Direkte Medikamentenabgabe an die Niere über die Nierenarterie
Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur gezielten Abgabe an eine einzelne Niere über einen Katheter, der in der infraroten Bauchaorta in der Maus platziert ist.
Abstract
Es besteht Bedarf an gezielten Injektionen, um eine erhöhte und spezifische Nierenexposition für eine effiziente Bewertung von Arzneimittelzielen im Bereich der Nierenforschung zu ermöglichen. Anhäufung von Medikamenten in bestimmten Organen kann zu unerwünschten und unerwünschten Wirkungen führen, je nach Art der Injektion. Um Dasüberschlag und/oder die Akkumulation in anderen Geweben zu minimieren, leitet die hier beschriebene Methode die Formulierung in die Nierenarterie blutgeleitet, indem sie einen Katheter in die Infra-Nieren-Aorta einfügt, direkt unterhalb dessen, wo sie sich in die Nierenarterie verzweigt, was dazu führt, dass die Niere als erstes Organ erreicht und die Formulierung über die gesamte Niere verteilt wird.
Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Beschreibung der Methode sowie ihrer Herausforderungen und Schwierigkeiten. Es führt den Experimentator, mit dieser Art von Mikrochirurgie, die Genauigkeit unter sterilen Bedingungen erfordert, geschickt zu werden. Geschwindigkeit ist entscheidend für die Minimierung der Ischämie und das Üben des Verfahrens erhöht die Chance auf erfolgreiche Injektionen ohne Nebenwirkungen. Durch modulationen die Zeit zwischen Injektion und Reperfusion sowie das injizierte Volumen, das Risiko von Spillover auf andere Organe wird gemindert.
Beachten Sie, dass diese Technik für einzelne Dosierstrategien geeignet ist.
Introduction
Im präklinischen Forschungsbereich der Pharmaindustrie gehört die Modell- und Methodenentwicklung zum Arbeitsalltag. Es gibt ein wachsendes Interesse für die Fähigkeit, Medikamente auf bestimmte Organe zu lenken, oder sogar separate Fächer eines Organs, ohne größere Spillover /Entrapment, über den Blutkreislauf, in andere Gewebe. Dies ermöglicht eine erhöhte und spezifische Exposition für eine effiziente Bewertung von Arzneimittelzielen in Modellen verschiedener Krankheitsgebiete 1,2,3,4.
Eine häufige Art der Abgabe von Stoffen ist durch systemische Wege (z. B. über die Schwanzvene), da sie weniger invasiv ist als die in diesem Manuskript beschriebene Methode. Jedoch, systemische Verabreichung erhöht das Risiko eines erhöhten Stoffwechsels oder Akkumulation der Verbindung in anderen Geweben als das beabsichtigte Zielorgan, beim Durchlaufen von Filterorganen wie der Lunge, der Leber und der Milz 2,3,5. Abgesehen davon, dass das bestimmte Gewebe nicht erreicht wird, könnte dies je nach Art der Injektion zu unerwünschten und/oder unerwünschten Wirkungen führen. Nur sehr kleine Moleküle passieren die Kapillaren von Filterorganen und daher ist eine gezielte Abgabe besonders wichtig, wenn man mit größeren Molekülen arbeitet 6.
Um das Übergreifen und/oder die Akkumulation der injizierten Formulierung in anderen Geweben zu minimieren, leitet die hier beschriebene Methode die Formulierung durch einen Katheter, der in die Bauchaorta eingefügt wird, direkt unterhalb der Stelle, an der sie sich in die Nierenarterie verzweigt, in die Nierenarterie, was zur Nierenart als erstes erreichtes Organ führt. Ein weiterer Vorteil bei dieser geführten Verabreichung ist, dass eine niedrigere Dosis/Volumen verwendet werden kann, um das gleiche Expositionsniveau zu erreichen, das durch systemische Verabreichung erreicht wird 3.
Andere Verabreichungswege wurden untersucht, zum Beispiel Injektionen über einen Katheter direkt in die Nierenarterie. In unseren Händen stellte sich heraus, dass dies ein höheres Risiko für das Versagen bei der Wiederherstellung des Durchblutungsdurchblutungs in der Niere darstellt. Der sehr kleine Durchmesser der Nierenarterie (ca. 0,35-0,55 mm Durchmesser) macht den Schnitt relativ groß und birgt beim Schließen des Eingangslochs ein Risiko von Obstruktion und/oder Embolie. Nach unserer Erfahrung traten bei der Anwendung dieser Methode häufig ischämische Schäden an der Niere auf, und deshalb haben wir diese neue Methode entwickelt, um die Niere erfolgreich injizieren zu können, indem wir Substanzen durch Einschnitt der größeren Aorta injizieren, um die Niere ins Visier zu nehmen.
Es gibt ähnliche Techniken, die bei Ratten entwickelt werden, die auch die Herausforderungen und das Risiko von Stenose/Thrombose manifestieren, die mit Injektionen direkt in die Nierenarterie arbeiten 5. Dies unterstützt unsere Erkenntnisse, da die Gefäße bei Mäusen noch kleiner sind.
Dieses Manuskript und Video beschreiben detailliert, wie Injektionen in die Nierenarterie bei Mäusen durch einen in die Infrarotaorta eingesetzten Katheter geleitet werden können, sowie Anleitungen, wie man häufige Schwierigkeiten im Verfahren überwinden, so und so die Reproduzierbarkeit erhöhen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode war erfolgreich bei der Abgabe von Formulierungen an die Niere, ohne Nierenschäden zu verursachen. Es kann für die Lieferung von Formulierungen jeder Art (z. B. kleine Moleküle, Stamm-/Vorläuferzellen oder Mikrovesikeln) verwendet werden. Die Methode kann bei gesunden Tieren oder in Nierenkrankheitsmodellen angewendet werden.
