प्रोटोकॉल माउस न्यूरोरेटिनाके ऑर्गेनोटिपिक एक्सप्लांट का वर्णन करता है, जो सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त आर16 परिभाषित माध्यम में अपने रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) के साथ मिलकर खेती करता है। वीवो प्रयोगों की तुलना में यह विधि प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है, कम खर्चीला और समय लेने वाली है, और कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
नेत्र अनुसंधान में न्यूरोरेटिना के इन विट्रो मॉडल की सख्त जरूरत है। यहां, हम अक्षुण्ण रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) के साथ माउस न्यूरोरेटिना के ऑर्गेनोटिपिक खेती के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, रेटिना जंगली प्रकार के जानवरों से या रोग मॉडल से अलग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, अध्ययन करने के लिए, मधुमेह रेटिनोपैथी या वंशानुगत रेटिना अध: पतन । शुरुआती प्रसवोत्तर दिन से आंखें 2-9 जानवरों को एसेप्टिक परिस्थितियों में नाभिित किया जाता है। वे आंशिक रूप से प्रोटीन के में पचा रहे है आरपीई से choroid की एक टुकड़ी के लिए अनुमति देते हैं । स्टीरियोस्कोप के तहत, कॉर्निया में एक छोटा सा चीरा बनाया जाता है जिसमें दो किनारों का निर्माण किया जाता है जहां से कोरॉइड और स्क्लेरा को धीरे-धीरे आरपीई और न्यूरोरेटिना से छीला जा सकता है। इसके बाद लेंस को हटा दिया जाता है और आईकप को चार बिंदुओं में काटा जाता है ताकि इसे क्लोवर लीफ जैसा चार-अंकित आकार दिया जा सके । ऊतक अंततः एक सेल संस्कृति में एक फांसी ड्रॉप में स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें पॉलीकार्बोनेट कल्चर झिल्ली होती है। संस्कृतियों तो R16 माध्यम में बनाए रखा जाता है, सीरम या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना, पूरी तरह से परिभाषित शर्तों के तहत, एक मध्यम परिवर्तन के साथ हर दूसरे दिन ।
वर्णित प्रक्रिया रेटिना के अलगाव और कम से कम 2 सप्ताह की खेती अवधि के लिए अपने सामान्य शारीरिक और हिस्टोटीपिक संदर्भ के संरक्षण में सक्षम बनाती है। ये विशेषताएं ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों को उच्च भविष्य कहनेवाला मूल्य के साथ एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती हैं, रेटिना विकास, रोग तंत्र और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में अध्ययन के लिए, जबकि औषधीय स्क्रीनिंग को भी सक्षम बनाती हैं।
नेत्र अनुसंधान में, रेटिना का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के मॉडल उपलब्ध हैं, जिनमें प्राथमिक रेटिना सेल संस्कृतियां, रेटिना-व्युत्पन्न सेल लाइनें, रेटिना ऑर्गेनॉइड,और वीवो पशु मॉडल1,2, 3,4,5शामिल हैं। हालांकि, इनमें से प्रत्येक मॉडल कमियों से ग्रस्त है। उदाहरण के लिए, कोशिकाएं अलगाव में बढ़ती हैं जबकि रेटिना सेल-टू-सेल इंटरैक्शन की एक भीड़ के साथ एक जटिल नेटवर्क है। इस प्रकार, अलग-थलग कोशिका संस्कृतियों का व्यवहार पूरे ऊतक में देखे जाने की तुलना में कृत्रिम होने की संभावना है। इस समस्या को इन विट्रो विभेदित रेटिना ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके उपचारित किया जा सकता है, जिसका उपयोग विकास और बुनियादी जीव विज्ञान6का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। फिर भी, आज की तारीख में, रेटिना ऑर्गेनॉइड पीढ़ी अभी भी समय लेने वाली, श्रम-प्रधान है, और प्रजनन के मुद्दों से ग्रस्त है, ऑर्गेनॉइड से पहले पर्याप्त विकास कार्य की आवश्यकता होती है अनुवाद रेटिना अनुसंधान के लिए उपयोग किया जा सकता है। अंत में, जीवित जानवरों पर अध्ययन, जबकि यकीनन मॉडल है कि नेत्र अनुसंधान की आवश्यकताओं के निकटतम आता है, मजबूत नैतिक चिंताओं के साथ जुड़े रहे हैं । सेल कल्चर सिस्टम की दक्षता और वीवो पशु मॉडल में वास्तविक जीवन की स्थिति के बीच एक अच्छा समझौता ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां हैं। ऐसी संस्कृतियां पशु पीड़ा को भी कम करती हैं क्योंकि वीवो हस्तक्षेपों में कोई नहीं किया जाता है।
