Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar
Summary
Bu protokolün amacı, Drosophila larvalarında mekanik nosiception için geliştirilmiş bir tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Buradaki tahlilleri, Drosophila larvalarında mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperaljezi) var olduğunu göstermek için kullanıyoruz.
Abstract
Drosophila’da mekanik nosiception için yayınlanan tahliller, davranışların değişken değerlendirmelerine yol açmıştır. Burada, Drosophila larvaları, özelleştirilmiş metal nikel-titanyum alaşımları (nitinol) filamentleri ile kullanılmak üzere imal ettik. Bu mekanik problar, mekanik nosiception’ı ölçmek için omurgalılarda kullanılan von Frey filamentlerine benzer. Burada, bu mekanik probların nasıl oluşturulacağı ve kalibre edeceğinizi ve subthreshold’dan (zararsız veya zararlı olmayan aralık) suprathreshold (düşük ila yüksek zararlı aralık) uyaranlarına tam bir davranışsal doz-yanıtın nasıl oluşturulacağı gösterilmektedir. Probların yararını göstermek için Drosophila larvalarında doku hasarına bağlı aşırı duyarlılığı araştırdık. Drosophila larvalarında mekanik asidiya (normalde zararsız bir mekanik uyarana aşırı duyarlılık) ve hiperaljezi (zararlı mekanik uyarana abartılı yanıt verme) henüz kurulmamıştır. Normalde zararsız olan mekanik problar veya tipik olarak aversif bir davranış ortaya çıkan problar kullanarak, Drosophila larvalarının doku hasarından sonra mekanik aşırı duyarlılık (hem allodynia hem de hiperaljezi) geliştirdiğini gördük. Bu nedenle, burada gösterdiğimiz mekanik problar ve testler, mekanik aşırı duyarlılığın temel moleküler / genetik mekanizmalarını parçalamak için önemli araçlar olacaktır.
Introduction
Drosophila larvaları, farklı zararlı uyaranlara maruz kaldığında karakteristik bir aversif yuvarlanma davranışı sergiler: termal1, mekanik2ve kimyasal3. Bu davranış normal hareketten açıkça farklıdır. Burada mekanik nosiception ve mekanik duyarlılık değerlendirmek için kullanılabilecek geliştirilmiş bir mekanik tahlil açıklıyoruz.
Yeni bir çalışmada, nitinol telleri kullanarak von Frey benzeri filamentler imal ettik4. Farklı kuvvetler ve basınçlar uygulayan problar, her probu oluşturan nitinol tellerinin uzunlukları ve çapları değiştirerek yapılmıştır. Mekanik problar kalibre edildi ve ölçülen kuvvet değerleri (milinewton, mN cinsinden) her probun uç alanına göre basınca (kilopascal, kPa) dönüştürüldü4. Mekanik probların özel imalatı, prensip olarak mekanik aşırı duyarlılığı incelemek için yararlı olabilecek suprathreshold (225 kPa ila 5318 kPa) basınçlarına subthreshold (≤200 kPa) üretmemize izin verdi. Bu geliştirilmiş mekanik von Frey benzeri filamentleri kullanarak, basınç 4 Daha önce incelenen kuvvet2,5,6’nın aksine, Drosophila larvalarında aversif davranışsal yanıt verme ile daha tutarlı bir şekilde ilişkili olduğunu gösterdik. Burada açıklanan geliştirilmiş mekanik tahlil ayrıca, sineklerde ve sıçanlarda mekanik nosiception’ı düzenleyen bir yola işaret eden korunmuş bir Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) ile ilgili reseptör tirozin kinazını tanımlamaya yardımcı oldu4.
İki aşırı duyarlılık yöntemi olan mekanik asidina ve hiperaljezi, Drosophila larvalarında termal (ısı ve soğuk) ve kimyasal duyusal yöntemler 3,7 ,8,9,10ile karşılaştırıldığında nispeten yetersizdir. Bu muhtemelen zararsız uyaranlardan yüksek zararlı aralık 2,5,6’yakadar uzanan spesifik mekanik probların eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Drosophila larvaları doku hasarı yaşadıktan sonra tipik aversif yuvarlanma davranışını ortaya çıkarır normalde zararsız bir uyaran3,7 allodynia olarak adlandırılır. Tipik olarak zararlı bir uyarana abartılı bir yuvarlanma yanıtı hiperaljezi7olarak bilinir. Zararlı uyaranlar, doku hasarı ortaya çıkan ve noseptörleri aktive debilenler olarak tanımlanır11. Drosophila larvalarına teslim edilen zararlı uyaranlar bariyer epidermisine, periferik nosiseptif duyusal nöronlara3, 4,7veya her ikisine de zarar verir.
