無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

動物保護のドイツの法律の§4に準拠した動物プロトコルは、動物保護に関するテュービンゲン大学委員会によって審査され、承認されました (アインリヒトゥン・フュル・ティアシュッツ, ティエルツリヒェン・ディエンスト・ウント・Labortierkunde;登録なしAK02/19M)。本研究では、野生型(WT)およびrd1マウスからレティナが得られ、後者は遺伝性のレチン性変性15に対して十分に特徴付けられるモデルである。マウスは標準的な白色の環状照明の下に収容され、食料と水への自由なアクセスを持ち、性別に関係なく使用された。 1. チェックリスト 滅菌状態を確保し、汚染を避けるために、70%エタノールで薄層空気流フードをきれいに、消毒します。必ず、エタノールを完全に蒸発させ、レチン培養物の中毒を防ぎます。 使用前のオートクレーブツール(例えば、はさみ、鉗子、眼科顕微鏡の掻き取りスプーン) 積層流れフードの下で事前に次の培地を準備し、無菌条件下で:基底R16培地(BM)(4°Cで4週間保存可能)、BM20%胎児子牛血清(FCS)(同日使用)、BM 0. 12%プロテイナーゼK(44 mAnson U/mg)溶液(同じ日の使用)および完全なR16培地(同じ日の使用)とサプリメント(CM)が記載されているようにRomijn16(3週間4°Cで保存することができます)(表S1、表S1、サプリメントを使用して S2、およびS3)。 プロテナーゼK溶液を37°Cで予熱して活性化し、ステップ2.5で使用します。 2. 準備 出生後の日(P)5で切断によって rd1/WT動物を犠牲にする。P11より古い動物の場合は、地域の動物保護規則に従ってCO2 および/または子宮頸部脱臼を使用してください。 動物の年齢に応じて、必要に応じて、核分裂の前に、鉗子を使用して眼瞼を開き、下の目に触れたり引っ掻いたりすることなく、非常に慎重に眼瞼を分離する。 曲面鉗子を使用して、ステレオスコープの下で目を素早く核状にする。 目をBMで室温(RT)で5分間インキュベートします。 予熱されたBMで目をインキュベートし、0.12%のプロテイナーゼKを37°Cで15分間インキュベートします。 滅菌状態を確実にするために、ラミナーエアフローフードの内部で次の手順を実行します。プロテナーゼKを不活性化するには、20Sを含むBMに目を移し、RTで5分間インキュベートする。 RTで新鮮なBMを含むペトリ皿の中で、無菌のステレオスコープの下で目を解剖します。この時間が長いほど、眼を解剖するのが難しくなり、目は非常に柔らかくなります。 鉗子で、視神経から目を保持します。細かいはさみを使用して角膜に小さな切開を行い、角膜、脈絡膜、強膜を2組の細かい鉗子で緩やかに剥がすことができる2つの縁から作ります(図1 ステップA-C)。あるいは、狭軌カニューレを使用して角膜に最初の切開を行い、その後、はさみブレードの1つを開口部に挿入します。 細かい鉗子でレンズをつかみます。最初の鉗子が2番目の鉗子の間にあるように最初の鉗子に垂直に第2の鉗子のペアを置く。引っ張ってアイカップからレンズを抽出します。もし、生膜と毛様体が引き続き残っている場合は、慎重に取り除いてください(図1 ステップD)。注:手順2.7.1と2.7.2は練習をする必要があり、必ず、レティナを損傷しないように注意してください。 4 つの点で、そのエッジに垂直なレティナをカットし、四つ葉のクローバー形状を作成します(図 1 ステップ E–F)。 1 mL先端の広く切断されたベースのピペットを使用して、レチナを培地の吊り下げドロップに保持し、6ウェル培養プレートに入れた培養皿フィルターインサートに移します。RPE層は膜に向き合う必要があります(図1 ステップG)。 ピペットを使用して、慎重に挿入から余分な媒体を除去します。 ウェルの側面から、ウェルあたりCMの1 mLを加え、5%CO2で37°Cの無菌インキュベーターでインキュベートする。これは酸素を減らし、組織の変性を引き起こすので、媒体にレティナを沈めないでください。外植は、水の表面張力によって作られた液体の薄膜によってのみ覆われた液体と空気の間の界面に留まるべきである。 排泄手順後の回復を容易にするために、最初の48時間は、レチン性外植を邪魔しないでください。 2日ごとに培地を変更します(48時間)。各ウェルから700 μLの培地を捨て、900 μLの新鮮なCMをウェルに加えます。このようにして、蒸発によって失われた培地の量が回収され、残りの外植は、前の48時間で産生される神経保護因子の一部を維持する。 除去された培地を分離した閉じたマイクロ遠心分離チューブに培養液と共にインキュベートし、汚染の可能性を評価(すなわち、培地の色の変化)を制御および評価する。注:レティナルの外植は、少なくとも2週間12のために文化に保つことができます。 3. 培養後 注:エクスプラントは、異なる実験アプリケーション(ウェスタンブロット、神学、全体のマウント、遺伝子解析、電気生理学)に使用することができます。アプリケーションに応じて、オルガノミカルな外植物は、凍結、凍結、または凍結切断のために調製スナップすることができます。以下の手順は、組織学的準備について説明します。 4%パラホルムアルデヒド(PFA)で45分間の固定を行い、続いて徐々にショ糖凍結保護(10分間10%スクロース、20分間20%、室温(RT)または4°Cで2時間(ON)で30%を行います。これらのバッファーをウェルに直接追加します。 植物の外植の周りの膜を切る。 凍結組織用の培地に膜とレチン組織の両方を埋め込みます。 図1:組織性のレチン系外植培養物の調製のためのステップバイステップの手順(A)マウスの目は、ヌクレオチドKの溶液に移され、クリテラと脈絡膜を、レチナとRPEから分離することを可能にする。・クリンラ/コロイド層に小さな切り傷が導入される。(B)強膜/脈絡膜層の剥離には2つの鉗子が使用される。(C)黒い脈絡膜層は剥離の間に見ることができる。下線暗い網膜色素上皮(RPE)は眼球に付着したままである。その後、眼神経と共に、鎖骨と脈絡膜が除去される。(D) レンズとガラス膜は鉗子で抽出される。 残りの毛様体は除去される。(E)レティナはボウル状を保持する。(F)皿で培養するためにレティナを平らにするために、4カットは、そのクローバーのような形状を与え、はさみで作られ、retinaの周りに等しい距離に作られています。このレチナ培養液は、切り取られた1mLピペットチップを用いて、6ウェルプレート内の膜培養インサートに移される。レティナはまだボウルの形の一部を保持しています。しかし、余分な液体を取り巻くレティナを取り除くと、平面構造に展開します。(G)培養膜のセットアップにおいて、レチナ培養は完全なR16培地の溶液の上に多孔質ポリカーボネート(PC)膜上に置かれている。生存率を確保するために、培養物は37°Cの加湿された無菌インキュベーターに5%CO2で保管する必要があり、培地は48時間ごとに交換する必要があります。