם בעבר על מגוון פרוצדורות, כולל הדמיה של רשתית להזרקה תת-רשתית, מודלים של פגיעה ברשתית הנגרמת על ידי לייזר, והדמיית פונדוס20,21,22.
האנטומיה של העין מציבה אתגרים ייחודיים להדמיית in vivo, שכן העוצמה האופטית הגבוהה של הקרנית והעדשה של העכבר מעכבת הדמיה ישירה של האישון ללא תיקון. מספר שיטות הדמיה אחרות in vivo מסתמכות על שימוש בעדשות מגע קעורות פלאנו-קעורות לתיקון האופטיקה הקדמית של עין העכבר 7,17,18,19. עם תיקון אופטי בלבד בקרנית, העוצמה האופטית הגבוהה של עדשת העכבר גורמת לכמות בלתי נמנעת של פרלקסה, במיוחד של מבנים בשדה הסריקה ההיקפית, המתבטאת במתיחה ותנועה מתורגמת בממד X-Y במישורי Z שונים. כדי למזער עיוותים הקשורים לפרלקסה בתמונה בממדי X ו-Y, חיוני שעין העכבר תהיה מכוונת כך שהמישור המשיק לרשתית באזור ההדמיה יהיה בניצב לנתיב האור של המיקרוסקופ. ההגדרה המתוארת כאן תורמת למניפולציה מדויקת של זווית העין כדי להשיג יישור זה. מחזיק ראש עכבר מתכוונן המאפשר סיבוב לאורך שני צירים מאפשר כוונון ידני קל של זווית העין בזמן שהנסיין גולל דרך ממד Z כדי למזער פרלקסה. הטיה זו גם עוקפת את אפקט עצירת השדה של האישון כדי לאפשר הדמיה של אזורים גדולים יותר של הרשתית. הריסון של מחזיק הראש גם מפחית מאוד את חפצי התנועה הנגרמים על ידי הנשימה.
יש להקפיד על שמירה על בהירות עין העכבר, שכן איכות התמונה תידרדר עם אטימות במהלך הדמיה מתמשכת. מריחה חוזרת תכופה של ג’ל חומר סיכה במהלך ההדמיה, ומריחת משחה לאחר כל פגישת הדמיה מסייעים למנוע מהעין להתייבש ולפתח אטימות. כמה אטימות הקרנית תיפתר באופן ספונטני לאחר 24-48 שעות. השימוש בג’ל שקוף ובזכוכית כיסוי כמתואר בפרוטוקול זה מספק איכות תמונה דומה ותיקון סטייה מזו של עדשת מגע7, תוך שהוא מאפשר כוונון קל יותר של זווית העין ללא צורך ביישור מחדש של זכוכית הכיסוי. בנוסף, הג’ל מספק לחות מתמשכת לעין, מה שמאפשר לבצע מפגשי הדמיה חריפים של עד מספר שעות. לבסוף, מכיוון שזכוכית הכיסוי אינה באה במגע עם הקרנית, היא גורמת לגירוי מינימלי בעין שעשוי להפחית את הבהירות האופטית עבור מפגשי הדמיה חוזרים.
מגבלה של גישה זו היא העובדה כי סטיות אופטיות אינן מתוקנות לחלוטין. בעוד שרזולוציה זו מפחיתה מאוד את הרזולוציה הצירית בשל הפרלקסה הכבדה, ניתן לקבל מדידות כמותיות של הסומה במישורי תמונה יחידה. יש לציין כי מכיוון שעוצמת האות הפלואורסצנטי של נוירוני הרשתית תלויה ביישור הדגימה בשיטה זו, חיישנים מבוססי עירור ויחס פליטה מתאימים יותר לניסויים המשווים דגימות באופן כרוני על פני מפגשי הדמיה שונים. גישה לתיקון סטיות אופטיות ברמת המערכת היא אופטיקה אדפטיבית, המאפשרת רזולוציה תת-תאית ברשתית 8,9,14,21. עם זאת, אופטיקה אדפטיבית דורשת ציוד מיוחד ביותר ומומחיות נרחבת ליישום.