विभिन्न प्रजातियों के रेटिना एक्सप्लांट्स को बनाने के लिए कई तरीके बताए गएहैं। हमारा प्रोटोकॉल माउस न्यूरोरेटिना के अलगाव के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है जो इसके रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) के साथ होता है। यह तकनीक चूहे रेटिनासंस्कृतियोंके लिए भी उपयुक्त होगी । न्यूरोरेटीना की संस्कृति अपने आरपीई के साथ मिलकर सफलता के लिए बड़ा महत्व रखता है। आरपीई रेटिना के लिए आवश्यक कार्य करता है: पोषक तत्वों, आयनों, पानी, प्रकाश के अवशोषण और फोटोऑक्सीडेशन के खिलाफ सुरक्षा, 11-सीआईएस-रेटिना में सभी-ट्रांस-रेटिना का पुनः आइसोमराइजेशन, जो दृश्य चक्र के लिए महत्वपूर्ण है, शेड फोटोरिसेप्टर झिल्ली का फागोसिटोसिस, और रेटिना10 केसंरचनात्मक अखंडता के लिए आवश्यक कारकों का रहस्य। आरपीई को बनाए रखने से रेटिना को लंबेसमयतक व्यवहार्य रखते हुए फोटोरिसेप्टर बाहरी और आंतरिक खंडों के सफल विकास की अनुमति देता है। नीचे वर्णित प्रक्रिया रेटिना की हिस्टोटीपिक और शारीरिक विशेषताओं को कम से कम दो सप्ताह12तक सुरक्षित रखती है . इसके अलावा, सीरम-मुक्त, एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट्स को बनाने से अज्ञात पदार्थों की उपस्थिति से बचा जाता है और परिणामों की सीधी व्याख्या12सक्षम बनाती है।
रेटिना विकासऔर पतन7, 13,14पर हमारे ज्ञान में सुधार के लिए ऑर्गेनोटीपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां आवश्यक रही हैं । हम यहां दिखाते हैं कि वे औषधीय स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण भी हैं और उन्हें मधुमेह रेटिनोपैथी सहित विभिन्न प्रकार के रेटिना रोगों को मॉडल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल परिभाषित R16 माध्यम में बरकरार आरपीई के साथ माउस रेटिना की ऑर्गेनोटिपिक एक्सप्लांट संस्कृतियों का वर्णन करता है, सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त । यह प्रोटोकॉल मूल रूप से 1980 के दशक के उत्तरार्ध में7,28 में विकसित किया गया था और तब से इसे लगातार परिष्कृत किया गया है 6 ,11,12. उल्लेखनीय अनुप्रयोगों में वंशानुगत रेटिना अध: पतन के तंत्र में अध्ययन और रेटिनोप्रोटेक्टिव दवाओं की पहचान23,29,30शामिल हैं ।
सफल प्रयोग के लिए कुछ महत्वपूर्ण बातों को ध्यान में रखने की जरूरत है। संस्कृतियों की गुणवत्ता को बढ़ाने में मदद करने के लिए यहां कुछ महत्वपूर्ण समस्या निवारण बिंदु हैं। सबसे पहले, रेटिना संस्कृतियों अत्यधिक तह और/या थालीगठन 31प्रदर्शित कर सकते हैं । यह एक्सप्लांटेशन प्रक्रिया के दौरान एक संदंश के साथ रेटिना को छूने के कारण हो सकता है। इसके अलावा, सिलियरी शरीर को एक्सप्लांट से पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि यह संस्कृति के दौरान रेटिना तह को बढ़ा सकता है। दूसरा, एक फांसी ड्रॉप में अच्छी तरह से थाली में रेटिना के हस्तांतरण के दौरान, यदि रेटिना झिल्ली गलत पक्ष नीचे चेहरे, यह पिपेट टिप से फांसी ड्रॉप में रखने के लिए और बहुत धीरे में और टिप के बाहर मध्यम धक्का (फांसी ड्रॉप अलग बिना) रेटिना के आसपास फ्लिप करने के लिए । अंत में, यदि आरपीई रेटिना से स्क्लेरा और डिटैच से जुड़ा रहता है, तो यह स्क्लेरा के अपर्याप्त पूर्वचच के कारण सबसे अधिक संभावना है। यह समस्या विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकती है जब पुराने जानवरों या गैर-कृंतक प्रजातियों (जैसे, सूअर) से आंखों के साथ काम करते हैं और प्रोटीनक के एकाग्रता को बढ़ाकर हल किया जा सकता है।
ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों का संचालन एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए पर्याप्त प्रशिक्षण और अनुभव की आवश्यकता होती है। प्रशिक्षण की कमी रेटिना एक्सप्लांट की गुणवत्ता में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकती है। इन कारणों से, व्यवहार्यता और प्रजनन क्षमता की निगरानी और सत्यापन करना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, ट्यूनल परख के साथ सेल मृत्यु की दर। एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम का उपयोग रेटिना एक्सप्लांट बैक्टीरिया और कवक द्वारा संदूषण के लिए असुरक्षित बनाता है। इस जोखिम को कम करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि वास्तव में एसेप्टिक परिस्थितियों में काम करने के लिए विशेष देखभाल की जाती है। विट्रो रेटिना की खेती की एक और सीमा फिजियोकेमिकल वातावरण में अंतर है जब वीवो रेटिना (जैसे, कोरॉयडल और रेटिना रक्त की आपूर्ति, ऑक्सीजन और ग्लूकोज का स्तर, इंट्राओकुलर दबाव, वित्रीय की संरचना) की तुलना में। एक सतत पर्फ्यूजन सिस्टम, शायद एक समर्पित बायोरिएक्टर32 में एम्बेडेड इस मॉडल को वीवो स्थिति के करीब बना सकता है। इसके अलावा, रेटिना विच्छेदन के दौरान ऑप्टिक तंत्रिका की अक्षांती गैंगलियन सेल मौत का कारण बन जाएगी, जो तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकती है8। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि एक्सप्लांट को विशिष्ट हेरफेर या उपचार के अधीन होने से पहले विट्रो में कम से कम 2 दिनों के लिए खेती की स्थिति के अनुकूल होने के लिए छोड़ दिया जाए।