Bu yazıda, Drosophila larvaları için uygun olan von Frey benzeri mekanik probların nasıl özel olarak üretilir ve kalibre edilir. Ayrıca, Drosophila larvalarında mekanik nosiseptif yanıtları test etmek için bu probların nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Son olarak, Drosophila larvalarındaki doku hasarını takiben hem allodynia hem de hiperaljezi olmak üzere mekanik aşırı duyarlılık varlığını göstermek için bunları kullanarak bu probların yararını daha da gösteriyoruz (bkz. Temsili Sonuçlar).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nitinol filamentlerinden üretilen özelleştirilmiş mekanik problar kullanarak yerleşik bir mekaniktest1,2,16’yı değiştirdik. Bu metal alaşım, Drosophila larvalarının büyüklüğüne uygun daha küçük çaplı filamentler kullanmamızı sağlar. Balıkçılık hattı tabanlı monofilamentler bugüne kadar sinek mekanik nosiception alanına hakimdir2,5,6,16. Nitinol filamentlerimiz yaklaşık ~3-5 ay boyunca şekillerini korur ve basıncı ölçer (deneyimlerimize göre). Nitinol filamentlerinin uzunluğunu ve çapını değiştirerek, kullanıcı alt gövdeden neredeyse eksiksiz bir yuvarlanma tepkisine kadar geniş bir basınç yelpazesi üretebilir. Özellikle, alt koruma probları yapmak daha küçük çaplı nitinol filamentleri ile daha kolaydır. Bu probları kullanarak, kuvvet yerine basıncın daha tutarlı nosifensif davranışsal yanıtlar ortaya çıkardığı bulundu4. Burada, iyi kurulmuş bir UV kaynaklı nosceptive duyarlılık modeli7,10,13kullanarak, bu filamentlerin mekanik aşırı duyarlılığı (asidiyans ve hiperaljezi) incelemek için de yararlı bir araç olduğunu gösteriyoruz.
Oltadan üretilen mekanik probların kullanılarak yapılan önceki çalışmalar davranışsal yanıt verme 2 , 6,16,17’debelirli bir değişkenliğe yol açmıştır. Bunu çeşitli faktörler hesaba katabilir. İlk olarak, basınç önemli değişken olduğundan, filament ucunun yuvarlatılmış ve keskin kenarları olmayacak şekilde kabarması kritik öneme sahiptir. İkincisi, deneylerin tekrarlanabilirliği için sadece kuvvet yerine basınç değerlerini raporlamak önemlidir, çünkü benzer kuvvetler üreten farklı mekanik problar farklı basınçlar ortaya çıkabilir4. Üçüncüsü, zararlı problar kullanarak larva başına sadece bir mekanik stimülasyon uygulamak önemlidir, çünkü bu tür problar epidermal4 ve duyusal nöronal seviyelerde doza bağımlı bir doku hasarı üretir (Şekil 2E). Doku hasarı indüklendikten sonra ikinci veya sonraki zararlı mekanik uyaran, etkilenen periferik duyusal nöronların işlevini bozabilir ve değiştirilmiş bir davranışsal yanıt ortaya çıkabilir. Başka bir çalışmada, zararlı mekanik problarla iki kez uyarılan larvalar çoğunlukla gelişmiş bir davranışsal yanıt gösterdi5, ilk zararlı mekanik uyaranın neden olduğu doku hasarından kaynaklanabilecek akut mekanik duyarlılık (hiperaljezi) gelişimini düşündürmektedir. Tersine, diğer yazarlar6, değişen davranışsal yanıtın nöronal dokunun hasarına / işlev bozukluğuna bağlı olabileceğini gösteren karışık (artmış veya azalmış) bir davranışsal yanıt bildirmiştir. Her larvayı sadece bir kez uyarmak, duyarlılık veya doku hasarından kaynaklanan davranışsal yanıtlardaki olası varyansı ortadan kaldırır. Dördüncüsü, önceki çalışmalara göre daha arka olan A8 segmentini mekanik olarak uyardık (tercih edilen alanlar A3–A4)2,5,16. A2 veya A8 segmentine uygulanan ~3.900 kPa ile 5.300 kPa arasındaki problar herhangi bir davranışsal farklılık göstermedi4. Ek olarak, A8, A2-A4 ile karşılaştırıldığında, daha düşük basınçlar (<300 kPa) üreten mekanik problarla uyarılması daha kolaydır, çünkü larva bu bölgede daha incedir ve böylece daha kolay sıkıştırılır. Diğer çalışmalar, larvaların arka ucunun zararlı mekanik stimülasyonunun (forseps ile tutulan sert bir böcek iğnesi tarafından teslim edildiğini) çoğunlukla averatif veya yuvarlanan bir yanıt yerine ileriye doğru hareket uyandırdığını göstermiştir18. Bu farklı davranışsal yanıt, kullanılan malzemelerin özelliklerindeki farklılıklardan (bükülebilir nitinol filament vs sıkıştırılamaz böcek pimi) veya larvalara verilen farklı basınçlardan kaynaklanabilir (böcek piminin basınç değeri bildirilmedi).
