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Neuroscience

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Published: February 13, 2021
doi:
10.3791/61970
, ,
1John F. Hardesty, MD Department of Ophthalmology and Visual Sciences,Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Neuroscience,Washington University School of Medicine, 3Department of Neuroscience,Washington University School of Medicine, 4Hope Center for Neurological Disorders,Washington University School of Medicine

Summary

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Abstract

Die Netzhaut wandelt Lichtsignale aus der Umgebung in elektrische Signale um, die an das Gehirn weitergegeben werden. Erkrankungen der Netzhaut sind weit verbreitet und verursachen Sehstörungen und Erblindung. Zu verstehen, wie solche Krankheiten fortschreiten, ist entscheidend für die Formulierung neuer Behandlungen. Die In-vivo-Mikroskopie in Tiermodellen von Krankheiten ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der Neurodegeneration und hat zu wichtigen Fortschritten bei der Behandlung von Erkrankungen geführt, die von der Alzheimer-Krankheit bis zum Schlaganfall reichen. Da die Netzhaut die einzige Struktur des zentralen Nervensystems ist, die von Natur aus durch optische Ansätze zugänglich ist, eignet sie sich natürlich für die In-vivo-Bildgebung. Die native Optik der Linse und der Hornhaut stellt jedoch einige Herausforderungen für einen effektiven Bildzugang dar.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von zellulären Kohorten und Strukturen in der Netzhaut der Maus mit zellulärer Auflösung, die sowohl für akute als auch für chronisch andauernde Bildgebungsexperimente anwendbar sind. Es präsentiert Beispiele für retinale Ganglienzellen (RGC), Amakrinzellen, Mikroglia und vaskuläre Bildgebung unter Verwendung einer Reihe von Markierungstechniken, einschließlich Adeno-assoziierter Virusvektoren (AAV), transgener Mäuse und anorganischer Farbstoffe. Wichtig ist, dass sich diese Techniken auf alle Zelltypen der Netzhaut erstrecken und vorgeschlagene Methoden für den Zugang zu anderen Zellpopulationen von Interesse beschrieben werden. Ebenfalls detailliert sind Beispielstrategien für die manuelle Bildnachbearbeitung zur Darstellung und Quantifizierung. Diese Techniken sind direkt anwendbar auf Studien der Netzhautfunktion bei Gesundheit und Krankheit.

Introduction

Die In-vivo-Visualisierung des zentralen Nervensystems erfordert in der Regel invasive Verfahren wie Schädelverdünnung und Installation von Glasfenstern oder optischen Relaislinsen. Die Netzhaut ist die einzige Struktur im Nervensystem, die ohne invasive Vorbereitung direkt beobachtet werden kann, da sie von Natur aus Licht aus der Umgebung empfängt. Der leichte optische Zugang zur Netzhaut macht sie zu einem attraktiven Modellsystem für die Untersuchung des zentralen Nervensystems.

Live-Fluoreszenzbildgebung der Netzhaut bei Mäusen wurde verwendet, um den RGC-Tod in Modellen von Glaukom 1,2, Sehnervverletzung 1,3,4 und Schlaganfall5 sowie Veränderungen der Mikrogliaaktivierung 6,7,8 und des Gefäßsystems 9 bei degenerativen Erkrankungen zu verfolgen. Intrinsische Signale können auch verwendet werden, um Photorezeptoren 10,11,12 und retinale Pigmentepithelzellen 13 sichtbar zu machen. Viele Ansätze zur In-vivo-Bildgebung der Netzhaut verwenden entweder hochspezialisierte Geräte, die speziell für ophthalmologische Zwecke entwickelt wurden6 oder stark modifizierte optische Systeme zur Korrektur der nativen Aberrationen der Hornhaut und der Linse 8,9,11,12,13,14.

Das vorliegende Protokoll zeigt einen Ansatz zur In-vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Signalen in der Netzhaut mit zellulärer Auflösung, wobei eine grundlegende Methode zur teilweisen Korrektur der vorderen Optik des Mausauges verwendet wird. Diese Strategie erfordert sehr geringfügige Anpassungen an Multiphotonenmikroskop-Setups, die üblicherweise für die In-vivo-Bildgebung des Gehirns verwendet werden. Da dieser Ansatz einfach einzurichten ist und die Mäuse wenig Stress haben, ist es förderlich, Zeitrafferexperimente sowohl über akute als auch über chronische Zeiträume durchzuführen. Darüber hinaus sind genetische und organische Farbstoff-basierte Verfahren, die einzelne Netzhautkomponenten, einschließlich RGCs, Amakrinzellen, Mikroglia und Gefäße, markieren, mit dieser bildgebenden Technik kompatibel und ermöglichen die In-vivo-Beobachtung von Zelltypen und Strukturen, die für die Netzhautfunktion entscheidend sind. Diese Werkzeuge können angepasst werden, um die meisten anderen neuronalen Zelltypen sowie gliale und vaskuläre Komponenten der Netzhaut zu markieren.