वर्णित विधि आमतौर पर अपरिपक्व रेटिना ऊतकों पर की जाती है, जो विट्रो7,33में 4 सप्ताह तक अच्छी तरह से जीवित रह सकती है। हालांकि, प्रक्रिया वयस्क रेटिना की खेती सहित विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल है। यद्यपि विभिन्न प्रकाशित दृष्टिकोण ों में वयस्क रेटिना के बिना उसके आरपीई34,35के अलगाव का वर्णन किया गया है , लेकिन विच्छेदन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक के लिए पापीन समाधान के साथ इनक्यूबेशन आरपीई को वयस्क माउस36से प्राप्त होने पर भी रेटिना से जुड़ा रहने की अनुमति देता है।
सीरम मुक्त माध्यम और रासायनिक रूप से परिभाषित इन विट्रो वातावरण प्रायोगिक स्थितियों के पूरी तरह से परिभाषित और प्रजनन योग्य हेरफेर के लिए प्रदान करता है। इसलिए, ऑर्गेनोटिपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां नेत्र विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में मूल्यवान उपकरण हैं, और रेटिना रोगों 37, रेटिना विकास38, 39,रेटिना स्टेम सेल थेरेपी40,आनुवंशिक संशोधनों41,और औषधीय स्क्रीनिंग का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। दवा परीक्षण के एक विशिष्ट उदाहरण के रूप में, यहां हमने एक सीजीएमपी एनालॉग (CN003) का परीक्षण करने के लिए रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों का उपयोग किया, जिसे विरासत में मिली रेटिना बीमारी23 (चित्रा 3B)के लिए पशु मॉडल में फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु को कम करने के लिए जाना जाता है। इस तकनीक का एक अन्य संभावित अनुप्रयोग चित्रा 3 सीमें वर्णित है , जो यह दर्शाता है कि मधुमेह की स्थितियों का अनुकरण करने के लिए ऊतक पर्यावरण के सटीक नियंत्रण का दोहन कैसे किया जा सकता है24. पूरे संस्कृति अवधि में ऊतक वास्तुकला के संरक्षण के कारण, ऑर्गेनोटीपिक रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियां इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों के लिए भी उपयुक्त हैं। रेटिना एक्सप्लांट्स पर न्यूरोनल कार्यक्षमता की जांच पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग42 और मल्टी-इलेक्ट्रोड-ऐरे (एमईए) रिकॉर्डिंग33,43का उपयोग करके की गई है। उत्तरार्द्ध एक ही समय में न्यूरोनल आबादी की विद्युत गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है और संस्कृति की स्थितियों में फोटोरिसेप्टर और गैंगलियन सेल कार्यक्षमता की विशेषता के लिए शोषण किया गया है। एक व्यापक परिप्रेक्ष्य में, ऑर्गेनोटिपिक एक्सप्लांट संस्कृति प्रणालियों को प्री-क्लीनिकल शोध में भी लागू किया जा सकता है, जहां हाइपोथर्मिया44की चिकित्सीय प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक्सप्लांट संस्कृतियों का उपयोग किया जाता था।
ऑर्गेनोथिपिक एक्सप्लांट ̈क्यूपिंग तकनीक प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल है और, जब वीवो प्रयोगों में इसी की तुलना में, कम खर्चीला और समय लेने वाला है, और जीवित पशु अध्ययन से संबंधित नैतिक चिंताओं से बचा जाता है। प्रायोगिक स्थितियों पर सटीक नियंत्रण और आरपीई और ऊतक जटिलता के संरक्षण विधि रेटिना शरीर विज्ञान और रोगविज्ञान पर हमारे ज्ञान में सुधार करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाने के लिए और कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों को सक्षम ।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध कार्य को यूरोपीय संघ(ट्रांसएमएड)से वित्तीय सहायता प्राप्त हुई । H2020-MSCA-765441), जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG; PA1751/8-1, 10-1) और चीन छात्रवृत्ति परिषद ।
Biotin | Sigma | B4639 | |
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
BSA | Sigma | B4639 | |
CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
FCS | Sigma | F7524 | |
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I6634 | |
L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
Progesteron | Sigma | P8783 | |
Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
R16 | Gibco | 07491252A | |
Retinol | Sigma | R7632 | |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
T3 | Sigma | T6397 | |
Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
Transferrin | Sigma | T1283 | |
Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
Vitamin C | Sigma | A4034 |