Summary

Entrega directa de medicamentos al riñón a través de la arteria renal

Published: April 17, 2021
doi:

Summary

Este manuscrito describe un método para el parto selectivo a un solo riñón a través de un catéter colocado en la aorta abdominal infrarenal en el ratón.

Abstract

Existe la necesidad de inyecciones dirigidas para permitir una mayor y específica exposición renal para una evaluación eficiente de las dianas farmacológicas en el campo de la investigación renal. La acumulación de fármacos en ciertos órganos puede dar lugar a efectos adversos y no deseados, dependiendo de la naturaleza del inyector. Para minimizar el contagio y/o la acumulación en otros tejidos, el método descrito en el presente documento dirige la formulación al torrente sanguíneo de la arteria renal mediante la inserción de un catéter en la aorta infra renal, justo debajo de donde se ramifica en la arteria renal, lo que resulta en el riñón como órgano alcanzado por primera vez y la distribución de la formulación en todo el riñón.

Este manuscrito proporciona una descripción detallada del método, así como sus desafíos y dificultades. Guía al experimentador a ser hábil con este tipo de microcirugía que requiere precisión en condiciones estériles. La velocidad es crucial para minimizar la isquemia y practicar el procedimiento aumentará la probabilidad de inyecciones exitosas sin efectos adversos. Al modular el tiempo entre la inyección y la reperfusión, así como el volumen inyectado, se mitiga el riesgo de contagio a otros órganos.

Tenga en cuenta que esta técnica es adecuada para estrategias de dosificación única.

Introduction

En el campo de la investigación preclínica dentro de la industria farmacéutica, el desarrollo de modelos y métodos es parte del trabajo diario. Existe un creciente interés por la capacidad de dirigir fármacos a órganos específicos, o incluso compartimentos separados de un órgano, sin derrames/atrapamientos importantes, a través del torrente sanguíneo, en otros tejidos. Esto para permitir una mayor y específica exposición para la evaluación eficiente de las dianas farmacológicas en modelos de diferentes áreas de enfermedad 1,2,3,4.

Una forma común de suministrar sustancias es por rutas sistémicas (por ejemplo, a través de la vena de la cola) ya que es menos invasiva que el método descrito en este manuscrito. Sin embargo, la administración sistémica aumenta el riesgo de aumento del metabolismo o acumulación del compuesto en otros tejidos que el órgano objetivo previsto, al pasar por órganos filtrados como el pulmón, el hígado y el bazo 2,3,5. Además de no llegar al tejido destinado, esto potencialmente podría dar lugar a efectos adversos y/o no deseados, dependiendo de la naturaleza del inyector. Sólo moléculas muy pequeñas pasan los capilares de los órganos filtrantes y por lo tanto el parto dirigido es especialmente importante si se trabaja con moléculas más grandes 6.

Para minimizar el contagio y/o la acumulación de formulación inyectada, en otros tejidos, el método descrito en este documento dirige la formulación al torrente sanguíneo de la arteria renal a través de un catéter insertado en la aorta abdominal justo debajo de donde se ramifica en la arteria renal, lo que resulta en el riñón como órgano primero alcanzado. Otra ventaja con esta administración guiada es que se puede utilizar una dosis/volumen más bajo para alcanzar el mismo nivel de exposición que se logra a través de la administración sistémica 3.

Se han explorado otras vías de administración, por ejemplo, inyecciones a través de un catéter directamente en la arteria renal. En nuestras manos, se encontró que esto presentaba un mayor riesgo de no restaurar la circulación al riñón. El diámetro muy pequeño de la arteria renal (aproximadamente 0,35-0,55 mm de diámetro) hace que la incisión sea relativamente grande y represente un riesgo de obstrucción y/o embolia al cerrar el orificio de entrada. De acuerdo con nuestra experiencia daño relacionado isquémico al riñón a menudo ocurrió cuando se utiliza este método, y por lo tanto desarrollamos esta nueva forma de dirigirse con éxito al riñón mediante la inyección de sustancias a través de la incisión de la aorta más grande para dirigirse al riñón.

