该协议描述了活细胞中蛋白质降解动力学的定量发光检测,这些活细胞已使用CRISPR / Cas9进行工程设计,以表达融合到目标蛋白质的无抗体内源性蛋白质检测标签。包括计算和获取定量降解参数、速率、Dmax、DC 50 和 Dmax50 的详细说明。
靶向蛋白质降解化合物,包括分子胶或蛋白水解靶向嵌合体,是小分子药物发现中令人兴奋的新治疗方式。这类化合物通过接近泛素化并最终通过泛素-蛋白酶体途径(UPP)降解靶蛋白所需的靶蛋白和E3连接酶机械蛋白来诱导蛋白质降解。然而,鉴于实现降解所需的细胞途径的复杂性,以高通量方式分析靶蛋白降解仍然极具挑战性。在这里,我们提出了一种基于使用11个氨基酸HiBiT标签对靶蛋白进行CRISPR / Cas9内源性标记的协议和筛选策略,该标签与LgBiT蛋白的高亲和力互补,以产生发光蛋白。这些具有内源性标签的CRISPR靶向细胞系可用于通过使用基于发光板的阅读器监测发光信号,在实时、动力学活细胞或终点裂解模式下测量化合物诱导的降解。在这里,我们概述了不同形式的推荐筛选方案,并描述了速率,Dmax,DC 50,Dmax50的关键降解参数的计算,以及细胞活力测定的多重分析。这些方法能够快速发现和分类早期化合物,同时保持相关细胞背景中靶蛋白的内源性表达和调节,从而可以有效优化先导治疗化合物。
靶向蛋白降解已成为小分子药物发现中增长最快的领域之一,这得益于免疫调节分子胶化合物(例如IMiD)在癌症治疗中的治疗成功,以及靶向嵌合体化合物1,2,3,4,5,6,7,8的蛋白水解早期临床试验数据,9,10,11,12.靶向蛋白质降解化合物通过将目标蛋白与E3连接酶机械蛋白1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12接近而起作用.这种化合物诱导的靶蛋白募集到E3连接酶中,通过泛素蛋白酶体途径(UPP)导致靶蛋白泛素化和降解1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.从历史上看,小分子药物发现筛选计划依赖于初始生化测定来评估活性并对化合物进行排序。然而,这对靶向蛋白质降解剂提出了重大挑战,其最终活性,即通过蛋白酶体降解,取决于一系列细胞事件1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17,18. 成功靶标降解所需的蛋白质复合物的多种途径和复杂性需要细胞测定方法对初始化合物进行早期筛选和分类。目前,严重缺乏在细胞环境中以高通量方式监测靶蛋白降解的技术的可用性14。在这里,我们将介绍使用CRISPR / Cas9内源性标记的HiBiT靶细胞系18,19,20进行实时动力学活细胞或终点裂解降解活性评估的协议,以监测用降解剂化合物10,11,18,19处理后通过发光测量监测目标蛋白的损失。
为了实现治疗靶点的成功降解并扩大可成药蛋白质组,已经出现了许多方法和类型的降解剂,它们可以靶向广泛的蛋白质进行破坏,包括位于质膜或质膜,溶酶体,线粒体膜,细胞质和细胞核中的蛋白质21-57。研究最广泛的两类化合物是分子胶和靶向 cimeras2,4,5,6,7,12,26 的蛋白质。分子胶是单价的,因此通常尺寸较小,并且在与E3连接酶组分2,12,26结合时促进与靶蛋白的新型蛋白质:蛋白质相互作用界面。它们最常见的降解剂与大脑(CRBN)E3连接酶成分2,12,26,55,56,57结合。最近,利用其他E3连接酶机制(如DCAF1558,59,60和CDK / Cyclin募集到DDB145)的令人兴奋的新例子表明了这类化合物的扩展潜力。相比之下,PROTAC是较大的二价分子,由靶标结合配体(通常是抑制剂)组成,通过化学接头桥接到E3连接酶手柄1,3,4,5,7,13。因此,这些化合物能够直接结合E3连接酶和靶蛋白1,3,4,5,7,13。许多蛋白质已被证明通过这些二价分子降解,最常用的E3连接酶手柄招募CRBN或Von Hippel Lindau(VHL)1,3,4,5,7,13。然而,在靶向蛋白水解设计的嵌合体中,用于E3连接酶募集的可用手柄数量正在迅速增长,扩大了这类化合物的能力,有可能降解不同的靶标类别以及增强细胞或组织类型的特异性24,48,61,62.结合结合对目标蛋白的最低要求,即使具有边际亲和力,降解化合物也有望扩大可药物蛋白质组。