Protocol

HINWEIS: Das folgende Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University in St. Louis durchgeführt. Weitere Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Geräten und Tieren finden Sie in der Materialtabelle . 1. Adeno-assoziierte Virusinjektion HINWEIS: Die Markierung spezifischer Zellen in der Netzhaut kann in Cre-transgenen Mauslinien mit eingeschränkten Expressionsmustern erfolgen. Dieser Abschnitt beschreibt die intravitreale Abgabe von AAV-Vektoren, die die Cre-abhängige Expression eines fluoreszierenden Proteins kodieren und so spezifische Netzhautzellen markieren. Injizieren Sie Mäuse (männlich und weiblich) ab einem Alter von 4 Wochen. Vorbereitung der MikropipettennadelVerwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um eine Kapillarnadel aus Borosilikatglas herzustellen. Laden Sie eine Glaskapillare in den Mikropipettenzieher und führen Sie den Rampentest durch, wobei der resultierende Wert aufgezeichnet wird. Verwerfen Sie die für den Rampentest verwendete Glaskapillare. Ziehen Sie Mikropipetten mit den folgenden Einstellungen: Wärme: Rampentestwert minus 10; Zug: 55; Geschwindigkeit: 65; Dauer: 120; Luftdruck: 500; Sendezeit bei Beginn des Pulls: 20.HINWEIS Die Einstellungen müssen möglicherweise für verschiedene Abzieher angepasst werden. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine Rasierklinge, um die Spitze der gezogenen Mikropipette an der Stelle zu schneiden, an der die Glasspitze unter Kraft leicht abgelenkt wird, ~ 10 mm vom Ende des konischen Abschnitts. Schneiden Sie in einem scharfen Winkel, so dass der Schnitt eine abgeschrägte Spitze erzeugt. Verwerfen Sie stumpfe Spitzen. Vorbereitung der InjektionsspritzeStecken Sie eine geschnittene Glasmikropipette in ein 2 cm langes Segment aus Ethylvinylacetat (EVA)-Kunststoffrohren (0,05″ Innendurchmesser, 0,09″ Außendurchmesser). Verbinden Sie das andere Ende dieses Schlauchsegments mit einem 20 cm langen EVA-Schlauch (0,02″ Innendurchmesser, 0,06″ Außendurchmesser). Verbinden Sie den Schlauch mit einer 22 G zementierten Nadel mit einer 50 μL Glasspritze. Entfernen Sie den Kolben aus der Glasspritze und füllen Sie die Spritze und den angeschlossenen Schlauch mit einer 25-G-Spritzennadel mit Mineralöl auf. Lassen Sie 4 mm Luftraum an der Spitze der Mikropipette. Intravitreale Injektion von AAVFühren Sie eine intravitreale Injektion mit aseptischer Standardtechnik durch, wobei sterile OP-Handschuhe, sauberer Laborkittel, Maske, steriles Feld und autoklavierte Instrumente gemäß den institutionellen Protokollen für Überlebensoperationen verwendet werden. Ein Aliquot AAV-Vektor bei -80 °C aus der Lagerung entfernen und auf Eis auftauen. Nach dem Auftauen 10 s bei 2.000 × g zentrifugieren, um Luftblasen zu entfernen. Befolgen Sie die Richtlinien für Anästhesie und kontrollierte Substanzen des institutionellen Ausschusses für Tierstudien. Führen Sie mit einer 30 g Injektion eines Ketamin/Xylazin-Cocktails mit einer 30 g Injektion eines Ketamin/Xylazin-Cocktails (10 mg/ml Ketamin, 1 mg/ml Xylazin in Kochsalzlösung, effektive Dosis für Maus: 100 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin) durch. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück und lassen Sie 5 Minuten für die Anästhesie wirken. Mit einer 30 g Injektionsnadel mit einer 30 g Injektion von Meloxicam (0,5 mg/ml in 0,9% Natriumchlorid) führen Sie eine subkutane Injektion von 0,1 ml/10 g Körpergewicht durch. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Verlust des Hornhautreflexes und den Entzugsreflex auf Schwanz und Zehenklemme bestätigen. Wenn der Hornhautreflex nach dem Verlust des Schwanz- und Zehenentzugsreflexes anhält, tragen Sie einen Tropfen 0,5% Proparacainlösung auf jedes Auge auf und warten Sie 10 s. Legen Sie die Maus auf die Seite unter das Stereomikroskop. Verwenden Sie eine Mini-Bulldoggen-Hämostatikklemme, um die Haut zu greifen, die der Augenhöhle überlegen und unterlegen ist, und sichern Sie die Klemme am medialen Canthus, um den Globus teilweise aus der Augenhöhle zu verschieben. Punktieren Sie die laterale Sklera mit der geschnittenen Mikropipette, die mit der Glasspritze verbunden ist, ~ 1-2 mm hinter dem Limbus. Vermeiden Sie es, das Gefäßsystem zu stören, das unmittelbar hinter dem Limbus umlaufend verläuft. Führen Sie die Punktion in einem Winkel senkrecht zur Sklera durch und ziehen Sie die Mikropipette unmittelbar nach dem Durchstechen der Sklera leicht zurück, um eine Beschädigung der Linse zu vermeiden. Verwenden Sie den Kolben der Glasspritze, um 1-2 μL Glaskörper zu entnehmen, was ungefähr dem Flüssigkeitsvolumen entspricht, das für die Injektion bestimmt ist. Ziehen Sie die Mikropipette aus dem Auge und werfen Sie den entfernten Glaskörper aus. Füllen Sie die Spitze der Mikropipette mit 1-2 μL AAV und lassen Sie ~ 4 mm Luftraum zwischen dem viralen Vektor und dem Mineralöl, um eine Vermischung zu vermeiden. Führen Sie die Mikropipette in das Loch in der Sklera ein, das durch die erste Punktion erzeugt wurde, und drücken Sie langsam auf den Kolben der Glasspritze, um den viralen Vektor im Laufe von 20-30 s zu injizieren. Visualisieren Sie den Flüssigkeitsstand des viralen Vektors in der Spitze der Mikropipette und achten Sie darauf, die Injektion zu stoppen, bevor Luft in das Auge gelangt. Halten Sie die Mikropipette 10 s lang in der gleichen Position und ziehen Sie dann die Mikropipette zurück. Entfernen Sie die hämostatische Bulldoggenklemme. Tragen Sie die Oxytetracyclin/Polymyxin B antibiotische Augensalbe auf das injizierte Auge auf. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen und überwachen Sie ihre Erholung nach der Narkose (siehe 3.4.3). Bringen Sie die Maus in ihr Gehäuse zurück und führen Sie die postoperative Pflege gemäß den institutionellen Richtlinien durch. Warten Sie 2-3 Wochen für die viral vermittelte Expression von Fluorophoren vor der Bildgebung. 2. Mikroskopaufbau HINWEIS: Ein Schema des Mikroskoplichtpfads ist in Abbildung 1 dargestellt. “Always-On”-Geräte: Diese Instrumente sollten immer eingeschaltet bleiben, es sei denn, sie werden eingestellt oder gewartet. Stellen Sie die hohe Temperatur des Laserkühlsystems auf 20,0 °C ein. Schalten Sie die Hauptstromversorgung des ultraschnellen Ti:Saphir-Lasers ein, planen Sie Zeit für den Abschluss der Systemstartprozesse ein und drehen Sie die Taste “Laser Enable” in die Position “On”. Konfiguration des EmissionslichtpfadsKonfigurieren Sie den Sammelpfad für Fluoreszenzemissionen zu Probenwellenlängen unter Verwendung geeigneter dichroitischer und Bandpassfiltersätze für die interessierenden Fluorophore.HINWEIS: In diesem Manuskript verwendete Twitch2b Imaging einen Filterwürfel, der aus einem dichroitischen Langpass-Lauf und 480/40- und 535/30-Bandpassfilterpaaren besteht. GFP wurde mit einem Rot/Grün-Filterwürfel abgebildet, der aus einem 560-Langpassfilter mit 525/50- und 605/70-Bandpassfiltern besteht. Evans Blue wurde mit einem 560-Grad-Kurzpassfilter abgebildet. Durch den Wechsel von Emissionsfiltern wird der Emissionslichtpfad Streuraumlicht ausgesetzt, das Photomultiplierröhren (PMTs) beschädigen könnte. Stellen Sie sicher, dass PMTs ausgeschaltet sind, und schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, bevor Sie den Sammellichtpfad ändern, da die Lichteinwirkung die PMT-Funktion beeinträchtigen kann. Starten der BildaufnahmeHINWEIS: Die direkte Exposition gegenüber dem Zwei-Photonen-Laser ist gefährlich, insbesondere für das Auge, da fernrotes Licht keine Blinzelreaktion induziert. Es sollte darauf geachtet werden, dass der Laser entlang des Lichtpfads geschlossen ist und Ausfallsicherungen vorhanden sind, um den Benutzer vor der Exposition über die Okulare oder Emissionen des Mikroskopobjektivs zu schützen. Benutzer sollten verstehen, unter welchen Bedingungen der Laser vom Objektiv ausgeht, und geeignete Vorkehrungen treffen, um sich solchen Gefahren nicht auszusetzen.Schalten Sie das Datenerfassungsgerät, den Computer, die Pockels-Zelle, das Mikroskop und den Tischcontroller, den mechanischen Verschlussregler und die PMT-Hauptstromversorgung ein. Halten Sie PMTs im Status “Deaktiviert”, bis sie für die Bildaufnahme bereit und vor Streulicht geschützt sind. Öffnen Sie die Lasersteuerungsschnittstelle auf dem Computer und die Bilderfassungssoftware. Schalten Sie den Laser über die Computerschnittstelle ein und stellen Sie die