فحص محسن وأدوات لقياس النوسسيبل الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية إجراء فحص محسن للانكارية الميكانيكية في يرقات دروسوفيليا. نستخدم الفحص هنا لإثبات أن فرط الحساسية الميكانيكية (الوسوفيا وhyperalgesia) موجود في يرقات دروسوفيليا.
Abstract
وقد أدت عمليات الفحص المنشورة للانكارسي في دروسوفيليا إلى تقييمات مختلفة للسلوك. هنا، نحن ملفقة، للاستخدام مع يرقات دروسوفيليا، مخصصة معدنية النيكل والتيتانيوم سبائك (نيتينول) خيوط. هذه المسابير الميكانيكية مماثلة لخيوط فون فراي المستخدمة في الفقاريات لقياس nociception الميكانيكية. هنا، ونحن نبين كيفية جعل ومعايرة هذه المسابير الميكانيكية وكيفية توليد استجابة الجرعة السلوكية الكاملة من subthreshold (غير ضارة أو غير ضارة النطاق) إلى المحفزات فوق الهد (منخفضة إلى عالية الضارة) المحفزات. لإثبات فائدة المسابير ، قمنا بالتحقيق في فرط الحساسية الناجمة عن تلف الأنسجة في يرقات دروسوفيليا. لم يتم بعد تحديد الحساسية الميكانيكية للتحفيز الميكانيكي غير الضار عادةً) وhyalgesia (الاستجابة المبالغ فيها لحافز ميكانيكي ضار) في يرقات دروسوفيليا. باستخدام المسابير الميكانيكية التي عادة ما تكون غير ضارة أو تحقيقات التي تثير عادة سلوكًا غير نشط ، وجدنا أن يرقات Drosophila تطور فرط الحساسية الميكانيكية (كلا من allodynia وhyalgesia) بعد تلف الأنسجة. وبالتالي، فإن المسابير الميكانيكية والمقايسة التي نوضحها هنا من المرجح أن تكون أدوات مهمة لتشريح الآليات الجزيئية/الوراثية الأساسية للحساسية الفائقة الميكانيكية.
Introduction
تظهر يرقات دروسو فيلها سلوك متداول مُميز مميز عند تعرضها لمحفزات ضارة مختلفة:الحرارية 1، الميكانيكية2،والكيميائية 3. هذا السلوك هو واضح يختلف عن الحركة العادية. هنا نحن وصف فحص ميكانيكية محسنة التي يمكن استخدامها لتقييم الحساسية الميكانيكية والحساسية الميكانيكية.
في دراسة حديثة، ونحن ملفقة فون فراي مثل خيوط باستخدام أسلاك نيتينول4. وقد بذلت تحقيقات ممارسة قوى وضغوط مختلفة من خلال تغيير أطوال وأطر الأسلاك نيتينول تشكيل كل مسبار. تم معايرة المسابير الميكانيكية وتم تحويل قيم القوة المقاسة (في الدخنونتون، mN) إلى ضغط (كيلوباسكال، كيلو باسكال)، استنادًا إلى منطقة الطرف لكل مسبار4. تلفيق مخصص من المسبر الميكانيكية يسمح لنا لتوليد subthreshold (≤200 كيلو باسكال) إلى أعلى من هه (225 كيلو باسكال إلى 5318 كيلو باسكال) الضغوط، والتي يمكن، من حيث المبدأ، أن تكون مفيدة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية. باستخدام هذه خيوط فون فراي الميكانيكية المحسنة ، أظهرنا أن الضغط4، على عكس القوة التي تم فحصها سابقًا2،5،6 يرتبط بشكل أكثر اتساقًا بالاستجابة السلوكية الكارهة في يرقات دروسوفيليا. كما ساعد الفحص الميكانيكي المحسن الموصوف هنا على تحديد عامل نمو البطانية الوعائية المحفوظ (VEGF) المرتبط بمستقبلات التيروزين كيناز التي تشير إلى مسار ينظم التنامية الميكانيكية في الذباب والجرذان4.
االعينة الميكانيكية وhyalgesia، وهما طريقتان من فرط الحساسية، هي غير مدروسة نسبيا في يرقات دروسوفيليا، مقارنة مع الحرارية (الحرارة والبرد) والطرائق الكيميائية الحسية3،7،8،9،10. وربما يرجع ذلك إلى عدم وجود تحقيقات ميكانيكية محددة تمتد من المحفزات الضارة إلى النطاق الضار العالي2،5،6. حافز غير ضار عادةً يثير سلوك المتداول المتعرج النموذجي بعد تجربة يرقات دراوسوفيليا تلف الأنسجة3،يشار إلى7 باسم الالوديانيا. ومن المعروف أن استجابة مبالغ فيها المتداول إلى حافز ضارة عادة كما هو مفرط7. يتم تعريف المحفزات الضارة بأنها تلك التي تثير تلف الأنسجة ويمكن تنشيط nociceptors11. المحفزات الضارة تسليمها إلى يرقات Drosophila الضرر إما البشرة الحاجز، والخلايا العصبية الحسية nociceptive الطرفية3،4،7، أو كليهما.