In Abbildung 2 und Abbildung 3wird die Histologie dargestellt. Abbildung 2 zeigt die Histologie 180 Minuten nach der Perfusion, während Abbildung 3 die Geschichte 7 Tage nach der Infusion zeigt. Der Grund dafür ist, dass die Experimente mit Nierenarterie nur 180 Minuten lang waren. Um sicher zu sein, dass wir keine chronischen Schäden mit dieser neuen Methode hatten, warteten wir absichtlich 7 Tage, um sie zu bewerten. Die n-Zahl ist klein, aber dies ist nur ein Beispiel.
Beachten Sie, dass diese neu entwickelte Methode der Aorta-Verabreichung, um die Niere zu zielen, eine invasive Methode mit relativ niedrigem Durchsatz ist und nur für einzelne Dosierstrategien geeignet ist. Eine wiederholte Dosing ist mit dieser Methode nicht möglich.
Mit geringfügigen Anpassungen der Ligaturplatzierungen könnte diese Methode möglicherweise verwendet werden, um beide Nieren simultaniös5,7einzuwirken. Mit dem erhöhten Risiko des Übergreifens durch Aortenverzweigung beschlossen wir, die okkludiere Ligatur so nah wie möglich an der Niere zu halten, was die Injektion nur zur linken Niere führt. Es kann auch zusätzlich zu anderen Modellen oder Techniken wie Uninephrektomie oder vielleicht sogar gleichzeitige renale Ischämie Reperfusionsverletzung (IRI) verwendet werden. Unserer Meinung nach ist die Injektion nur 24 Stunden nach der IRI3-Operation zu hart und wird die Genesung des Tieres erheblich beeinträchtigen.
Bei der Verwendung neuer Mäusestämme sollte man immer ein Pilotexperiment an einigen Tieren aus diesem Stamm durchführen, um sicherzustellen, dass die Methode nicht in irgendeiner Weise angepasst werden muss. In einigen Stämmen kann z.B. die Gefäßverzweigung aus der Aorta etwas anders positioniert werden. Die Position der Ligaturen kann sich etwas ändern, um sicherzustellen, dass die Formulierung an der richtigen Stelle landet.
Dehydrierung
Das Öffnen der Bauchhöhle stellt ein großes Risiko für Diehydrierung dar. Es ist daher zwingend erforderlich, Flüssigkeiten (ca. 37 °C) sowohl während als auch nach der Operation hinzuzufügen, um eine gute Basis für die Erholung nach der Operation zu gewährleisten. Wir geben in der Regel 1 ml/Mäuse .c. nach der Operation.
Ischämie
Längere Operationszeit oder wenn die vollständige Rezirkulation nicht erreicht wird, führt zu Ischämie. Es ist wichtig, die tatsächliche Ischämie-Zeit aufzuzeichnen und sicherzustellen, dass die Durchblutung der Niere (und der Hinterbeine) wiederhergestellt wird. Ständiges Training und Auffrischung der Fähigkeiten sind wie immer wichtig. Die schnellere Durchführung des Eingriffs reduziert die Zeit, in der die Niere Einer Ischämie ausgesetzt ist. Es hat sich gezeigt, dass die Ischämiezeit (Ligation der Aorta) auf ca. 5 min (10 min max) nicht beeinträchtigt wird.
Spillover
In Anbetracht des Risikos eines Spillovers auf andere Organe, wenn die injizierte Formulierung durch die Nierenvene wieder in den Kreislauf gelangt, sollte das injizierte Volumen auf ein Minimum beschränkt werden. Wir empfehlen ein maximales Volumen von 50 l. Dosierung wurde auch gefunden, von anderen, um ein kritischer Faktor für die Effizienz3.
Nebenwirkungen (Thrombose und Lähmung)
Anfangs hatten wir beim Aufbau des Modells nicht konsistente Probleme mit Lähmungen in den Hinterbeinen. Nach einer relevanten Dosis von Gerinnungsmitteln (10 I.E. Heparin in der Schwanzvene) präoperativ wurde diese nachteilige Wirkung signifikant verringert. Nach Rücksprache mit Experten auf diesem Gebiet, begannen wir auch noch vorsichtiger in der Arbeit mit atraumatischen Chirurgie, was bedeutet, kein Kneifen in irgendwelchen Geweben und berühren so wenig Bereiche wie möglich. Diese Zusammengenommenen reduzierten die Lähmungshäufigkeit von etwa 50 % auf praktisch keine.
Zunächst während der Methodenentwicklung haben wir gerinnungshemmendes Gewebe auf die Nierenarterie aufgetragen, um das Schnittloch zu schließen. Dies war bei Injektionen in die Aorta nicht möglich, da der Druck in der Aorta so viel höher ist. Antikoagulans erhöht auch das Thromboserisiko, wenn es in das Gefäßlumen eintritt.
Achten Sie darauf, dass Adventitia nicht im Lumen der Aorta ausgesetzt ist, wenn es seit der Adventitie sehr thrombogene ist. Vermeiden Sie auch invertierende Wundkanten oder Verengung der Aorta durch Verkleinern an den Oberschenkel.
Wir haben jetzt eine etablierte Methode, um Formulierungen direkt an die Niere zu liefern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vielen Dank an René Remie von RRSSC für die Unterstützung bei der Feinabstimmung der Technik und instech Labs für die Zusammenarbeit bei der Herstellung eines speziell gestalteten Katheters. Ein großes Dankeschön auch an alle Kollegen von AstraZeneca R&D für produktive Diskussionen mit Tipps und Tricks sowie Xerox für die Vervollständigung des Videos mit Ton.
Materials
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
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