גישות חלופיות להדמיית רשתית דו-פוטונית in vivo הן מיקרוסקופיה קונפוקלית או אופתלמוסקופיה6. הגישה המוצגת כאן צריכה להיות ניתנת לתרגום בקלות למיקרוסקופיה רחבה או קונפוקלית. הדמיית פוטון בודד היא אולי חזקה יותר ומהווה פחות סיכון לפגיעה ברשתית בשל האנרגיה הגבוהה של לייזר שני פוטונים הדרושה להשגת אפקט יעיל של שני פוטונים דרך הקרנית והעדשה של העין. כדי להימנע מנזקי לייזר של שני פוטונים, יש לקבוע באופן אמפירי את הסף לעוצמת לייזר מקסימלית על ידי בחינת רשתיות שלמות לאחר השלמת ניסויי הדמיה ואימונוסטינינג לסוגי תאים בשכבות המצולמות. במערכת שהוצגה כאן, RGCs סומנו עם סמן pan-RGC, Rbpms, וצפיפויות היו נורמליות עד 45 mW כוח הדמיה, בעוד 55 mW גרם לאובדן משמעותי של RGCs (לא מוצג).
החיסרון של הדמיית פוטון יחיד הוא העובדה שגישה זו תגרה מאוד את מעגלי הראייה המקומיים של הרשתית בהשוואה להדמיית שני פוטונים23. ניסויים קודמים שהשתמשו בתכשירי רשתית שלמים או בתכשירי עיניים הראו שסריקת לייזר של שני פוטונים מעוררת הפעלת מעגל שהיא ברובה חולפת24. כאן, הדמיה של פעילות RGC עם חיישן Ca 2+ Twitch2b מראה שתחילת סריקת הלייזר גורמת לגבהים של Ca2+, שחוזרים לקו הבסיס במהלך 5-20 שניות ברוב ה-RGCs (איור 8). בהתחשב בכך שעוצמת הלייזר בפרוטוקול זה היא בטווח של ניסויים קודמים שדיווחו על תגובת אור רשתית in vivo8, סביר להניח שהשיטה המתוארת כיום מקובלת על הקלטות של פעילות המעגל ברשתית. שיקולים כאלה חשובים לניסויים שעשויים להיות מושפעים מפעילות מעגלית.
פרוטוקול זה מדגים הדמיה in vivo של שני סוגים של נוירונים ברשתית, RGCs ותאי אמקרין. ניתן להשיג תיוג דומה של סוגי תאים עיקריים אחרים, כולל תאים אופקיים (Cx57-Cre 25), תאים דו-קוטביים (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), פוטורצפטורים של חרוט (S- או M-opsin-Cre 28), פוטורצפטורים מוטות (Nrl-Cre 29), Müller glia (Foxg1-Cre 26) ופריסיטים (NG2-DsRed9). עכברים מהונדסים זמינים גם לסימון תת-קבוצות בדידות של RGCs (לדוגמה, KCNG4-Cre עבור αRGCs30; OPN4-Cre עבור ipRGCs31; JAM-B-CreER עבור J-RGCs32) ותאי אמקרין (לדוגמה, ChAT-Cre עבור תאי אמקרין סטארבורסט26 ומנהלי התקנים מקדמי נוירופפטידים עבור תת-סוגים שונים של תאי אמקרין 3,34). ניתן להשתמש בווקטורים נגיפיים כדי להתמקד באוכלוסיות תאים ספציפיות במקום בעכברים מהונדסים. זריקות תוך-גופיות של AAV2 עם אלמנט מקדם CAG בכל מקום מסמנות כמעט אך ורק RGCs, תאי אמקרין ותאים אופקיים25. זיווג הקפסיד AAV2.7m8-Y444F המהונדס עם מבנה מקדם mGluR6 מהונדס מאפשר תיוג רחב של תאים דו קוטביים ON35. זריקות תת-קרקעיות של AAV מובילות להעשרה של פוטורצפטורים, כאשר סרוטיפ AAV2/5 הוא בעל יעילות ההתמרה הגבוהה ביותר36. Shh10, חלבון קפסיד AAV6 מעובד, בשילוב עם אלמנטים מקדמי חלבון חומצי פיברילרי, הוכח ספציפית עבור Müller glia37.