في هذه المقالة، نُوضح كيفية تصنيع ومعايرة المجسّسات الميكانيكية التي تُشبه بـ “فون فري” والمناسبة ليرقات “دروسوفيليا”. علاوة على ذلك ، نعرض كيفية استخدام هذه المسابير لمقايسة الاستجابات الناجسية الميكانيكية في يرقات دروسوفيليا. وأخيراً، نبرهن كذلك على فائدة هذه المسابير باستخدامها لإثبات وجود فرط الحساسية الميكانيكية، كلا من الالودينية والهايبرجيا، بعد تلف الأنسجة في يرقات دروسوفيليا (انظر نتائج التمثيل).
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن تعديل اختبار الميكانيكية المنشأة1،2،16 باستخدام مسابير ميكانيكية مخصصة ملفقة من خيوط النتينول. تسمح لنا هذه السبائك المعدنية باستخدام خيوط قطر أصغر تتناسب مع حجم يرقات دروسوفيليا. وقد سيطرت على الصيد على أساس خط monofilaments مجال nociception الميكانيكية الطيران حتى الآن2,5,6,16. لدينا خيوط النيتينول الحفاظ على شكلها والضغط المقاس لمدة ~ ~ 3-5 أشهر (في تجربتنا). من خلال تغيير طول وقطر خيوط النتينول ، يمكن للمستخدم توليد مجموعة واسعة من الضغوط التي تمتد من subthreshold إلى استجابة المتداول كاملة تقريبا. على وجه الخصوص، مما يجعل subthreshold تحقيقات أبسط مع خيوط النيتينول قطرها الأصغر. باستخدام هذه التحقيقات، وجدنا أن الضغط، بدلا من القوة، يثير استجابات سلوكية أكثر اتساقا nocifensive4. نبرهن هنا، باستخدام نموذج توعية nociceptive مُنشأ من الأشعة فوق البنفسجية7،10،13، أن هذه الخيوط هي أيضا أداة مفيدة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية – اللودينيا وفرط الاججيزيا.
وقد أدت الدراسات السابقة باستخدام مسابير ميكانيكية ملفقة من خط الصيد إلى بعض التباين في الاستجابة السلوكية2،6،16،17. وقد تكون هناك عدة عوامل تُعدّ في الاعتبار. أولاً، لأن الضغط هو المتغير المهم، فإن تلميع طرف خيوط بحيث يتم تقريبه وليس لديه أي حواف حادة أمر بالغ الأهمية. ثانياً، إن الإبلاغ عن قيم الضغط بدلاً من القوة فقط مهم لقابلية تكرار التجارب، لأن المسابير الميكانيكية المختلفة التي تولد قوى مماثلة يمكن أن تثير ضغوطاً متباينة4. ثالثاً، من المهم تطبيق تحفيز ميكانيكي واحد فقط لكل يرقة باستخدام مسابير ضارة، لأن هذه المسابير تنتج تلفًا يعتمد على الجرعة في الأنسجة التي تعتمد على الجرعة على مستويات الخلايا العصبية الجلديةوالحسية (الشكل 2E). ويمكن للمحفزات الميكانيكية الضارة الثانية أو اللاحقة، بعد أن يتم إحداث تلف الأنسجة، أن تضعف وظيفة الخلايا العصبية الحسية الطرفية المتأثرة وتنتزع استجابة سلوكية معدلة. في دراسة أخرى، اليرقات حفز مرتين مع مسابير ميكانيكية ضارة عرض في الغالب استجابة سلوكية معززة5، مما يشير إلى تطوير الحساسية الميكانيكية الحادة (hyperalgesia)، والتي قد تنتج عن تلف الأنسجة التي أثارها أول حافز ميكانيكي ضارة. على العكس من ذلك، أفاد مؤلفون آخرون6 عن استجابة سلوكية مختلطة (زيادة أو نقصان)، مما يشير إلى أن الاستجابة السلوكية المتغيرة يمكن أن تكون بسبب تلف/خلل في الأنسجة العصبية. تحفيز كل يرقة مرة واحدة فقط يزيل التباين المحتمل في الاستجابات السلوكية الناتجة إما عن التوعية أو تلف الأنسجة. رابعاً، نحن ميكانيكيا حفز الجزء A8، الذي هو أكثر الخلفي من الدراسات السابقة (المناطق المفضلة A3-A4)2،5،16. لم المسابير بين ~ 3900 كيلو باسكال و 5300 كيلو باسكال المطبقة على أي من الجزء A2 أو A8 لم تظهر أي اختلافات سلوكية4. بالإضافة إلى ذلك ، من الأسهل تحفيز A8 ، مقارنة بـ A2 – A4 ، باستخدام المجسات الميكانيكية التي تولد ضغوطًا أقل (<300 كيلو باسكال) لأن اليرقة أرق في هذه المنطقة وبالتالي مضغوطة بسهولة أكبر. وأظهرت دراسات أخرى أن التحفيز الميكانيكي الضار للنهاية الخلفية لليرقة (التي ألقاها دبوس حشرة جامدة ، التي عقدت مع ملقط) أثار في الغالب الحركة إلى الأمام ، بدلا من استجابة 18 aversive أوالمتداول. يمكن أن تكون هذه الاستجابة السلوكية المختلفة بسبب الاختلافات في خصائص المواد المستخدمة (خيوط النيتينول القابلة للانحناء مقابل دبوس الحشرات غير المضغوطة) أو إلى ضغوط مختلفة تم تسليمها إلى اليرقات (لم يتم الإبلاغ عن قيمة ضغط دبوس الحشرة).