Modusverriegelung sicher. Stellen Sie die gewünschte Laserwellenlänge ein. Stellen Sie sicher, dass Laserlicht in die Pockels-Zelle eindringt, indem Sie den Laserverschluss öffnen, und lassen Sie 30 Minuten für die Stabilisierung der Laserleistung warten. Messung der Laserleistung am Objektiv und Einstellung des maximalen LaserprozentsatzesHINWEIS: Laserstrahlung emittiert während der Leistungsmessung von der Objektivlinse. Schließen Sie den Vorhang des Mikroskopgehäuses und tragen Sie einen geeigneten Augenschutz, bevor Sie den Bildverschluss aktivieren. Messen Sie die Laserleistung zum Zeitpunkt der ersten Systeminstallation, um die Leistungskurve für jede interessierende Wellenlänge zu erstellen, und danach monatlich, um die Stabilität der Anregungsleistung zu überprüfen.Schalten Sie den optischen Leistungsmesser ein und wählen Sie die Messwellenlänge aus, die der Laserwellenlänge entspricht. Platzieren Sie den optischen Powermeter-Detektor auf dem Mikroskoptisch und manövrieren Sie ihn direkt unter die Objektivlinse in den X-Y-Abmessungen. Senken Sie mit dem motorisierten Fokusantrieb der Z-Dimension die Objektivlinse ab, bis sich der Leistungsmesserdetektor ~1 mm unter dem Objektiv befindet. Wechseln Sie von der Epifluoreszenzbeleuchtung zum Laser als Anregungslichtpfad des Mikroskops. Aktivieren Sie den mechanischen Verschluss. Starten Sie in der Bilderfassungssoftware einen Punktscan, um den Bildverschluss zu öffnen, und senden Sie den Laser an das optische Leistungsmessgerät. Stellen Sie die Laserleistung in der Scan-Software auf 100% ein. Optimieren Sie die X-Y- und Z-Positionen des Powermeter-Detektors, bis die höchste Laserleistungsmessung erreicht ist. Messen Sie die Laserleistung am Objektiv von 0,1% bis 100% auf der Pockels-Zelle, wobei Sie Messungen in Abständen von 10% durchführen. Notieren Sie den Pockels-Zell-Prozentsatz, der 45 mW Leistung am Objektiv entspricht. Stellen Sie diesen Prozentsatz als maximale Laserleistung in der Bildaufnahmesoftware ein.HINWEIS: Die höchste Leistung, die für die In-vivo-Netzhautbildgebung von Mäusen ohne sichtbare Schädigung des Zielgewebes beobachtet wurde, betrug 45 mW, wie durch histologische Färbung zwei Wochen nach der Bildgebung nachgewiesen. Offensichtliche Netzhautschäden zeigen sich nach der Bildgebung mit 55 mW am Objektiv. Deaktivieren Sie den Bildverschluss und kehren Sie den Anregungslichtpfad zur Epifluoreszenz zurück. 3. Vorbereitung der Maus für die Bildaufnahme Betäubungsmaus für die BildgebungHINWEIS: Stellen Sie eine ordnungsgemäße Abgasreinigung sicher, um die Exposition gegenüber Isofluran zu verringern. Stellen Sie sicher, dass der Auslassanschluss der Anästhesieinduktionskammer mit einem passiven Gasfilterbehälter verbunden ist und der Auslass des Mausanästhesierevolvers mit einem aktiven Spülgasfilterkanister mit Vakuum verbunden ist, der von einem Gasevakuierungsgerät bereitgestellt wird. Befolgen Sie die Richtlinien des Herstellers zur Überwachung des Gewichts des Filterbehälters für den Austausch.Betäuben Sie die Maus mit dem Ketamin/Xylazin-Cocktail, wie oben in Schritt 1.3.3 beschrieben. Alternativ können Sie eine Anästhesie durch Isofluran-Inhalation induzieren, wenn Sie auch Isofluran zur Aufrechterhaltung der Anästhesie verwenden (bildgebende Sitzung > 30 min). Stellen Sie das Kleintieranästhesiegerät so ein, dass es die Induktionskammer mit 5% Isofluran gemischt mit Raumluft bei einer Durchflussrate von 0,5 l / min füllt. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und lassen Sie die Maus 15 Sekunden anästhesieren. Schalten Sie den Isofluran-Vaporizer auf 0% und leiten Sie den Anästhesiefluss zum Nasenstück. Führen Sie eine 5-sekündige “O2-Spülung ” der Induktionskammer durch. Nehmen Sie die Maus aus der Ansaugkammer, befestigen Sie sie im Kopfhalter (siehe Abschnitt 3.3), und bringen Sie den Nasenmesser an. Verwenden Sie eine Mischung aus 1% Isofluran mit Raumluft bei einer Durchflussrate von 0,5 l / min zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Überwachen Sie die Atemfrequenz in 5-Minuten-Intervallen während der gesamten Anästhesie und passen Sie den Isofluran-Prozentsatz an, um eine Atemfrequenz von ~ 60 Atemzügen / min aufrechtzuerhalten.HINWEIS: Diese Einstellungen (% Isofluran, Durchflussrate) können auch zur Aufrechterhaltung der durch den Ketamin / Xylazin-Cocktail induzierten Anästhesie verwendet werden. PupillenerweiterungBereiten Sie eine Lösung von 1% w/v Atropin und 2,5% w/v Phenylephrinhydrochlorid in Wasser vor. Lagern Sie die Dilatatorlösung lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Tragen Sie mit einer Einwegpipettenpipette einen Tropfen der Dilatatorlösung auf jedes Auge auf, das abgebildet wird. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus und warten Sie 5 Minuten, bis sich die Pupille erweitert hat. Wenn die Pupille erweitert ist, tupfen Sie die Dilatatorlösung mit fusselfreiem Gewebe ab.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dilatatorlösung nicht in die Nasenlöcher gelangt. Tragen Sie einen großen Tropfen Gleitgel auf jedes Auge auf, das abgebildet wird. Wenn beide Augen abgebildet werden sollen, tragen Sie ein kleines Stück Plastikfrischhaltefolie über das Augengel auf das nicht bildgebende Auge auf, um Austrocknung zu verhindern. Wenn Sie nur ein Auge bildgeben, tragen Sie eine schmierende Augensalbe auf das Auge auf, die nicht abgebildet wird. Positionierung der Maus für die BildgebungUm die Maus im Bildkopfhalter zu befestigen, drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Ohrmuschelleiste in einem Winkel von 60° oder mehr unter der Horizontalen geneigt ist. Befestigen Sie den unteren Gehörgangsstift in der nach innen ausgestreckten Position und den oberen Gehörgangsstift in der zurückgezogenen Position. Wenn die Maus auf die Bissleiste zeigt, montieren Sie ein Ohr auf den verlängerten unteren Stift und führen Sie den Stift in den Gehörgang ein. Lösen Sie die Schraube, die den oberen Gehörgangsstift sichert, und verlängern Sie den Stift in den anderen Gehörgang. Ziehen Sie die Schraube fest, um den Kopf zu sichern. Schieben Sie den Bissbalken in Richtung des Mauskopfes. Heben Sie den Kopf der Maus vorsichtig an und senken Sie dann die Oberkieferschneidezähne der Maus in das Loch der Bissstange. Ziehen Sie den Bissbügel mit sanfter Kraft ein, um den Kopf der Maus zu sichern, und sichern Sie die Position der Bissbügel, indem Sie die Schraube festziehen. Wenn Sie Isofluran verwenden, schieben Sie den Nasenstück durch seinen Schlitz auf den Bissbalken, bevor Sie die Schneidezähne der Maus sichern. Sichern und straffen Sie die Position der Bissstange gemäß Schritt 3.3.3. Ziehen Sie den Nasenbügel mit den beiden Schrauben an der Oberseite fest, bis er fest an die Nase der Maus passt, aber die Schnauze nicht einschnürt. Bringen Sie die Maus im Kopfhalter auf den Mikroskoptisch unter dem Objektiv. Drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Pupille des Auges in Übereinstimmung mit dem Lichtpfad gerade nach oben ausgerichtet ist (Abbildung 2). Legen Sie ein Deckglas #1.5 in den kompakten Filterhalter und befestigen Sie den Halter am Mikroskoptisch. Senken Sie das Deckglas in Richtung Auge und berühren Sie das Gleitgel, so dass das Deckglas horizontal unmittelbar über der Hornhaut liegt (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass das Deckglas die Hornhaut nicht berührt.HINWEIS: Stellen Sie am Mikroskop sicher, dass der Anregungslichtpfad auf Epifluoreszenz und der Emissionslichtpfad auf Okular eingestellt ist. Schalten Sie die Epifluoreszenzbeleuchtung mit der niedrigsten Leistung ein und öffnen Sie den Verschluss der Beleuchtung. Wählen Sie die Wellenlänge und den Fluoreszenzfilter des Epifluoreszenzilluminators, die dem abgebildeten Fluorophor entsprechen. Manövrieren Sie die Bühne in den X-Y-Dimensionen und das Objektiv in der Z-Position mit der Bühnensteuerung und dem motorisierten Fokusantrieb, bis das Weitfeld-Anregungslicht die Hornhaut vollständig bedeckt. Wenn Sie durch das Okular schauen, passen Sie die Z-Position des Tisches weiter an, bis die fluoreszierenden Zellen oder Strukturen in der Netzhaut in den Fokus kommen. Erhöhen Sie die Leistung der Epifluoreszenzbeleuchtung, wenn das Probensignal nicht hell genug ist, um einzelne Zellen oder Strukturen von Interesse durch das Okular aufzulösen.HINWEIS: Wenn Sie Schwierigkeiten haben, die Netzhaut zu lokalisieren, ist die Iris ein kontrastreicher Orientierungspunkt, an dem man sich verankern und dann auf die Netzhaut konzentrieren kann. Mit diesem Schritt kann auch überprüft werden, ob die Pupille maximal erweitert ist. Erhalten Sie mit dem Mausobjektiv einen Bildbereich auf der Achse. Passen Sie den Winkel der Maus mit den verschiedenen Freiheitsgraden am Kopfhalter an, bis beim Einstellen der Fokusebene nur noch eine Ausdehnung oder Kontraktion von unscharfem Licht auftritt. Schalten Sie die Epifluoreszenzbeleuchtung aus und schließen Sie den Verschluss der Beleuchtung.HINWEIS: Eine signifikante X-Y-Parallaxe von unscharfem Licht beim Scrollen durch die Brennebenen in Z-Richtung zeigt an, dass sich die Netzhaut in Bezug auf den Bildlichtpfad nicht auf der Achse befindet. 