היכולת להתבונן בתאים במערכת העצבים המרכזית בגישה לא פולשנית לחלוטין יכולה לשמש לחקר שני המאפיינים הבסיסיים של מעגלים עצביים8, כמו גם מנגנונים של ניוון עצבי 3,4,5,6,38. מחלות מסנוורות רבות מכוונות לאוכלוסיות תאיות ברשתית, וגישות הדמיה in vivo בעכברים שימשו לחקר פגיעה בעצב הראייה 1,3,4, ניוון מקולרי13, שבץ מוחי5, גלאוקומה 2,6 ואובאיטיס 7. יתר על כן, מחלות נוירודגנרטיביות רבות של מערכת העצבים המרכזית מתבטאות ברשתית, כולל מחלת אלצהיימר39, טרשת נפוצה40 ומחלת פרקינסון41. לכן, טכניקה נגישה זו להדמיית in vivo של הרשתית יכולה להיות מיושמת ככלי לחקר קבוצה רחבה של מצבים נוירודגנרטיביים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן למחקר למניעת עיוורון (פרס פיתוח קריירה ל- P.R.W. ומענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס), מחקר הגלאוקומה הלאומי (תוכנית של קרן BrightFocus), ומרכז מקדונל לנוירוביולוגיה תאית ומולקולרית. Z.W. נתמך על ידי פרס שירות המחקר הלאומי המוסדי T32 EY013360. עבודה זו נתמכה גם על ידי ליבת וקטורים ויראליים של מרכז הופ בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.
Materials
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
| 50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
| Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
| Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
| Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
| CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex – Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
| Cling film | VWR | 10713-916 | |
| Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
| Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
| DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
| Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
| FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Freeware | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
| ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
| Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
| sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
| Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
| ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
| VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
| xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
References
- Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).
- Liu, H., Ding, C. Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).
- Chauhan, B. C., et al. Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice. PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).
- Leung, C. K., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).
- Murata, H., et al. Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).
- Bremer, D., et al. Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer. Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).
- Qin, Z., et al. Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo. Light: Science & Applications. 9, 79 (2020).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Williams, D. R. Imaging single cells in the living retina. Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).
- Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).
- Rossi, E. A., et al. Imaging retinal mosaics in the living eye. Eye. 25 (3), 301-308 (2011).
- Rossi, E. A., et al. In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration. Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).
- Geng, Y., et al. Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye. Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Takeda, A., et al. Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells. Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K., Weber, B. H. F., Langmann, T. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. 1834, 333-343 (2019).
- Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice. Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).
- Biss, D. P., et al. In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics. Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Palczewska, G., et al. Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).
- Euler, T., et al. Eyecup scope–optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).
- Zhang, Y., et al. Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs. Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Akimoto, M., et al. Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).
- Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors. Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. Genetically targeted binary labeling of retinal neurons. Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).
- Lu, Q., et al. AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates. Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).
- Yao, K., et al. Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas. Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).
- Williams, P. R., et al. A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo. Nature Communications. 5, 5683 (2014).
- Cheung, C. Y., et al. Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).
- Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. Retinal pathologic changes in multiple sclerosis. Retina. 14 (5), 445-451 (1994).
- Sung, M. S., et al. Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).
Cite This Article
Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (168), e61970, doi:10.3791/61970 (2021).