وقد مكن تطوير مقايسة nociception الميكانيكية ليرقات الدوزوفيليا الحقل لاكتشاف أن القنوات الأيونية الحسية الميكانيكية المختلفة والدوائر العصبية وساطة nociception الميكانيكية5,6,16,17. ومع ذلك ، فإن دراسة فرط الحساسية الميكانيكية (allodynia وhyperalgesia) قد تخلفت ، مقارنة بالتوعية من طرائق الحسية الأخرى – الحرارة7،8،10،13،14،الباردة9،والكيميائية 3. وقد يرجع هذا التأخر جزئياً إلى عدم وجود مسابير ميكانيكية مناسبة يمكن أن تولد نطاقاً استجابة كاملة تمتد إلى الضغوط فوق الوثارس. ذات أهمية خاصة ، خاصةً لتقييم النياية الميكانيكية ، هي مسابير تحت الهودود لا تثير استجابة متدحرجة من اليرقات غير الموبّعة. أهمية المجس الميكانيكية المحسنة لدينا هي أنها يمكن أن تكون ملفقة لتمتد المحفزات غير ضارة (subthreshold ~ 174 كيلو باسكال -200 كيلو باسكال) أو من المنخفض إلى ارتفاع مجموعة ضارة (suprathreshold ~ 225 كيلو باسكال إلى ~ 5،116 كيلو باسكال). هنا ، نبرهن باستخدام خيوط تشبه nitinol von Frey التي تطور يرقات Drosophila كل من اللودينية الميكانيكية والهايبرجيا الميكانيكية بعد الإشعاع فوق البنفسجي. التوعية الميكانيكية تظهر بعض الاختلافات بالمقارنة مع التوعية الحرارية. كل من بداية وذروة التوعية الميكانيكية في وقت سابق (~ 4 ح) مقارنة بالحساسية الحرارية (الحرارة) (~ 8 ح لhyperalgesia و ~ 24 ساعة للالسودية)7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الالوينيا الميكانيكية وhyperalgesia يصاحب (على حد سواء الذروة في ~ 4 ساعة). وعلاوة على ذلك، في حين التوعية الحرارة (allodynia وhyalgesia) يحل تماما في وقت لاحق نقاط7، أظهرت فرط الحساسية الميكانيكية ذيل طويل التي ظلت أعلى قليلا من خط الأساس. التوعية الباردة في دروسوفيليا ينطوي على التبديل في السلوكيات الباردة أثار9 وظهور سلوكيات جديدة أثار الباردة – وهي ظاهرة لا يلاحظ مع التحفيز الميكانيكي. هذه الاختلافات في بداية، والمدة، والسلوكيات الملاحظة تشير إلى أن كل طريقة الحسية يمكن التحكم بها من خلال مسارات إشارة مختلفة. الجمع بين الحساسية الموصوفة هنا مع الأدوات الوراثية القوية المتاحة في Drosophila ينبغي أن تسمح تشريح وراثي دقيق للحساسية الميكانيكية (allodynia وhyalgesia) لوحظ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر توماس وانغ على تطوير النموذج الأولي لخيوط فون فراي، وباتريك جيه هوانغ لتحسين مقايسة المسبار الميكانيكي، ومركز بلومينغتون دروسوفيليا للأسهم للسيطرة(ث1118) وppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP الأسهم تطير، وأعضاء مختبر غالكو لقراءة نقدية المخطوطة. وقد دعم هذا العمل R21NS087360 وR35GM126929 إلى MJG.
Materials
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
