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Neuroscience

Alternatives Eintauchen in Glukose, um eine verlängerte Hyperglykämie bei Zebrafischen zu erzeugen

Published: May 05, 2021
doi:
10.3791/61935
, , ,
1Department of Biology,American University, 2Center for Behavioral Neuroscience,American University, 3Department of Chemistry,American University

Summary

Dieses Protokoll induziert nichtinvasiv Hyperglykämie bei Zebrafischen für bis zu 8 Wochen. Mit diesem Protokoll kann eine eingehende Untersuchung der nebenwirkungen von Hyperglykämie durchgeführt werden.

Abstract

Zebrafische (Danio rerio) sind ein hervorragendes Modell, um die Auswirkungen der chronischen Hyperglykämie, einem Kennzeichen des Typ-II-Diabetes Mellitus (T2DM), zu untersuchen. Dieses alternative Immersionsprotokoll ist eine nichtinvasive, schrittweise Methode zur Induktion von Hyperglykämie für bis zu acht Wochen. Erwachsene Zebrafische werden abwechselnd 24 Stunden lang Zucker (Glukose) und Wasser ausgesetzt. Der Zebrafisch beginnt die Behandlung in einer 1% igen Glukoselösung für 2 Wochen, dann einer 2% igen Lösung für 2 Wochen und schließlich einer 3% igen Lösung für die restlichen 4 Wochen. Im Vergleich zu wasserbehandelten (Stress) und mannitolbehandelten (osmotischen) Kontrollen haben glukosebehandelte Zebrafische signifikant höhere Blutzuckerspiegel. Die mit Glukose behandelten Zebrafische zeigen blutzuckerwerte, die 3-mal so hoch sind wie die der Kontrollen, was darauf hindeutet, dass nach vier und acht Wochen hyperglykämie erreicht werden kann. Anhaltende Hyperglykämie war mit einem erhöhten Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) und einem erhöhten Kernfaktor Kappa B (NF-kB) in der Netzhaut und verminderten physiologischen Reaktionen sowie kognitiven Defiziten verbunden, die darauf hindeuten, dass dieses Protokoll zur Modellierung von Krankheitskomplikationen verwendet werden kann.

Introduction

Zebrafische (Danio rerio) werden schnell zu einem weit verbreiteten Tiermodell, um sowohl Krankheiten als auch Kognition zu untersuchen1. Die Leichtigkeit der genetischen Manipulation und die embryonale Transparenz durch die frühen Entwicklungsstadien machen sie zu einem erstklassigen Kandidaten, um menschliche Krankheiten mit einer bekannten genetischen Grundlage zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Zebrafische verwendet, um Holt-Oram-Syndrom, Kardiomyopathien, glomerulozystische Nierenerkrankungen, Muskeldystrophie und Diabetes mellitus (DM) unter anderenKrankheiten zuuntersuchen 1 . Darüber hinaus ist das Zebrafischmodell aufgrund der geringen Größe der Art, der Wartungsfreundlichkeit und der hohen Fruchtbarkeit2,3ideal.

Die Zebrafisch-Bauchspeicheldrüse ist sowohl anatomisch als auch funktionell der Säugetier-Bauchspeicheldrüse ähnlich4. So machen die einzigartigen Eigenschaften von Größe, hoher Fruchtbarkeit und ähnlichen endokrinen Strukturen Zebrafische zu einem geeigneten Kandidaten für die Untersuchung von DM-bedingten Komplikationen. Beim Zebrafisch gibt es zwei experimentelle Methoden, um die für DM charakteristische verlängerte Hyperglykämie zu induzieren: einen Zustrom von Glukose (Modellierung Typ 2) und die Beendigung der Insulinsekretion (Modellierung Typ 1)5,6. Um die Insulinsekretion zu stoppen, können Pankreas- β-Zellen experimentell entweder mit Streptozotocin (STZ) oder Alloxan-Injektionen chemisch zerstört werden. STZ wurde erfolgreich bei Nagetieren und Zebrafischen eingesetzt, was zu Komplikationen im Zusammenhang mit Retinopathie7,8,9, kognitivenBeeinträchtigungen10und Gliedmaßenregeneration11führte . Bei Zebrafischen regenerieren sich jedoch β-Zellen nach der Behandlung, was dazu führt, dass “Booster-Injektionen” von STZ notwendig sind, um diabetischeErkrankungen aufrechtzuerhalten 12. Alternativ kann die Bauchspeicheldrüse des Zebrafisches entfernt werden6. Dies sind sowohl hochinvasive Verfahren, aufgrund der mehrfachen Injektionen, als auch eine lange Erholungszeit.