4. Zwei-Photonen-Bildaufnahme Bildeinstellungs- und AufnahmeparameterHINWEIS: Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus und decken Sie Streulichtquellen im Raum ab. Stellen Sie sicher, dass die Epifluoreszenzbeleuchtung ausgeschaltet und der Verschluss der Beleuchtung geschlossen ist.Schalten Sie den Anregungslichtpfad auf den Laser und den Emissionslichtpfad auf die PMTs um. Stellen Sie in der Bilderfassungssoftware eine Bildgröße von 512 x 512 und einen Bilddurchschnitt von 3 ein. Stellen Sie die Schritte pro Schicht auf -8 μm ein. Legen Sie Z-Stepping fest, um an der Spitze des Stapels zu beginnen und nach unten zu gehen, wodurch die Zwei-Photonen-Laseraktivierung von Photorezeptoren minimiert wird.HINWEIS: Die Schrittweite kann reduziert werden, um die Z-Auflösung auf Kosten einer längeren Bildgebungszeit zu erhöhen, aber 8 μm-Schritte reichen aus, um Zellsomata in dieser Bildgebungskonfiguration aufzulösen. Schalten Sie die PMTs ein und aktivieren Sie sie. Stellen Sie die PMT-Spannung auf 680 V ein. Aktivieren Sie den Erregerverschluss.HINWEIS: Powered PMTs sind anfällig für leichte Beschädigungen. Stellen Sie sicher, dass die Epifluoreszenzbeleuchtung ausgeschaltet ist, der Vorhang für das Mikroskopgehäuse gezogen ist und die Raumbeleuchtung ausgeschaltet ist. Beginnen Sie mit einer Live-Bildvorschau des Zielgewebes, beginnend mit 1% Laserleistung. Passen Sie die Bildschirmhelligkeit automatisch an, um die Zellen oder Strukturen von Interesse zu visualisieren. Automatische Anpassung der Scanphase. Wenn das Zielgewebe schwach oder unklar ist, erhöhen Sie den Prozentsatz der Laserleistung, bis Strukturen sichtbar werden, ohne den in Schritt 2.4.4 festgelegten Grenzwert von 45 mW zu überschreiten.HINWEIS: Bei einem 16-Bit-Bild zeigt ein Anzeigewert von ~1000 bei automatischer Helligkeitsanpassung in einer Z-Ebene, die interessante Strukturen enthält, eine ausreichende Helligkeit des Samples an. Manövrieren Sie den Mikroskoptisch in X-Y-Richtung, um sich auf einen gewünschten Bildbereich zu konzentrieren, und navigieren Sie dann zur Z-Ebene mit den interessierenden Strukturen im Fokus.HINWEIS: Die Bildgebung neben dem Sehnervenkopf ermöglicht es ihm, als eindeutiger Meilenstein für chronische bildgebende Experimente zu dienen. Wenn es sich um ein chronisches Zeitrafferexperiment handelt, öffnen Sie ein vorheriges Bild auf dem Erfassungscomputer und verwenden Sie es als Referenz, um den gleichen Interessenbereich zu finden. Stellen Sie sicher, dass der Bildwinkel dem früherer Bilder ähnelt, um den gleichen Zellsatz mit minimaler Parallaxe zu erfassen.HINWEIS: Eine weitere Anpassung der Mauskopfposition ist wahrscheinlich erforderlich, um die gleichen Zellen wie zu früheren Zeitpunkten abzubilden (Abbildung 3). Legen Sie die Z-Grenzen des Abbildungsstapels fest, indem Sie zur obersten und untersten Z-Ebene navigieren, und erfassen Sie das Bild. Deaktivieren Sie nach Abschluss der Bildaufnahme die PMTs und den Emissionsverschluss. Schalten Sie den Emissionslichtpfad zurück zum Okular und den Anregungslichtpfad zur Epifluoreszenzbeleuchtung. Entfernen Sie die Maus vom Mikroskoptisch. Herunterfahren der Systemsoftware und -hardwareBeenden Sie die Bildaufnahmesoftware. Schalten Sie den Laser in der Computerschnittstelle aus. Fahren Sie die Hardware in umgekehrter Startreihenfolge herunter, mit Ausnahme der “Always-On”-Geräte. Maus-WiederherstellungEntfernen Sie den Kopfhalter und die Maus vom Mikroskoptisch. Falls zutreffend, stellen Sie den Isofluran-Vaporizer auf 0% ein. Entfernen Sie die Maus aus dem Kopfhalter. Wischen Sie das Gleitmittel Augengel vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch ab und tragen Sie weiße Petrolatum-Mineralöl-Gleitmittel-Augensalbe auf beide Augen auf. Legen Sie die Maus auf das warme Umlaufheizkissen (eingestellt auf 37 °C), kümmern Sie sich weiter um die Maus und überwachen Sie ihre Atemfrequenz, bis die Maus aufwacht und ihre Gehfähigkeit wiedererlangt. Setzen Sie die Maus wieder in ihr Gehäuse ein. Gegebenenfalls ist die Aktivität und Morbidität der Tiere 24 Stunden nach intravitrealer Injektion zu beurteilen. Nach Abschluss der Studie euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Tribromethanol (250 mg / kg) und führen Sie eine transkardiale Perfusion mit 4% Paraformaldehyd durch, um das Netzhautgewebe zu erhalten. 5. Bildverarbeitung und Analyse Multichannel-Daten aufheben und zusammenführenDa bestimmte Bilderfassungssoftwareprogramme Mehrkanalbilder in einem verschachtelten Format speichern, öffnen Sie die .tif Bilddatei mit Software wie Fidschi (https://imagej.net/Fiji), um die Kanäle zu trennen. Wählen Sie im Menü Bild von Fidschi die Option Stapel | Werkzeuge | Deinterleave. Geben Sie die Anzahl der Kanäle ein, aus denen das Bild besteht, und klicken Sie auf OK. Um die getrennten Kanäle zu einer einzigen Datei zusammenzuführen, wechseln Sie zu Bild | Farbe | Kanäle zusammenführen. Platzieren Sie die verschachtelten Bildkanäle in separaten Farbkanälen und klicken Sie auf OK , um das Mehrkanal-Composite-Bild zu erstellen. Speichern Sie dieses zusammengesetzte Bild als neue .tif Datei. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in MehrkanalbildernHINWEIS: Die Fluoreszenzintensität innerhalb bestimmter Regionen von Interesse (ROIs) kann in Einzelbildebenen mit Fidschi quantifiziert werden. Die Quantifizierung ratiometrischer Messwerte kann durch Messung der Fluoreszenzintensität in verschiedenen Kanälen eines zusammengesetzten Bildes innerhalb desselben ROI erreicht werden. Für Experimente mit chronischer Bildgebung ist es am besten, Biosensoren zu verwenden, die auf Anregungs- oder Emissionsratiometrien basieren.Gehen Sie in Fidschi zu Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager. Öffnen Sie das zusammengesetzte Bild in Fidschi. Führen Sie einen Bildlauf zu dem Z-Slice durch, der der gewünschten Struktur entspricht, und verwenden Sie die Auswahlwerkzeuge (z. B. Rechteckauswahl, Ovalauswahl, Polygonauswahl), um die ROIs zu skizzieren. Drücken Sie T auf der Tastatur, um jede Auswahl zum ROI-Manager hinzuzufügen. Klicken Sie nach Abschluss der ROI-Auswahl im ROI-Manager auf Messen, um verschiedene Daten aus den ROIs wie Fläche und mittlere Intensität aufzuzeichnen. Kopieren Sie die Messungen für den aktuell ausgewählten Kanal, der im Ergebnisfenster aufgezeichnet wurde, in eine Tabelle. Wechseln Sie zum nächsten Kanal im Composite-Bildfenster und klicken Sie auf Messen, um Messungen für diesen Kanal innerhalb desselben ROI-Satzes zu erhalten. Gehen Sie im ROI-Manager zu Mehr | Speichern und speichern Sie die ROIs als .zip Datei. Projektionen mit maximaler Intensität für die AnzeigeUm Anzeigen der Bilddaten zu erstellen, verwenden Sie die Z-Projektfunktion in Fidschi. Wählen Sie im Menü Bild die Option Stapel | Z-Projekt. Wählen Sie nur die Frames aus, in denen sich Interessenbereiche befinden, um den Hintergrund zu reduzieren. Wenn das Entfernen von PMT-Schussrauschen gewünscht wird, verwenden Sie die Median-Filterfunktion. Wählen Sie im Menü Prozess die Option Prozess | Filter | Median. Wählen Sie den Wert 1,0 aus, um räumliche Details beizubehalten. Um Projektionen mit maximaler Intensität zu erstellen, die sich auf einzelne Zellen konzentrieren, wiederholen Sie diesen Vorgang und wählen Sie nur die Bildrahmen aus, die der interessierenden Zelle entsprechen.HINWEIS: Dies kann die Fähigkeit, zelluläre Dorne aufzulösen, erheblich verbessern (Abbildung 4). Messungen der Fluoreszenzintensität sollten in Einzelbildebenen und nicht auf Projektionen mit maximaler Intensität durchgeführt werden.

