JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

أخذ عينات الأنف بالفرشاة ومعالجتها باستخدام المجهر الرقمي عالي السرعة بالفيديو الهدبي - التكيف مع جائحة COVID-19

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

لضمان تحليل وظيفي هدبي ناجح وعالي الجودة لتشخيص PCD ، من الضروري اتباع طريقة دقيقة ودقيقة لأخذ عينات ظهارة الجهاز التنفسي ومعالجتها. لمواصلة تقديم خدمة تشخيص PCD أثناء جائحة COVID-19 ، تم تحديث بروتوكول الفحص المجهري الفيديوي الهدبي ليشمل تدابير مكافحة العدوى المناسبة.

Abstract

خلل الحركة الهدبية الأولي (PCD) هو اعتلال هدبي وراثي متحرك ، مما يؤدي إلى مرض رئوي رئوي كبير. غالبا ما يتم تفويت تشخيص PCD أو تأخيره بسبب التحديات مع طرق التشخيص المختلفة. يعتبر الفحص المجهري بالفيديو الهدبي ، باستخدام الفحص المجهري الرقمي عالي السرعة (DHSV) ، وهو أحد أدوات تشخيص PCD ، الطريقة المثلى لإجراء التحليل الوظيفي الهدبي (CFA) ، الذي يتألف من تردد النبض الهدبي (CBF) وتحليل نمط النبض (CBP). ومع ذلك ، تفتقر DHSV إلى إجراءات تشغيل موحدة ومنشورة لمعالجة العينات وتحليلها. كما يستخدم ظهارة الجهاز التنفسي الحية ، وهي مشكلة كبيرة في مكافحة العدوى أثناء جائحة COVID-19. ولمواصلة تقديم خدمة تشخيصية خلال هذه الأزمة الصحية، تم تكييف بروتوكول الفحص المجهري الهدبي بالفيديو ليشمل تدابير كافية لمكافحة العدوى.

نصف هنا بروتوكولا منقحا لأخذ العينات والمعالجة المختبرية لعينات الجهاز التنفسي المهدبة، مع تسليط الضوء على التعديلات التي تم إجراؤها للامتثال لتدابير مكافحة عدوى COVID-19. يتم وصف النتائج التمثيلية ل CFA من عينات تنظيف الأنف بالفرشاة التي تم الحصول عليها من 16 شخصا صحيا ، والتي تمت معالجتها وتحليلها وفقا لهذا البروتوكول. نوضح أيضا أهمية الحصول على شرائط هدبية ظهارية ذات جودة مثالية ومعالجتها ، حيث أن العينات التي لا تفي بمعايير اختيار الجودة تسمح الآن ب CFA ، مما قد يقلل من موثوقية التشخيص وكفاءة هذه التقنية.

Introduction

خلل الحركة الهدبية الأولي (PCD) هو اعتلال هدبي متحرك غير متجانس موروث ، تكون فيه الأهداب التنفسية ثابتة أو بطيئة أو خلل الحركة ، مما يؤدي إلى ضعف إزالة الغشاء المخاطي الهدبي ومرض الأذن والأذن والرئةالمزمن 1،2،3،4. المظاهر السريرية ل PCD هي السعال الرطب المزمن واحتقان الأنف المزمن الذي يبدأ في مرحلة الطفولة المبكرة ، والتهابات الجهاز التنفسي العلوي والسفلي المتكررة أو المزمنة التي تؤدي إلى توسع القصبات ، والتهاب الأذن الوسطى المتكرر أو المزمن والتهاب الجيوب الأنفية5،6،7. يعاني ما يقرب من نصف مرضى PCD من عيوب جانبية في الأعضاء مثل situs inversus أو situs ambiguus. يعاني بعض المرضى أيضا من مشاكل العقم بسبب الحيوانات المنوية غير المتحركة لدى الرجال والأهداب غير المتحركة في قناة فالوب لدى النساء1،2،8. PCD نادر ، ولكن من الصعب تحديد معدل الانتشار ، ويتراوح من 1: 10,000 إلى 1: 20,000 9,10. ومع ذلك ، يعتقد أن الانتشار الحقيقي ل PCD أعلى بسبب الصعوبات في التشخيص ونقص الشك السريري. تحاكي أعراض PCD المظاهر التنفسية الشائعة لحالات الجهاز التنفسي الحادة أو المزمنة الأخرى ، والتحديات التشخيصية لتأكيد التشخيص معروفة جيدا ، مما يؤدي إلى عدم كفاية العلاج والمتابعة2،5،9،11.

يعد الفحص المجهري بالفيديو الهدبي ، باستخدام الفحص المجهري الرقمي عالي السرعة (DHSV) ، أحد أدوات التشخيص ل PCD4،8،12،13. يعتبر DHSV الطريقة المثلى لإجراء التحليل الوظيفي الهدبي (CFA) ، والذي يتألف من تردد النبض الهدبي (CBF) وتحليل نمط النبض (CBP)2،14،15،16. يستخدم DHSV ظهارة الجهاز التنفسي الحية ، والتي يتم الحصول عليها عادة من تنظيف الأنفبالفرشاة 13.