Hay técnicas similares que se están desarrollando en ratas que también manifiesta los desafíos y el riesgo de estenosis/trombosis trabajando con inyecciones directamente en la arteria renal 5. Esto apoya nuestros hallazgos ya que los vasos en ratones son aún más pequeños.

Este manuscrito y video describen, en detalle, cómo las inyecciones pueden dirigirse a la arteria renal en ratones a través de un catéter insertado en la aorta infrarenal, así como orientación sobre cómo superar las dificultades comunes en el procedimiento, trabajar de la manera más segura posible y así aumentar la reproducibilidad.

Protocol

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Regional de Ética Animal de Laboratorio de Gotemburgo, Suecia. 1. Atención preoperatoria Utilice técnicas estériles para evitar infecciones. Bajo anestesia (por ejemplo, isoflurano) y trabajando de la manera más aséptica posible, afeita el área de la cirugía y retira el pelaje con una crema para la depilación. Deje la crema durante alrededor de 1 minuto (máximo de 2 minutos para evitar quemaduras en la piel). Lave cuidadosamente con agua. Este primer paso se puede realizar preferiblemente 1-2 días antes de la cirugía para evitar el enfriamiento adicional del animal justo antes de la cirugía. Aplique lubricante oftálmico en los ojos para evitar la sequedad. Para evitar infecciones, lave el área quirúrgica con limpiador antiséptico de la piel y limpie la zona con desinfectante (clorhexidina) justo antes de la cirugía. analgesia Pre-dosis del animal con analgésicos si no es un procedimiento terminal: Buprenorfina (por ejemplo, temgesic) 0.05-0.1 mg/kg s.c.) anticoagulantes Utilice anticoagulantes para evitar coágulos sanguíneos: 10 UI de heparina a través de la vena de la cola justo antes de la cirugía (máximo 5 ml/kg). 2. Procedimiento quirúrgico Autoclave los instrumentos y utilice catéteres estériles. Lavarse con jabón y hibiscrub y usar una máscara facial, una red para el cabello y una bata quirúrgica estéril y guantes. Pida a una segunda persona que maneje a los animales y todas las tareas “sucias”. Para la anestesia, utilice isoflurano. Induzca la anestesia colocando el ratón en una caja de anestesia con un 5% de isoflurano. Después de la inducción, compruebe la profundidad de la anestesia comprobando los reflejos y la respiración. Durante la cirugía, coloque una máscara facial en el ratón para administrar una dosis de mantenimiento del 2% de isoflurano. Lave al animal con hibiscrub y clorhexidina antes de ponerse la mesa quirúrgica. Después de anestesiar, coloque el ratón en una almohadilla quirúrgica calentada en una posición supina y fije las extremidades superior e inferior a la almohadilla usando cinta adhesiva de baja tachuela. Asegúrese de que las extremidades superiores se mantengan en una posición normal para evitar la compresión pulmonar. Si es posible, utilice una fuente de calor no eléctrica.NOTA: Utilizamos anestesia por inhalación (por ejemplo, isoflurano) para ajustes más fáciles durante la cirugía. Cubre el ratón con envoltura de plástico (por ejemplo, Sello prensado) y realiza el trabajo con un microscopio quirúrgico. Proteja los tejidos del secado añadiendo constantemente solución salina al área de la cirugía. Esto también ayuda a mantener el tejido elástico y minimiza el riesgo de daño durante la realización de la cirugía. La solución salina debe estar alrededor de 37 °C para evitar el enfriamiento del animal. Después de abrir la cavidad abdominal con una incisión de línea media con fórceps y tijeras, utilice una compresa húmeda, doblada y plegada para empujar todos los demás órganos a un lado para obtener una buena vista sobre el área de la cirugía. Utilice retractores para tener una buena visión general del área de la cirugía (gancho contundente de 5 mm). Localice la aorta y el riñón izquierdo. Utilizando dos fórceps de microcirugía, limpie suavemente la aorta, tanto cranealmente (ver 2.10.1) como caudalmente (ver 2.10.2) del riñón, de los tejidos circundantes y coloque una ligadura debajo de él (6-0 seda). Tenga cuidado de no pellizcar ninguna estructura. Ábrete camino estirando suavemente y tirando de los tejidos, acercándote lo más posible a la arteria renal. Alrededor de los vasos hay varios nervios no fácilmente descubiertos. Tenga esto en cuenta ya que los nervios dañados pueden causar parálisis u otros problemas después de la operación. Cranealmente (arriba) del riñón, utilice esta ligadura para levantar la aorta para ocluir momentáneamente el flujo sanguíneo mientras realiza la inyección. En esta posición, justo encima de donde la arteria renal, las ramas aorta en la dirección opuesta (a los intestinos, ver Figura 1). Con el fin de evitar empujar la inyección de esta manera, poner la ligadura debajo de esta rama. Deje la ligadura sin tensión hasta que inicie el procedimiento de inyección. Caudalmente (abajo) el riñón, coloque la incisión cerca de donde las ramas aorta al riñón/arteria renal para evitar otras ramas potenciales. Caudalmente desde el riñón la aorta está muy cerca de la vena abdominal. Tenga mucho cuidado de no dañar la vena. inyección Cuando todas las ligaduras están en su lugar; primero estirar la parte inferior y, en segundo lugar, la ligadura superior para ocluir el torrente sanguíneo para dirigir el líquido inyectado al riñón. Utilizando una aguja de acupuntura (Ø 0,25 mm), pinchar y guiar la punta (redondeada) del catéter (32GA) en la aorta y asegurarla con un solo nudo en la ligadura para que no se mueva ni se filtre durante la inyección. (Figura 1). El uso de una aguja de acupuntura en lugar de una tijera permite la fabricación de un orificio de entrada mínimo en el recipiente. Inyecte 50 μL de líquidos. El riñón debe volverse pálido, lo que indica que la inyección ha perfundido el riñón y ha terminado en el lugar destinado. En este punto hay dos escenarios diferentes posibles. Vuelva a dar algo de circulación al riñón aflojando cuidadosamente la tensión en la ligadura superior antes de cerrar el orificio de entrada. De esta manera se mejora la isquemia, pero ten en cuenta que el líquido inyectado puede potencialmente ser despejado rápidamente a través de la vena renal y por lo tanto no permitir suficiente tiempo de permanencia. O continuar con la cirugía sin devolver el flujo sanguíneo. Después de apretar la ligadura superior de nuevo, retire el catéter, sutura la aorta y devuelva la circulación completa. Retire la ligadura que sostiene el catéter. Retire el catéter. Sutura el orificio de entrada con una sola puntada (ethilon 11-0, aguja redondeada). Primero afloje la ligadura inferior y luego afloje muy lentamente la superior. Si hay fugas, apriete la ligadura de nuevo, espere unos segundos e inténtelo de nuevo. Mantenga el tiempo total de isquemia hasta un máximo de 5-10 minutos para evitar daños isquémicos. Pruebe la solidez empujando el área y busque pulsaciones y vea que el riñón vuelve a la “coloración normal” para asegurar que se establezca la recirculación. Corta los hilos y retira las ligaduras debajo de la aorta. Retire la compresa y empuje los intestinos de nuevo en su lugar. Devuelve algunos líquidos, añadiendo solución salina a la cavidad abdominal y sutura la peritonea (Vicryl 6-0) antes de cerrar la piel con clips metálicos. Antes de despertar a los animales se les da 0,7-1 ml de Rehydrex subcutáneamente.NOTA: Todo el procedimiento tarda alrededor de 30-45 minutos para un equipo bien entrenado. 3. Atención postoperatoria Permita que los animales se despierten en un ambiente cálido colocando una almohadilla de calefacción (alrededor de 38 °C) debajo de parte de la jaula durante 2-3 días después de la operación. Continúe proporcionando analgesia (Buprenorphine, por ejemplo, temgesic 0.05-0.1 mg/kg s.c.) 2-3 veces/día durante 3 días después de la operación. Dar 10 ml/kg de Rehydrex s.c. ocasionalmente si los animales muestran signos de deshidratación.