Representative Results

Verschiedene transgene, virale Vektor- oder anorganische Farbstoffmarkierungsansätze können verwendet werden, um mehrere Netzhautzelltypen und -strukturen in vivo mit einer einfachen Anpassung eines einfachen Multiphotonenmikroskops spezifisch zu visualisieren. Um RGCs und Amakrinzellen sichtbar zu machen, erhielten VGlut2-Cre- bzw. VGat-Cre-transgene Mäuse eine intravitreale Injektion eines Cre-abhängigen AAV-Expressionskonstrukts, das für Twitch2b kodiert, einen zytoplasmatischen Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-basierten Ca 2+-Sensor, der cyan- und gelb fluoreszierende Proteine (CFP bzw. YFP) und die Ca2+-Bindungsdomäne von Troponin15 enthält. . Bei VGlut2-Cre-Mäusen sind RGC-Somas deutlich erkennbar, und Faszikel von Axonen sind oft sichtbar (Abbildung 3). Es sollte beachtet werden, dass die Flugbahn der Axone und das negative Bild des Gefäßsystems es sehr einfach machen, den Sehnervenkopf in VGlut2-Cre-Mäusen zu identifizieren, was als Meilenstein in chronischen bildgebenden Experimenten nützlich ist (Abbildung 3). Obwohl Amakrinzellen weniger hell erscheinen als RGCs, möglicherweise aufgrund ihrer kleineren Somagröße und / oder weniger effizienten AAV-Transduktion, sind ihre Somas in der inneren Kernschicht immer noch leicht sichtbar. Im Gegensatz zu RGCs werden Amakrinzellneurite häufiger in den inneren plexiformen Schichten beobachtet (Abbildung 4). Retinale Mikroglia können in der transgenen Cx3cr1-GFP-Mauslinie6 abgebildet werden. Mikroglia assoziieren mit dem Gefäßsystem und ermöglichen es, die gleiche Region in Zeitraffer-Bildgebungsexperimenten zu finden. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Dynamik von feinen Mikroglia-Prozessen zu verfolgen, ein Verfahren, das eine bessere räumliche Auflösung in Einzelebenenbildern aufweist, oder wenn Projektionen mit maximaler Intensität mit Fokus auf einzelne Zellen erstellt werden (Abbildung 5). Die schlechte axiale Auflösung durch optische Aberration durch die Mauslinse schließt die Untersuchung feiner Details in der z-Dimension aus. Um festzustellen, ob diese bildgebende Technik degenerative Veränderungen in der zellulären Ultrastruktur beobachten kann, wurde 1 μL 50 mM N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) in den Glaskörper injiziert, um exzitotoxische Läsionen zu induzieren. Einen Tag nach der Injektion zeigten die Mikroglia kurze Prozesse oder eine amöboide Morphologie (Abbildung 5) gemäß früheren Berichten16. Es sollte beachtet werden, dass Zellen in der transgenen Linie Cx3cr1-GFP eine gleichmäßigere und vollständigere fluoreszierende Proteinexpression über die zelluläre Kohorte aufwiesen als in Experimenten mit AAV-vermittelter Abgabe von fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten. Die Vorteile einer abwechslungsreichen und spärlichen gegenüber einer vollständigen und einheitlichen Kennzeichnung sollten bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden. Um das retinale Gefäßsystem wie zuvor beschrieben zu markieren8, wurden Mäusen 30-60 min vor der Bildgebung intraperitoneal 200 μL Evansblau-Farbstoff (20 mg/ml in steriler Kochsalzlösung) injiziert. Dies führte zu einer starken Markierung von Blutgefäßen, die vom Sehnervenkopf ausgingen (Abbildung 6). Überraschenderweise hielt das fluoreszierende Signal einer einzelnen Injektion mindestens sieben Tage lang an. Es wurden zwei verschiedene Methoden verwendet, um die Abmessungen der In-vivo-Bilder zu schätzen. Zunächst wurden die gleichen Netzhautregionen in vivo und nach Fixierung in abgeflachten retinalen Wholemounts mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet (Abbildung 7). Zufällige Zellpaare wurden aus vier verschiedenen In-vivo-Proben ausgewählt, und der wahre Abstand zwischen Zellpaaren wurde in konfokalen Scans gemessen und mit dem In-vivo-Pixelabstand abgeglichen, um eine durchschnittliche Pixelgröße von 0,99 μm mit 1-facher digitaler Vergrößerung zu erhalten. Die Verwendung ähnlicher Methoden zur Korrelation von In-vivo-Bildern mit konfokalen Wholemount-Scans hat gezeigt, dass eine einzelne Kopfposition eine Bildgebung über ein etwa 650 mm2 großes Netzhautfeld ermöglicht. Die Neupositionierung des Kopfhalters entlang einer Torsionsachse kann den Zugang zu einem linearen Bereich der Netzhaut von 2,2 mm Länge ermöglichen (nicht dargestellt). Weiterhin wurden fluoreszierende Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 1 oder 2 μm in die Augen von Mäusen injiziert und ihr Durchmesser wurde als halbes Maximum von Zeilenscans in voller Breite von In-vivo-Bildern mit 10-fachem Digitalzoom gemessen. Dies ergab eine etwas größere Pixelgrößenschätzung, jedoch mit mehr Varianz (Abbildung 7). Insgesamt ist die konfokale Bildgebung ganzer Proben nach Abschluss von In-vivo-Experimenten die konsistenteste Methode, um einzelnen Bildern einen Maßstab zuzuweisen, da Varianzen in Hornhaut- und Linseneigenschaften den Bildmaßstab von Probe zu Probe verändern können. Abbildung 1: Lichtpfadschema. Die grundlegenden Komponenten des in diesem Protokoll verwendeten Zwei-Photonen-Mikroskops bestehen aus einer Pockels-Zelle zur Modulation der Laserleistung, einem Linsenpaar, um den Laserstrahldurchmesser an die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs anzupassen, und einem Paar Galvo-Scan-Spiegeln für die Strahllenkung. Vor jeder wichtigen optischen Komponente befindet sich ein Paar Lenkspiegel. Der Fokus wird von einem Motor gesteuert, der die Objektivhalterung antreibt. Der Emissionslichtpfad kann für verschiedene Fluorophore angepasst werden, indem dichroitische Filter und Barrierefilter ausgetauscht werden. Es wird ein allgemeiner Aufbau für die Cyan/Gelb/Rot-Bildgebung angezeigt, bei dem ein dichroitischer Kurzpassspiegel rotes Licht auf das erste PMT lenkt und ein dichroitischer Langpassspiegel gepaart mit geeigneten Bandpassfiltern verwendet wird, um cyanfarbene und gelbe Emissionen zu trennen. Abkürzung: PMT = Photomultiplierröhre. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Positionierung von Mäusen für die In-vivo-Bildgebung. Um die Maus mit der Pupille auf der Achse mit dem Lichtpfad zu positionieren, wird die betäubte Maus zuerst in einem Kopfhalter festgehalten, der Kopf gedreht und abgewinkelt, ein großer Tropfen Gleitgel wird auf das Auge gelegt und die Maus wird auf die Bühne gelegt. Ein Deckglas wird senkrecht zum Lichtweg in den Deckglashalter montiert und zum Auge hin abgesenkt. Das Deckglas sollte die Hornhaut oder den Mauskopf (links) nicht berühren, was offensichtlich ist, wenn das Deckglas abgelenkt wird. Das Deckglas sollte jedoch auch nahe genug sein, um eine Taille des Tröpfchens zu vermeiden (rechts), da dies eine devergrößernde Wirkung auf die Probe hat. Nach dem Auftragen des Gel-Eintauchens und dem Sichern des Deckglases sollte der Tisch direkt unter dem Mikroskopobjektiv bewegt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Bildgebende retinale Ganglienzellen. Für die Bildanzeige werden Projektionen mit maximaler Intensität mit den Z-Ebenen erstellt, die Zellen von Interesse enthalten, und resultierende Bilder werden mediangefiltert, um PMT-Schussrauschen zu entfernen. Zwei Beispiele für retinale Ganglienzellen, die durch Injektion von AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in transgene VGlut2-Cre-Mäuse markiert wurden, sind gezeigt, insbesondere das CFP-Signal. Die Bilder wurden in Sitzungen im Abstand von vier Tagen aufgenommen, und vaskuläre Landmarken wurden verwendet, um in die gleiche Region in der Nähe des Sehnervenkopfes zurückzukehren. Der Sehnervenkopf ist zum unteren Bildrand ausgerichtet. Obwohl beide Stichproben eine gewisse Varianz in der Orientierung aufweisen (Regionen mit verminderter Intensität sind mit Pfeilen gekennzeichnet), sind die meisten Zellen zu beiden Zeitpunkten vorhanden. Maßstabsbalken = ca. 50 μm. Abkürzungen: PMT = Photomultiplierröhre; AAV = Adeno-assoziiertes Virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGlut2 = vesikulärer Glutamattransporter 2; CFP = Cyan fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Bildgebende Amakrinzellen. Amakrine Zellen wurden markiert, indem AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in transgene VGat-Cre-Mäuse injiziert wurde. Das CFP-Signal von Twitch 2b wird speziell gezeigt. Kleine Projektionen mit maximaler Intensität, die sich auf die Tiefen der inneren Kernschicht konzentrieren, deuten auf Amakrinzellsoma hin, während die Fokussierung auf die innere Plexiform Amakrinzellneuriten auflöst (Pfeil). Der Sehnervenkopf ist nach rechts im Bild ausgerichtet. Maßstabsbalken = ca. 50 μm. Abkürzungen: AAV = adeno-associated virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGat = vesikulärer Gamma-Aminobuttersäuretransporter; CFP = Cyan fluoreszierendes Protein; INL = innere Kernschicht; IPL = innere plexiforme Schicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Bildgebende Mikroglia. Zur Markierung von Mikroglia wurde die transgene Mauslinie Cx3cr1-GFP verwendet. Eine maximale Projektion des gesamten Scanvolumens zeigt viele Mikroglia, einige mit feinen Prozessdetails, die aufgelöst werden können. Beachten Sie, dass Zellen in der unteren linken Ecke des Feldes aufgrund der Parallaxe in diesem Bereich eine geringere Verzerrung in der maximalen Projektion aufweisen als die Zellen in der oberen rechten Seite. Projektionen mit maximaler Intensität, die nur die interessierende Zelle enthalten, reduzieren diese Parallaxe signifikant (Mitte, in entsprechenden Farben eingerahmt). Darüber hinaus kann diese Bildgebungsstrategie die Dynamik des feinen Mikroglia-Prozessumbaus dokumentieren (untere Tafeln). Im Vergleich dazu sind viele Mikroglia mit kurzen Fortsätzen oder amöboider Morphologie einen Tag nach einer exzitotoxischen Läsion durch intravitreale Injektion von 50 mM NMDA zu sehen (rechts). Maßstabsbalken = ca. 50 μm. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; Cx3cr1 = Cx3-Chemokinrezeptor 1; NMDA = N-Methyl-D-aspartat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Kennzeichnung vaskulärer Orientierungspunkte. Mäusen wurden 30-60 min vor der ersten Bildgebungssitzung 200 μL 20 mg/ml Evansblau intraperitoneal injiziert. Projektionen mit maximaler Intensität in voller Dicke zeigen eine dauerhafte Fluoreszenz im retinalen Gefäßsystem, die mindestens sieben Tage anhielt. Maßstabsbalken = ca. 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 7: Bildabmessungen. Retinale Ganglienzellen, die durch Injektion von AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in transgene VGlut2-Cre-Mäuse markiert wurden, wurden in vivo abgebildet, und die gleiche Region wurde dann durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie nach Fixierung und ganzer Vorbereitung der Netzhaut abgebildet. Für beide ist ein gelb fluoreszierender Proteinkanal dargestellt. Farbige Pfeilpaare zeigen in beiden Präparaten die gleiche Zelle an (obere Felder). Einzelebenenbild von fluoreszierenden Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 2 μm, intravital injiziert und in vivo abgebildet (unteres linkes Bild). Mikrosphären setzten sich nicht ab und waren daher in ständiger Bewegung, was eine Messung der axialen Auflösung unmöglich machte. Pixelgrößen, berechnet aus Halbmaximalmessungen in voller Breite von in vivo fluoreszierenden Mikrosphären oder korrelativen konfokalen Messungen von 2-4 Netzhäuten pro Gruppe (unten rechts). Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: AAV = adeno-associated virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGlut2 = vesikulärer Glutamattransporter 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 8: Calciumaktivität induziert durch Zwei-Photonen-Scanning. Retinale Ganglienzellen, markiert durch Injektion von AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in VGlut2-Cre transgene Mäuse, YFP ist pseudofarbig magenta und CFP grün, abgebildet in einer einzigen Ebene als Zeitreihe bei 4,22 Hz. Alle RGCs hatten ein ähnliches YFP/CFP-Ausgangsverhältnis. Die meisten antworteten mit einem Anstieg des FRET-Verhältnisses (ohne die orange Zelle), und man behielt während der gesamten Zeitreihe ein hohes YFP/CFP-Verhältnis bei (gelbe Zelle). Die YFP/CFP-Verhältnisse wurden auf den ersten Bilddurchschnitt normalisiert, und farbige Kreise stimmen mit farbigen Spuren überein. Sternchen zeigen Zeitpunkte mit repräsentativen Bildern auf der linken Seite an. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: AAV = adeno-associated virus; EF1α = Dehnungsfaktor-1alpha; FLEX = Flip-Exzision; VGlut2 = vesikulärer Glutamattransporter 2; YFP = gelb fluoreszierendes Protein; CFP = Cyan fluoreszierendes Protein; RGCs = retinale Ganglienzellen; FRET = Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Das hierin beschriebene Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren ermöglicht longitudinale In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus. Wiederholbare Bilder derselben Netzhautregion können für einen kontinuierlichen Zeitraum von bis zu 6 oder mehr h unter Isofluran erhalten werden. Die Maus kann auch an verschiedenen Tagen mit zellulären und vaskulären Orientierungspunkten abgebildet werden, um denselben Bildgebungsbereich zu lokalisieren (Abbildung 3). Die Verwendung einer klaren Gelimmersion in Kombination mit Deckglas für diesen Zweck wurde zuvor auf eine Reihe von Verfahren angewendet, darunter die Visualisierung der Netzhaut für die subretinale Injektion, laserinduzierte Netzhautverletzungsmodelle und Fundusbildgebung20,21,22.