في ضوء تفشي COVID-19 الحالي ، أصبح تأكيد تشخيص PCD الآن أكثر أهمية حيث تشير الأدلة إلى أن مرض الجهاز التنفسي الأساسي قد يؤدي إلى نتائج أسوأ بعد عدوى COVID-1917,18. كما ستسمح خدمة تشخيص PCD الآمنة والفعالة خلال الجائحة الحالية لمرضى PCD المؤكدين بالاستفادة من تدابير وقائية إضافية ، مقارنة بعامة السكان19.

يحدث انتقال COVID-19 بشكل أساسي من خلال انتشار القطيرات20. تشير الاحتمالية العالية للانتقال من المرضى الذين لا تظهر عليهم أعراض (أو الحد الأدنى من الأعراض) من خلال الحمل الفيروسي العالي في عينة الأنف20. بالإضافة إلى ذلك ، إذا أصبحت الجسيمات الفيروسية رذاذا ، فإنها تبقى في الهواء لمدة 3 ساعات على الأقل21. لذلك ، يتعرض العاملون في مجال الرعاية الصحية التنفسية لخزان عال من الحمل الفيروسي أثناء أداء الرعاية السريرية وجمع العينات لتقنيات التشخيص22. علاوة على ذلك ، فإن التلاعب بعينات الجهاز التنفسي الحية يعرض الفني للتلوث ب COVID-19. بينما يتم تنفيذ توصيات أفضل الممارسات لأطباء الجهاز التنفسي وجراحي الأنف والأذن والحنجرة الذين يعتنون بمرضى COVID-1923 ، هناك نقص في التوصيات لأداء DHSV أثناء جائحة COVID-19.

من أجل الاستمرار في تقديم خدمة تشخيص PCD ، مع ضمان سلامة عامل الرعاية الصحية (أداء جمع العينات) والفني (إجراء معالجة العينات) ، كان لا بد من تكييف بروتوكول الفحص المجهري بالفيديو الهدبي أثناء جائحة COVID-19. تقتصر تقنية الفحص المجهري بالفيديو الهدبي حاليا على خدمة البحث ومراكز التشخيص المتخصصة ، حيث يتطلب CFA تدريبا وخبرة مكثفة. علاوة على ذلك ، يوجد حاليا نقص في التوحيد القياسي وإجراءات التشغيل الدقيقة لمعالجة العينات وتحليلها باستخدام DHSV 4,13.

الهدف من هذه الورقة هو وصف إجراءات التشغيل القياسية ل DHSV ، مع الإشارة بشكل خاص إلى تدابير مكافحة العدوى والسلامة عند أخذ العينات ومعالجة ظهارة الأنف الحية. سيسمح ذلك باستمرار تشخيص ورعاية PCD عالية الجودة ، على الرغم من تفشي COVID-19 الحالي.

Protocol

تم الحصول على الموافقة من لجنة أخلاقيات مستشفى لييج وأعضاء هيئة التدريس وإدارة الجامعة للنظافة وحماية الصحة في العمل. 1. أخذ عينات من ظهارة الجهاز التنفسي مهدبة تأكد من خلو الأشخاص من العدوى لمدة 4-6 أسابيع على الأقل ، وخالية من الأدوية الأنفية والمستنشقة ، قبل أخذ العي?…

Representative Results

لتوضيح كفاءة التقنية ، نقدم نتائج CFA في سلسلة من 16 متطوعا بالغا يتمتعون بصحة جيدة (5 ذكور ، الفئة العمرية 22-54 عاما). قدمت عينات تنظيف الأنف بالفرشاة من 14 (4 ذكور ، الفئة العمرية 24-54 سنة) من إجمالي 16 متطوعا ما يكفي من الحواف الظهارية المناسبة التي استوفت معايير الاختيار اللازمة لأ…

Discussion

تهدف هذه الورقة إلى توفير إجراء تشغيل قياسي ل CFA باستخدام عينات تنظيف الأنف بالفرشاة ، مع إجراء تعديلات لاعتبارات مكافحة العدوى المناسبة أثناء جائحة COVID-19. يعد تشخيص PCD أمرا صعبا ، ويتطلب حاليا مجموعة من الاختبارات التشخيصية المختلفة ، وفقا للتوصية الدولية ، بما في ذلك قياس أكسيد النيتريك ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر جان فرانسوا بابون وبرونو لويس وإستل إسكودييه وجميع أعضاء فريق مركز تشخيص PCD في باريس الشرقية على تواجدهم وترحيبهم الحار خلال الزيارة إلى مركز تشخيص PCD الخاص بهم ، والتبادلات العديدة. كما نشكر روبرت هيرست وجميع أعضاء الفريق في مركز PCD في ليستر على ترحيبهم ووقتهم ونصائحهم وخبراتهم.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image