Representative Results

La película es una mezcla de videos de diferentes cirugías para presentar los que tienen la mejor calidad de video. Algunas secuencias se han tomado de las sesiones de práctica donde se supone que el ratón no se despierta. Por lo tanto, el ratón no siempre está correctamente cubierto. Cuando se supone que un animal se despierta, siempre trabajamos de una manera aséptica. Los análisis histológicos revelaron que la realización de las inyecciones directamente en la arteria renal dio lugar a una lesión renal, probablemente debido a una recirculación insuficiente del flujo sanguíneo con isquemia irreversible como resultado (Figura 2). La inyección a través de la aorta abdominal, por otro lado, no causó ninguna lesión isquémica(Figura 3). Evans teñido azul se utilizó para visualizar que la perfusión a través de la aorta dará lugar a que el riñón sea el primer órgano alcanzado(Figura 4). Ningún otro órgano se volvió azul hasta después del paso a través de la vena renal. También hemos demostrado que utilizando este método podemos aumentar el enjerftment de formulaciones inyectadas al riñón perfundido utilizando células madre mesenquimales (Figura 5). Figura 1: Colocación de suturas y catéter. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Imagen superior: Describir dónde colocar la primera ligadura, cranealmente del riñón izquierdo. Imagen media: Visión general sobre el área de la cirugía justo antes de la colocación del catéter (2.11 en el protocolo). Imagen inferior: Visión general sobre el área de la cirugía justo antes de la inyección (2.10 en el protocolo) Figura 2: Inyecciones directamente en arteria renal. Diseño de, e IHC resulta de, un estudio con inyección de NaCl directamente en la arteria renal Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Resultados del IHC en el día 7 después de la administración de aorta. IHC resultado de un estudio con inyección de NaCl en la arteria renal a través de la aorta abdominal, 7 días después de la inyección Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Inyección de tinte azul Evans. Imagen superior que muestra una vista en serie de una inyección a través de la aorta de evans tinte azul. Imagen inferior que muestra una sección transversal de un riñón después de la inyección a través de aorta de tinte azul Evans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: La perfusión arterial abdominal aumentó significativamente la injerto de células madre mesenquimales en el riñón izquierdo en comparación con el riñón derecho. Las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana fueron etiquetadas con CM-Dil (fluorescencia roja) en suspensión. Un millón de MSC etiquetados se infundieron a través de la arteria abdominal en tres ratones. Tres horas después de la perfusión de MSD, los ratones fueron terminados. Los riñones izquierdo y derecho fueron cosechados e incrustados en OCT para criosección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este método ha tenido éxito en la entrega de formulaciones al riñón sin causar daño renal. Se puede utilizar para la entrega de cualquier tipo de formulaciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, células madre/progenitoras o microvesículas). El método se puede aplicar en animales sanos o en modelos de enfermedad renal.

En la Figura 2 y figura 3,se presenta la histología. La Figura 2 muestra histología 180 minutos después de la perfusión, mientras que la Figura 3 muestra el historial 7 días después de la perfusión. La razón de esto es que los experimentos con la arteria renal duraba sólo 180 minutos. Para estar seguros de que no tuvimos daños crónicos con este nuevo método, esperamos deliberadamente 7 días para evaluarlos. El número n es pequeño, pero esto es sólo un ejemplo.

Tenga en cuenta que este método recientemente desarrollado de administración de aorta para dirigirse al riñón es un método invasivo con un rendimiento relativamente bajo y es adecuado para estrategias de dosificación única solamente. La dosificación repetida no es posible con este método.

Con ajustes menores de las colocaciones de ligadura este método podría ser utilizado para infundir ambos riñones simultaniously5,7. Con el mayor riesgo de contagio a través de ramificaciones aórticas decidimos mantener la ligadura ocluyente lo más cerca posible del riñón, llevando la inyección al riñón izquierdo solamente. También se puede utilizar además de otros modelos o técnicas como la uninephrectomía o tal vez incluso la lesión simultánea de reperfusión de isquemia renal (IRI). En nuestra opinión, hacer la inyección sólo 24 horas después de la cirugía IRI3 es demasiado duro y afectará sustancialmente la recuperación del animal.