Drosophila larvaları için mekanik bir nosiception tahlilinin geliştirilmesi, alanın farklı mekanik duyusal iyon kanallarının ve sinir devrelerinin mekanik nociception 5 , 6,16,17’yearacılıkettiğini keşfetmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, mekanik aşırı duyarlılık (allodynia ve hiperaljezi) çalışması, diğer duyusal yöntemlerin duyarlı hale getirilmesine kıyasla geri kaldı – ısı7, 8,10,13,14, soğuk9ve kimyasal3. Bu gecikme kısmen, suprathreshold basınçlarına kadar uzanan tam bir tepki aralığı oluşturabilecek uygun mekanik probların yokluğundan kaynaklanıyor olabilir. Özellikle mekanik asidiyatı değerlendirmek için özel bir öneme sahip olan, yaralanmamış larvalardan aversif bir yuvarlanma tepkisi vermeyen alt gövde problarıdır. Geliştirilmiş mekanik problarımızın önemi, zararsız uyaranları (subthreshold ~174 kPa–200 kPa) veya düşük ila yüksek zararlı aralığı (suprathreshold ~225 kPa ila ~ 5.116 kPa) kapsayacak şekilde üretilebilmesidir. Burada, Drosophila larvalarının UV ışınlamadan sonra hem mekanik allodynia hem de mekanik hiperaljezi geliştirdiği nitinol von Frey benzeri filamentleri kullanarak gösteriyoruz. Mekanik duyarlılık, termal duyarlılıkla karşılaştırıldığında bazı farklılıklar gösterir. Mekanik duyarlılığın hem başlangıcı hem de zirvesi termal (ısı) duyarlılıkla karşılaştırıldığında daha erkendir (~4 h) (hiperaljezi için ~ 8 h ve allodynia için ~ 24 saat)7. Ek olarak, mekanik asidina ve hiperaljezi eşlik edendir (her ikisi de ~4 saat zirvede). Ayrıca, ısı duyarlılığı (allodynia ve hiperaljezi) daha sonraki zaman noktalarında tamamen çözülürken7, mekanik aşırı duyarlılık taban çizgisinin biraz üzerinde kalan uzun bir kuyruk sergiledi. Drosophila’daki soğuk duyarlılık, soğuk uyarılmış davranışlar9’da bir geçiş ve mekanik stimülasyonla gözlenmemiş bir fenomen olan yeni soğuk çağrışımlı davranışların ortaya çıkmasını içerir. Başlangıç, süre ve gözlemlenen davranışlardaki bu farklılıklar, her duyusal modalitenin farklı sinyal yolları tarafından kontrol edilebileceğini göstermektedir. Burada açıklanan duyarlılık testini Drosophila’da bulunan güçlü genetik araçlarla birleştirmek, gözlenen mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperalgezi) kesin bir genetik diseksiyonuna izin vermelidir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prototip von Frey filamentlerini geliştirdiği için Thomas Wang’a, mekanik prob testini geliştirdiği için Patrick J. Huang’a, kontrol için Bloomington Drosophila Stok Merkezi’ne(w1118)ve ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP sinek stoklarına ve Galko laboratuvar üyelerine el yazmasını eleştirel bir şekilde okuduklarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma R21NS087360 ve R35GM126929 tarafından MJG’ye desteklendi.
Materials
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