Die Anatomie des Auges stellt die In-vivo-Bildgebung vor einzigartige Herausforderungen, da die hohe optische Leistung der Maushornhaut und -linse die direkte Abbildung durch die Pupille ohne Korrektur behindert. Mehrere andere In-vivo-Bildgebungsverfahren beruhen auf der Verwendung einer plankonkaven Kontaktlinse zur Korrektur der vorderen Optik des Mausauges 7,17,18,19. Mit nur optischer Korrektur an der Hornhaut führt die hohe optische Leistung der Mauslinse zu einer unvermeidlichen Menge an Parallaxe, insbesondere von Strukturen im peripheren Scanfeld, die sich als Dehnungs- und Translationsbewegung in der X-Y-Dimension auf verschiedenen Z-Ebenen manifestiert. Um bildparallaxenbedingte Verzerrungen in X- und Y-Dimensionen zu minimieren, ist es entscheidend, dass das Mausauge so ausgerichtet ist, dass die Tangentialebene zur Netzhaut im Bildgebungsbereich senkrecht zum Lichtweg des Mikroskops steht. Der hier beschriebene Aufbau ist förderlich für eine präzise Manipulation des Augenwinkels, um diese Ausrichtung zu erreichen. Ein verstellbarer Mauskopfhalter, der eine Drehung entlang zweier Achsen ermöglicht, ermöglicht eine einfache manuelle Einstellung des Augenwinkels, während der Experimentator durch die Z-Dimension scrollt, um die Parallaxe zu minimieren. Diese Neigung umgeht auch den Feldstoppeffekt der Pupille, um größere Bereiche der Netzhaut abbilden zu können. Die Zurückhaltung des Kopfhalters reduziert auch Bewegungsartefakte, die durch die Atmung verursacht werden, erheblich.

Es muss darauf geachtet werden, dass die Klarheit des Mausauges erhalten bleibt, da sich die Bildqualität mit der Trübung während der kontinuierlichen Bildgebung verschlechtert. Häufiges erneutes Auftragen von Gleitgel während der Bildgebung und Salbenauftrag nach jeder Bildgebungssitzung helfen, das Auge vor dem Austrocknen und der Entwicklung von Trübungen zu schützen. Einige Hornhauttrübungen lösen sich nach 24-48 h spontan auf. Die Verwendung von klarem Gel und Deckglas, wie in diesem Protokoll beschrieben, bietet eine ähnliche Bildqualität und Aberrationskorrektur wie eine Kontaktlinse7 und ermöglicht gleichzeitig einfachere Anpassungen des Augenwinkels, ohne dass das Deckglas neu ausgerichtet werden muss. Darüber hinaus versorgt das Gel das Auge kontinuierlich mit Feuchtigkeit, so dass akute Bildgebungssitzungen von bis zu mehreren Stunden durchgeführt werden können. Da das Deckglas die Hornhaut nicht berührt, verursacht es eine minimale Reizung des Auges, die die optische Klarheit bei wiederholten Bildgebungssitzungen beeinträchtigen kann.

Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist die Tatsache, dass optische Aberrationen nicht vollständig korrigiert werden. Während dies die axiale Auflösung aufgrund der schweren Parallaxe stark verringert, können quantitative Messungen des Somas in Einzelbildebenen durchgeführt werden. Es sollte beachtet werden, dass, da die Fluoreszenzsignalintensität von retinalen Neuronen von der Probenausrichtung mit dieser Methode abhängt, Anregungs- und Emissionsratiometrie-basierte Sensoren besser für Experimente geeignet sind, bei denen Proben chronisch über verschiedene Bildgebungssitzungen hinweg verglichen werden. Ein Ansatz zur Korrektur optischer Aberrationen auf Systemebene ist die adaptive Optik, die eine subzelluläre Auflösung in der Netzhautermöglicht 8,9,14,21. Die adaptive Optik erfordert jedoch hochspezialisierte Geräte und umfangreiches Know-how.

Alternative Ansätze zur Zwei-Photonen-in-vivo-Netzhautbildgebung sind die konfokale Mikroskopie oder die Ophthalmoskopie6. Der hier vorgestellte Ansatz sollte leicht auf Weitfeld- oder Konfokalmikroskopie übertragbar sein. Die Einzelphotonen-Bildgebung ist möglicherweise robuster und birgt ein geringeres Risiko, die Netzhaut aufgrund der hohen Energie des Zwei-Photonen-Lasers zu schädigen, der erforderlich ist, um einen effizienten Zwei-Photonen-Effekt durch die Hornhaut und die Augenlinse zu erzielen. Um Zwei-Photonen-Laserschäden zu vermeiden, sollte die Schwelle für die maximale Laserleistung empirisch bestimmt werden, indem die gesamte Netzhaut nach Abschluss der bildgebenden Experimente untersucht und Zelltypen in den abgebildeten Schichten immungefärbt werden. In dem hier vorgestellten System wurden RGCs mit dem Pan-RGC-Marker, Rbpms, markiert, und die Dichten waren bis zu 45 mW Abbildungsleistung normal, während 55 mW einen signifikanten Verlust von RGCs verursachten (nicht gezeigt).