Umgekehrt kann Hyperglykämie nichtinvasiv durch Exposition gegenüber exogener Glukose induziert werden. In diesem Protokoll werden Fische für 24 Stunden5,13 oder kontinuierlich für 2 Wochen 14,15, 16in eine hochkonzentrierte Glukoselösung getaunken. Exogene Glukose wird transdermal, durch Einnahme und/ oder über die Kiemen aufgenommen, was zu erhöhten Blutzuckerspiegeln führt. Da diese nicht-invasive Technik den Insulinspiegel nicht direkt manipuliert, kann sie nicht behaupten, Typ-2-DM zu induzieren. Es kann jedoch verwendet werden, um Komplikationen zu untersuchen, die durch Hyperglykämie induziert werden, die eines der Hauptsymptome von Typ 2 DM ist.

Vor kurzem wurde die Zebrafischmutante pdx1-/- durch Manipulation des Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox-1-Gens entwickelt, einem Gen, das mit der genetischen Ursache von Typ 2 DM beim Menschen verbunden ist. Mit dieser Mutante konnten Forscher Pankreasentwicklungsstörungen, hohen Blutzucker replizieren und Hyperglykämie-induzierte diabetische Retinopathieuntersuchen 17,18.

In diesem Artikel beschreiben wir eine nichtinvasive Hyperglykämie-Induktionsmethode, die ein alternierendes Immersionsprotokoll verwendet. Dieses Protokoll hält hyperglykämische Zustände für bis zu 8 Wochen aufrecht, wobei nachfolgende Komplikationen beobachtet werden. Kurz gesagt, erwachsene Zebrafische werden für 24 Stunden in eine Zuckerlösung und dann für 24 Stunden in eine Wasserlösung gelegt. Im Gegensatz zum kontinuierlichen Eintauchen in externe Glukoselösungen ahmt der Wechsel zwischen Zucker und Wasser den Anstieg und Abfall des Blutzuckers bei Diabetes nach. Ein alternierendes Glukoseprotokoll ermöglicht es zusätzlich, Hyperglykämie über längere Zeiträume zu induzieren, da die Zebrafische die hohen äußeren Glukosebedingungen nicht so gut kompensieren können. Als Beweis für das Prinzip liefern wir Daten, die zeigen, dass Hyperglykämie, die mit diesem Protokoll induziert wird, die Netzhautchemie und -physiologie verändert.

Protocol

Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der American University genehmigt. 1. Vorbereitung der Lösungstanks Erhalten Sie sechs Tanks, zwei für jede experimentelle Gruppe (Glukose, Mannit und Wasser). Kennzeichnen Sie einen der beiden Tanks als “Gehäusetank” (er wird den Fisch beherbergen) und beschriften Sie den anderen “Lösungstank” (er enthält die Lösung).HINWEIS: Die Mannitol-Behandlungsgruppe ist die osmotische Kontrolle, und die Wasseraufb…

Representative Results

Unter Verwendung dieses Protokolls (Abbildung 1) sind die Blutzuckerwerte sowohl nach 4- als auch nach 8-wöchiger Behandlung signifikant erhöht (Abbildung 2A), wobei hyperglykämie als 3x der Kontrollmittelwerte sowohl von wasserbehandelten als auch von Mannitol-behandelten Gruppen definiert ist. Wasserbehandelte Steuerungen werden täglich in und aus dem Wasser übertragen, um eine Stress- / Handhabungskontrolle zu bieten. Mannitol dient als osmotische Kontro…

Discussion

Diabetes ist ein bundesweites Problem. Studien zeigen, dass bis 2030 schätzungsweise 400 Millionen Menschen irgendeine Form von Diabetes haben werden. In Nagetiermodellen wird Typ 2 DM mittels genetischer Manipulation untersucht. Bei Ratten liefern die Zucker diabetischen Fettratten (ZDF) und die Otsuka Long-Evans Tokushima Fettratten (OLETF) weitere Informationen über die Wirkung von Typ 2 DM10. Darüber hinaus wurden fettreiche Diäten bei Nagetieren verwendet, um Hyperglykämie zu induzieren….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten VPC, CJR und MCP für die Entwicklung dieses Protokolls danken. EMM erhielt finanzielle Unterstützung vom American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support, um diese Forschung durchzuführen. Diese Arbeit wurde auch durch einen Mellon Award der American University Faculty und eine Finanzierung durch das American University College of Arts and Sciences (beide an VPC) unterstützt.

Materials

Airline Tubing petsmart 5291863 This can be used in the tank to circulate air
Airpump petsmart 5094984 This can be used in the tank to circulate air
Airstones petsmart 5149683 This can be used in the tank to circulate air
D-glucose Sigma G8270-5KG
D-mannitol Acros Organics AC125340050
Freestyle Lite Meter Amazon B01LMOMLTU
Freestyle Lite Strips Amazon B074ZN3H2Z
Net petsmart 5175115
Tanks Amazon B0002APZO4
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McCarthy, E., Rowe, C. J., Crowley-Perry, M., Connaughton, V. P. Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61935, doi:10.3791/61935 (2021).
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