JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

דגימה ועיבוד צחצוח אף באמצעות מיקרוסקופ וידאו ריסני דיגיטלי במהירות גבוהה – התאמה למגפת הקורונה

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

כדי להבטיח ניתוח פונקציונלי ריסוני מוצלח ואיכותי לאבחון PCD, שיטה מדויקת וזהירה לדגימת אפיתל נשימתי ועיבודו היא חיונית. כדי להמשיך לספק שירות אבחון PCD במהלך מגיפת COVID-19, פרוטוקול מיקרוסקופ הווידאו הריסי עודכן כדי לכלול אמצעי בקרת זיהום מתאימים.

Abstract

דיסקינזיה ריסנית ראשונית (PCD) היא סיליופתיה גנטית, המובילה למחלה אוטוסינופולמונרית משמעותית. אבחון PCD לעתים קרובות מתפספס או מתעכב בגלל אתגרים עם שיטות אבחון שונות. מיקרוסקופ וידאו ריסני, באמצעות מיקרוסקופ וידאו דיגיטלי במהירות גבוהה (DHSV), אחד מכלי האבחון עבור PCD, נחשב לשיטה האופטימלית לביצוע ניתוח פונקציונלי ריסני (CFA), הכולל ניתוח תדירות פעימות ריסניות (CBF) ודפוס פעימות (CBP). עם זאת, ל-DHSV אין נוהל הפעלה סטנדרטי שפורסם לעיבוד וניתוח דגימות. הוא משתמש גם באפיתל נשימתי חי, נושא משמעותי בבקרת זיהומים במהלך מגיפת COVID-19. כדי להמשיך לספק שירות אבחון במהלך משבר בריאותי זה, פרוטוקול מיקרוסקופ הווידיאו הריסי הותאם כך שיכלול אמצעי בקרת זיהום נאותים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מתוקן לדגימה ועיבוד מעבדה של דגימות נשימה ריסניות, תוך הדגשת התאמות שנעשו כדי לעמוד באמצעי בקרת הזיהום של COVID-19. מתוארות תוצאות מייצגות של CFA מדגימות צחצוח אף שהתקבלו מ -16 נבדקים בריאים, שעובדו ונותחו על פי פרוטוקול זה. אנו גם ממחישים את החשיבות של השגה ועיבוד של רצועות אפיתל באיכות אופטימלית, שכן דגימות שאינן עומדות בקריטריונים לבחירת איכות מאפשרות כעת CFA, מה שעלול להפחית את אמינות האבחון ואת היעילות של טכניקה זו.

Introduction

דיסקינזיה ריסנית ראשונית (PCD) היא סיליופתיה תנועתית הטרוגנית תורשתית, שבה ריסונים נשימתיים הם נייחים, איטיים או דיסקינטיים, מה שמוביל לפגיעה בסילוק הליחה ולמחלה אוטו-סינו-פולמונרית כרונית 1,2,3,4. הביטויים הקליניים של PCD הם שיעול רטוב כרוני וגודש כרוני באף החל מינקות מוקדמת, זיהומים חוזרים או כרוניים בדרכי הנשימה העליונות והתחתונות המובילים לברונכיאקטזיס, ודלקת אוזניים חוזרת או כרונית וסינוסיטיס 5,6,7. כמחצית מחולי PCD מציגים פגמים צדדיים באיברים כגון situs inversus או situs ambiguus. חלק מהחולים מציגים גם בעיות פוריות עקב זרע לא תנועתי אצל גברים וריסים תנועתיים בחצוצרות אצל נשים 1,2,8. PCD הוא נדיר, אך השכיחות קשה להגדרה, ונעה בין 1:10,000 ל-1:20,000 9,10. עם זאת, השכיחות האמיתית של PCD נחשבת גבוהה יותר בשל קשיים באבחון והיעדר חשד קליני. הסימפטומים של PCD מחקים ביטויים נשימתיים נפוצים של מצבים נשימתיים חריפים או כרוניים אחרים, והאתגרים האבחנתיים של אישור האבחנה ידועים היטב, מה שמוביל לטיפול ומעקב לקויים 2,5,9,11.

מיקרוסקופ וידאו ריסני, באמצעות מיקרוסקופ וידאו דיגיטלי במהירות גבוהה (DHSV), הוא אחד מכלי האבחון עבור PCD 4,8,12,13. DHSV נחשבת לשיטה האופטימלית לביצוע ניתוח פונקציונלי ריסני (CFA), הכולל ניתוח תדירות פעימות ריסניות (CBF) ותבנית פעימות (CBP) 2,14,15,16. DHSV משתמש באפיתל נשימתי חי, המתקבל בדרך כלל מצחצוח אף13.