Ein Nachteil der Einzelphotonen-Bildgebung ist die Tatsache, dass dieser Ansatz die nativen visuellen Schaltkreise der Netzhaut im Vergleich zur Zwei-Photonen-Bildgebung sehr stark stimuliert23. Frühere Experimente mit Netzhaut-Wholemounts oder Augenmuschelpräparaten haben gezeigt, dass Zwei-Photonen-Laserscanning eine Schaltkreisaktivierung hervorruft, die weitgehend transient ist24. Hier zeigt die Abbildung der RGC-Aktivität mit dem Ca 2+ Sensor Twitch2b, dass der Beginn des Laserscans Ca 2+ Erhöhungen induziert, die bei den meisten RGCs im Laufe von5-20 s zum Ausgangswert zurückkehren (Abbildung 8). Da die Laserleistung in diesem Protokoll im Bereich früherer Experimente liegt, die eine in vivo retinale Lichtantwort 8berichteten, ist die derzeit beschriebene Methode wahrscheinlich für Aufzeichnungen der Schaltungsaktivität in der Netzhaut geeignet. Solche Überlegungen sind wichtig für Experimente, die durch Schaltungsaktivität beeinflusst werden können.

Dieses Protokoll demonstriert die In-vivo-Bildgebung von zwei Arten von Netzhautneuronen, RGCs und Amakrinzellen. Eine ähnliche Markierung anderer wichtiger Zelltypen kann erreicht werden, einschließlich horizontaler Zellen (Cx57-Cre 25), bipolarer Zellen (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), Zapfenphotorezeptoren (S- oder M-opsin-Cre 28), Stäbchen-Photorezeptoren (Nrl-Cre 29), Müller-Glia (Foxg1-Cre 26) und Perizyten (NG2-DsRed9). Transgene Mäuse sind auch verfügbar, um diskrete Untergruppen von RGCs zu markieren (z. B. KCNG4-Cre für αRGCs30; OPN4-Cre für ipRGCs31; JAM-B-CreER für J-RGCs 32) und Amakrinzellen (z.B. ChAT-Cre für Starburst-Amakrinzellen26 und Neuropeptid-Promotortreiber für verschiedene Amakrinzell-Subtypen 3,34). Virale Vektoren können verwendet werden, um spezifische Zellpopulationen anstelle von transgenen Mäusen anzugreifen. Intravitreale Injektionen von AAV2 mit einem ubiquitären CAG-Promotorelement markieren fast ausschließlich RGCs, Amakrinzellen und horizontale Zellen25. Die Kombination des modifizierten AAV2.7m8-Y444F-Kapsids mit einem konstruierten mGluR6-Promotorkonstrukt ermöglicht eine breite Markierung von ON-Bipolarzellen35. Subretinale Injektionen von AAV führen zu einer Anreicherung der Photorezeptoren, wobei der Serotyp AAV2/5 die höchste Transduktionseffizienz aufweist36. Shh10, ein modifiziertes AAV6-Kapsidprotein, gepaart mit glialen fibrillären sauren Proteinpromotorelementen, wurde spezifisch für Müller-Glia37 nachgewiesen.

Die Fähigkeit, Zellen im zentralen Nervensystem mit einem vollständig nicht-invasiven Ansatz zu beobachten, kann genutzt werden, um sowohl grundlegende Eigenschaften neuronaler Schaltkreise8 als auch Mechanismen der Neurodegeneration 3,4,5,6,38 zu untersuchen. Viele Erblindungskrankheiten zielen auf zelluläre Populationen in der Netzhaut ab, und In-vivo-Bildgebungsansätze bei Mäusen wurden verwendet, um Sehnervenverletzungen 1,3,4, Makuladegeneration13, Schlaganfall5, Glaukom 2,6 und Uveitis7 zu untersuchen. Darüber hinaus manifestieren sich viele neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems in der Netzhaut, darunter Alzheimer-Krankheit39, Multiple Sklerose40 und Parkinson-Krankheit41. Daher kann diese leicht zugängliche Technik für die In-vivo-Bildgebung der Netzhaut als Werkzeug zur Untersuchung einer breiten Palette neurodegenerativer Erkrankungen eingesetzt werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award an P.R.W. und ein uneingeschränkter Zuschuss an die Abteilung für Augenheilkunde und visuelle Wissenschaften an der Washington University School of Medicine in St. Louis), National Glaucoma Research (ein Programm der BrightFocus Foundation) und das McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology unterstützt. Z.W. wird durch einen Institutional National Research Service Award T32 EY013360 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom Hope Center Viral Vectors Core an der Washington University School of Medicine unterstützt.

Materials

#1.5 coverslip ThermoFisher 152440 Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL glass syringe Hamilton 80950 22G cemented needle
Adeno-associated virus (AAV2) Hope Center Viral Core NA
Anesthesia Air Pump RWD Life Science R510-30
Atropine Sigma A0132 For pupil dilator solution
Basic Small Animal Anesthesia Device RWD Life Science R500IE
Borosilicate glass capillary Sutter B150-86-10 Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm
CFP/YFP filter cube Chroma custom 480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex – Two channel PMT detection unit Scientifica S-MPLG-1002
Circulating heating pump Braintree Scientific tp-700 Set to 37 °C
Cling film VWR 10713-916
Compact Filter Holder ThorLabs DH1 Holds coverslip over mouse eye
Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) The Jackson Laboratory 005582
DAQ controller chassis National Instruments PXIe-1073
Data acquisition device National Instruments BNC-2090A
Evans Blue dye Fisher Scientific AAA1677409
FPGA module with digitizer National Instruments NI-5734
Gas Evacuation Apparatus RWD Life Science R546W
GenTeal Severe lubricant eye gel   Alcon (from local pharmacy) For use during imaging
GFP/Red filter cube Chroma custom 535/30, 560 long pass, 605/70
Heating pad McKesson Medical and Surgical 190147
HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell Scientifica S-MP-101080
HyperScope Main module Scientifica S-MP-100466
HyperScope Scan Path Scientifica S-MP-100406
HyperScope X galvo Module Scientifica MP-100443
ImageJ Fiji software Freeware
Isoflurane Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) RWD Life Science R510-31
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) RWD Life Science R510-31S
ketamine HCl (100 mg/mL) Vedco NDC 50989-161-06
M32 to M26 adapter ThorLabs M32M26S
MaiTai GUI software Spectra-Physics NA
MATLAB software MathWorks NA R2015b
meloxicam (5 mg/mL) Boehringer Ingelheim NDC 0010-6013-01 Analgesic
Micorscope Objective Edmund Optics 46-404 Mitutoyo WE715042319
micropipette puller Sutter Flaming/Brown Model P-97
Mineral oil Fisher BP2629-1
Mini bulldog hemostatic clamp Fine Science Tools 18053-28
Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD McMaster Carr 1883T1
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD McMaster Carr 1883T4
Mouse head holder Narishige SGM-4
No. 5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
Optic Posts 1/2" ThorLabs TR3-P5
Optical power meter kit ThorLabs PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery Scientifica COO-LED3ULLGs
Phenylephrine hydrochloride Sigma P6126 For pupil dilator solution
Pockels cell Conoptics 350-80-02
Pockels cell amplifier Conoptics Model 302RM
Proparacaine hydrochloride Sigma 1571001 For eye immobilization
Red & Far Red short pass filter Cube Chroma custom 560 short pass
Rotating 1/2" post clamp ThorLabs SWC
ScanImage package Vidrio Technologies Freeware Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB
sodium chloride solution, sterile (0.9%) Fresenius Kabi NDC 63323-186-01
Stereomicroscope Leica S9 E
Tabletop centrifuge Oxford Benchmate C8
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment Zoetisus NA For use after intravitreal injection
ThermoRack cooling system Solid State Cooling Systems ThermoRack 401 Set to 20 °C
Ultrafast Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016962
VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016963
VivoScope for In Vivo Imaging Scientifica S-MPVS-1200-00P
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment Stye NA For use after imaging
xylazine HCl (20 mg/mL) Akorn NDC 59399-110-20
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Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (168), e61970, doi:10.3791/61970 (2021).
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