Cuando se utilizan nuevas cepas de ratones, siempre se debe realizar un experimento piloto en algunos animales de esa cepa para asegurarse de que el método no necesita ser ajustado de alguna manera. Por ejemplo, en algunas cepas la ramificación del recipiente desde la aorta se puede colocar un poco diferente. La posición de las ligaduras puede cambiar un poco para asegurarse de que la formulación termina en el lugar correcto.

deshidratación
Abrir la cavidad abdominal representa un gran riesgo de deshidratación. Por lo tanto, es imperativo añadir líquidos (alrededor de 37 °C) durante y después de la cirugía para garantizar una buena base para la recuperación después de la operación. Normalmente damos 1 ml/ratones.c. después de la cirugía.

isquemia
El tiempo prolongado de la cirugía o si no alcanza la recirculación completa dará lugar a isquemia. Es importante registrar el tiempo real de la isquemia y asegurarse de que se restablezca la circulación al riñón (y a las patas traseras). El entrenamiento constante y la actualización de las habilidades son, como siempre, importantes. Realizar el procedimiento más rápido reduce el tiempo que el riñón está expuesto a la isquemia. Mantener el tiempo de isquemia (ligadura de aorta) a alrededor de 5 min (10 min máx.) se ha demostrado que no daña el riñón.

derrame
Teniendo en cuenta el riesgo de contagio a otros órganos cuando la formulación inyectada está reingrándose a la circulación a través de la vena renal, el volumen inyectado debe mantenerse al mínimo. Recomendamos un volumen máximo de 50 μL. Dosis también se ha encontrado, por otros, para ser un factor crítico para la eficiencia3.

Efectos adversos (trombosis y parálisis)
Inicialmente al configurar el modelo experimentamos problemas no consistentes con parálisis en las piernas traseras. Después de la dosis relevante de anticoagulante (10 UI de heparina en la vena de la cola) preoperatoriamente, este efecto adverso se redujo significativamente. Después de consultar a expertos en el campo, también empezamos a ser aún más cuidadosos en el trabajo con cirugía atraumática, lo que significa que no pellizcar en ningún tejido y tocar las áreas lo menos posibles. Estas medidas adoptadas juntas redujeron la frecuencia de parálisis de alrededor del 50% a prácticamente ninguna.

Inicialmente durante el desarrollo del método, aplicamos tejido anticoagulante en la arteria renal para cerrar el agujero de incisión. Esto no fue posible al hacer inyecciones en la aorta ya que la presión es mucho mayor en la aorta. El anticoagulante también aumenta el riesgo de trombosis si entra en el lúmenes del recipiente.

Asegúrese de no tener adventitia expuesta en el lúmenes de la aorta al suturar ya que la adventitia es muy trombogénica. También evite cualquier invertir los bordes de la herida o estrechar la aorta suturando al muslo.

Ahora tenemos un método establecido para entregar formulaciones directamente al riñón.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gracias a René Remie en RRSSC por ayudarme a afinar la técnica y los laboratorios Instech para la colaboración en la producción de un catéter de diseño especial. Un gran agradecimiento también a todos los colegas de AstraZeneca I+D para discusiones productivas con consejos y trucos, así como Xerox para completar el vídeo con sonido.

Materials

Blunt hook 5mm 8/pack Cooper surgical 3316-8G
ETHILON Nylon Suture 11/0 Ethicon W2881 For vessel
Microsurgery forceps curved Karo Pharma FRC-15 RM-8
Microsurgery forceps straight Karo Pharma FRS-15 RM-8
Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga Instech C07SS-MRA1813
Vicryl, 6-0, BV-1 needle Angthos W9575 For abdominal cavity

References

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Cite This Article
Dahlqvist, U., Tomic, T. T., Söderberg, M., Stubbe, J., Enggaard, C., Ericsson, A., Zhou, A., Björnson Granqvist, A., William-Olsson, L. Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery. J. Vis. Exp. (170), e61932, doi:10.3791/61932 (2021).

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