Inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra
Summary
Este protocolo no invasiva induce hiperglucemia en el pez cebra durante un tiempo de hasta 8 semanas. Usando este protocolo, un estudio profundizado de los efectos nocivos de la hiperglucemia puede ser hecho.
Abstract
Los peces cebra(Danio rerio)son un excelente modelo para investigar los efectos de la hiperglucemia crónica, un sello distintivo de la Diabetes Mellitus Tipo II (DM2). Este protocolo alternativo de inmersión es un método no invasivo y gradual para inducir la hiperglucemia hasta por ocho semanas. Los peces cebra adultos se exponen alternativamente al azúcar (glucosa) y al agua durante 24 horas cada uno. El pez cebra comienza el tratamiento en una solución de glucosa al 1% durante 2 semanas, luego una solución al 2% durante 2 semanas y, finalmente, una solución al 3% durante las 4 semanas restantes. En comparación con los controles tratados con agua (estrés) y manitol (osmóticos), el pez cebra tratado con glucosa tiene niveles de azúcar en la sangre significativamente más altos. El pez cebra tratado con glucosa muestran niveles de azúcar en la sangre de 3 veces el de los controles, lo que sugiere que después de cuatro y ocho semanas se puede lograr la hiperglucemia. La hiperglucemia continua fue asociada a la proteína ácida fibrilosa glial creciente (GFAP) y a los niveles nucleares crecientes de la Kappa B (N-F-kB) del factor en retina y a respuestas fisiológicas disminuidas, así como los déficits cognoscitivos que sugerían que este protocolo se puede utilizar para modelar complicaciones de la enfermedad.
Introduction
El pez cebra(Danio rerio)se está convirtiendo rápidamente en un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar tanto la enfermedad como la cognición1. La facilidad de la manipulación genética y la transparencia embrionaria a través de las primeras etapas del desarrollo, los convierten en un candidato principal para estudiar enfermedades humanas con una base genética conocida. Por ejemplo, el pez cebra se ha utilizado para estudiar el síndrome de Holt-Oram, las cardiomiopatías, la enfermedad renal glomerulocística, la distrofia muscular y la diabetes mellitus (DM) entre otras enfermedades1. Además, el modelo de pez cebra es ideal debido al pequeño tamaño de la especie, la facilidad de mantenimiento y la alta fecundidad2,3.
El páncreas del pez cebra es anatómica y funcionalmente similar al páncreas demamíferos 4. Por lo tanto, las características únicas de tamaño, alta fecundidad y estructuras endocrinas similares hacen del pez cebra un candidato adecuado para estudiar las complicaciones relacionadas con la DM. En el pez cebra, existen dos métodos experimentales utilizados para inducir la hiperglucemia prolongada que es característica de la DM: una afluencia de glucosa (modelado tipo 2) y el cese de la secreción de insulina (modelado tipo 1)5,6. Experimentalmente, para parar la secreción de la insulina, las β-células pancreáticas se pueden destruir químicamente usando las inyecciones del Streptozotocin (STZ) o del Alloxan. STZ se ha utilizado con éxito en roedores y pez cebra, dando lugar a complicaciones asociadas conla retinopatía 7,8,9,deterioro cognitivo10,y la regeneración de extremidades11. Sin embargo, en el pez cebra, las células β se regeneran después del tratamiento, haciendo que las “inyecciones de refuerzo” de STZ sean necesarias para mantener las condiciones diabéticas12. Alternativamente, el páncreas del pez cebra se puede extirpar6. Estos son procedimientos altamente invasivos, debido a las múltiples inyecciones, y un extenso tiempo de recuperación.
Inversamente, la hiperglucemia se puede inducir no invasor con la exposición a la glucosa exógena. En este protocolo, los peces se sumergen en una solución de glucosa altamente concentrada durante 24 horas5,13 o continuamente durante 2 semanas14,15,16. La glucosa exógena se toma por vía transdérmica, por ingestión, y /o a través de las branquias, lo que resulta en niveles elevados de azúcar en la sangre. Dado que esta técnica no invasiva no manipula directamente los niveles de insulina, no puede pretender inducir dm tipo 2. Sin embargo, se puede utilizar para examinar las complicaciones inducidas por la hiperglucemia, que es uno de los principales síntomas de la DM tipo 2.
Recientemente, el mutante de pez cebra pdx1-/- fue desarrollado mediante la manipulación del gen homeobox 1 pancreático y duodenal, un gen vinculado a la causa genética del tipo 2 DM en humanos. Usando este mutante, los investigadores han podido replicar la interrupción del desarrollo pancreático, el alto nivel de azúcar en la sangre y estudiar la retinopatía diabética inducida por hiperglucemia17,18.
En este papel, describimos un método no invasor de la inducción de la hiperglucemia que utilice un protocolo de la inmersión que se alterna. Este protocolo mantiene condiciones hyperglycemic por hasta 8 semanas con las complicaciones subsecuentes observadas. En resumen, los peces cebra adultos se colocan en una solución de azúcar durante 24 horas y luego en una solución de agua durante 24 horas. A diferencia de la inmersión continua en soluciones externas de glucosa, la alternancia de días entre el azúcar y el agua imita el aumento y la caída del azúcar en la sangre en la diabetes. Un protocolo de glucosa alterna, además, permite que la hiperglucemia sea inducida por períodos de tiempo más largos, ya que el pez cebra no es tan capaz de compensar las altas condiciones externas de glucosa. Como prueba del principio, proporcionamos los datos que muestran que la hiperglucemia inducida usando este protocolo altera química y fisiología retinianas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La diabetes es un problema nacional. Los estudios muestran que para 2030, se estima que 400 millones de personas tendrán algún tipo de diabetes. En modelos de roedores, la DM tipo 2 se estudia mediante manipulación genética. En ratas, las ratas grasas diabéticas de Zucker (ZDF), y las ratas grasas de Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), están proporcionando más información sobre los efectos del tipo – 2 DM10. Además, las dietas altas en grasas se han utilizado en roedores para inducir hip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a VPC, CJR y MCP por el desarrollo de este protocolo. EMM recibió apoyo financiero de la American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support para llevar a cabo esta investigación. Este trabajo también fue apoyado por un Premio Mellon de la Facultad de la Universidad Americana y la financiación a través de la American University College of Arts and Sciences (ambos a VPC).
Materials
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
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