לאור התפרצות COVID-19 הנוכחית, אישור של אבחנה PCD חשוב כעת עוד יותר מכיוון שהראיות מצביעות על כך שמחלות נשימה בסיסיות עלולות להוביל לתוצאות גרועות יותר לאחר הידבקות ב- COVID-1917,18. שירות אבחון PCD בטוח ויעיל במהלך המגפה הנוכחית יאפשר גם לחולי PCD מאומתים ליהנות מאמצעי הגנה נוספים, בהשוואה לאוכלוסייה הכללית19.

העברת COVID-19 מתרחשת בעיקר באמצעות התפשטות טיפתית20. פוטנציאל גבוה של העברה מחולים אסימפטומטיים (או סימפטומטיים מינימליים) מוצע על ידי עומס נגיפי גבוה בדגימת אף20. בנוסף, אם חלקיקים נגיפיים הופכים לאירוסוליים, הם נשארים באוויר לפחות 3 שעות21. לכן, עובדי רפואה נשימתית נחשפים למאגר גבוה של עומס נגיפי בעת ביצוע טיפול קליני ואיסוף דגימות לטכניקות אבחון22. יתר על כן, מניפולציה של דגימות נשימה חיות חושפת את הטכנאי לזיהום COVID-19. בעוד שהמלצות מומלצות לרופאים נשימתיים ומנתחי אף אוזן גרון המטפלים בחולי COVID-19 מיושמות23, חסרות המלצות לביצוע DHSV במהלך מגיפת COVID-19.

על מנת להמשיך ולספק שירות אבחון PCD, תוך הבטחת בטיחותם של עובד הבריאות (ביצוע איסוף דגימות) והטכנאי (ביצוע עיבוד דגימות), היה צורך להתאים את פרוטוקול מיקרוסקופ הווידאו הריסי במהלך מגפת הקורונה. הטכניקה של videomicroscopy ciliary מוגבל כיום לשירות מחקר ומרכזי אבחון מיוחדים, כמו CFA דורש הכשרה רבה וניסיון. יתר על כן, כיום, קיים מחסור בסטנדרטיזציה ובנוהל הפעלה מדויק לעיבוד וניתוח דגימות באמצעות DHSV 4,13.

מטרת מאמר זה היא לתאר נהלי פעולה סטנדרטיים עבור DHSV, תוך התייחסות מיוחדת לאמצעי בקרת זיהום ובטיחות בעת דגימה ועיבוד אפיתל אף חי. זה יאפשר אבחון וטיפול PCD באיכות גבוהה להמשיך, למרות התפרצות COVID-19 הנוכחית.

Protocol

האישור התקבל מוועדת האתיקה של בית החולים בליאז’ ומהמחלקה האוניברסיטאית להיגיינה והגנה על הבריאות בעבודה. 1. דגימת אפיתל ריסני נשימתי יש לוודא שהנבדקים נקיים מזיהום במשך 4-6 שבועות לפחות, וללא תרופות באף ובשאיפה, לפני הדגימה. הכינו תוספת להכנת M199: תוספת תרבית תאים ב?…

Representative Results

כדי להמחיש את יעילות הטכניקה, אנו מציגים את תוצאות CFA בסדרה של 16 מתנדבים בוגרים בריאים (5 גברים, טווח הגילאים 22-54 שנים). דגימות צחצוח אף מ -14 (4 גברים, טווח הגילאים 24-54 שנים) מתוך סך של 16 מתנדבים סיפקו מספיק קצוות אפיתל מתאימים שעמדו בקריטריוני הבחירה הדרושים לביצוע CFA. מתוך 14 דגימ?…

Discussion

מאמר זה נועד לספק נוהל הפעלה סטנדרטי עבור CFA באמצעות דגימות צחצוח האף, עם התאמות שבוצעו לשיקולי בקרת זיהום מתאימים במהלך מגיפת COVID-19. אבחון PCD הוא מאתגר, וכיום דורש פאנל של בדיקות אבחון שונות, על פי המלצה בינלאומית, כולל מדידת תחמוצת החנקן באף, CFA באמצעות DHSV, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי ריסני באמצ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לז’אן-פרנסואה פאפון, ברונו לואי, אסטל אסקודיה ולכל חברי הצוות של מרכז אבחון PCD בפריז-אסט על זמינותם וקבלת הפנים הלבבית במהלך הביקור במרכז אבחון ה- PCD שלהם, והחילופים הרבים. אנו מודים גם לרוברט הירסט ולכל חברי הצוות במרכז PCD בלסטר על קבלת הפנים והזמן, העצות והמומחיות.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image