表征蛋白质损失的细胞动力学以及处理后潜在的蛋白质回收对于了解降解化合物的功能和功效至关重要。虽然可以使用蛋白质印迹抗体测定或质谱法研究相关细胞系统中的内源性蛋白质水平变化,但这些方法难以适应高通量筛选形式,定量能力有限,或能够测量许多时间点的动力学变化14。为了应对这些挑战,我们开发了一种基于板的细胞发光系统,用于监测内源性蛋白质水平的变化,该系统利用11个氨基酸标签HiBiT的CRISPR / Cas9基因组插入到任何关键降解靶标18,19,20的位点。该肽与其结合伴侣LgBiT具有高亲和力,在其底物18,19,20,63存在下产生明亮的发光,从而使这些标记的内源性蛋白质在细胞或裂解物中发光18,19,20,63.用光度计仪器测量的相对光单位(RLU)与标记的靶蛋白水平18,19,20,63成正比。随着稳定的荧光素酶底物的发展,可以在24-48小时的时间范围内进行实时动力学蛋白质水平测量18,53,64。这允许在任何给定化合物浓度下确定任何给定目标的完整降解曲线,包括初始降解速率、降解最大值(Dmax)和化合物处理后回收率的定量分析18,53。然而,如果筛选大型降解化合物库,终点分析也可以很容易地以384孔格式在不同的药物浓度和指定时间进行。
本手稿中介绍的方案代表了靶向蛋白质降解化合物的细胞筛选策略,适用于所有类型的降解剂。然而,HiBiT CRISPR细胞系与这些方案的使用不仅限于蛋白质降解,而是用于监测任何内源性靶蛋白水平的通用工具,这些靶蛋白水平可以在处理后进行调节,以研究化合物甚至抗性机制的影响20,65,66。这些基于发光的检测方法的先决条件是CRISPR内源性标记的HiBiT靶细胞系,这是至关重要的,因为它能够进行灵敏的发光检测,同时仍保持内源性靶表达和天然启动子调节18,19,20。在利用CRISRP / Cas9插入基因组标签方面取得了重大进展,特别是在可扩展性20和高检测灵敏度方面,包括CRISPR池或具有杂合或纯合等位基因插入的克隆18,19,20。在细胞中使用HiBiT或其他报告基因融合的外源表达代替内源性标记是可能的,但使用具有蛋白质过表达的系统应非常谨慎14,18。这些可以导致理解真正的化合物效力和蛋白质回收动力学的伪影14,18,包括靶标降解后激活的潜在转录反馈环。此外,低效力的早期化合物可能会被遗漏,并在筛选中表现为假阴性。由于蛋白质损失可能由化合物诱导的毒性和细胞死亡引起,因此此处描述的方案包含强烈推荐但可选的细胞活力发光或荧光测定与降解方案配对。该方案有两个主要部分,裂解终点和活细胞动力学筛选。在每个部分中,都包括用于终点或动力学格式的多重细胞活力测量的选项。监测标记的内源性蛋白的变化需要与细胞中的LgBiT互补。因此,动力学筛选部分引用了引入此方法的重要方案,该协议可以通过瞬时或稳定表达来实现,并且对于执行活细胞发光测量至关重要。这里介绍的所有方法都可以对化合物进行快速排序和活性评估,从而实现早期化合物筛选工作和更快速地鉴定铅降解剂。
该协议旨在与HiBiT CRISPR细胞系一起研究降解化合物。在最近的几篇出版物18,19,20中概述了为许多靶标生成HiBiT CRISPR插入的协议。
我们在这里介绍了两种以终点裂解形式或活细胞动力学模式筛选降解化合物活性的方法。这些方法基于相同的发光测量原理,但提供了不同程度的细节和理解。任何一种方法的选择都可能取决于筛选目标和化合物库的大小。对于大型化合物筛选平台或主筛选以观察任何可检测到的降解,终点裂解筛选可提供灵敏高效的高通量兼容性,而其他终点方法(如蛋白质印迹或质谱)可能不切实际或难以适应14。这些筛选的起点可以用有限数量的浓度和时间点进行。推荐的初始测试浓度在100nM-10μM范围内,以解释初始降解剂具有低效力,较差的渗透性,或者在某些情况下具有高效化合物,存在钩效应。进一步建议至少测试两个不同的时间点,以确定4-6小时的早发降解和18-24小时的潜伏或持续降解。在4-6小时的时间范围内很容易观察到具有高降解效力和靶向机制的化合物,而仅在较晚的时间点观察到的降解或明显的蛋白质损失可能是由于多种机制。强烈建议在早期和晚期监测细胞活力,以便蛋白质损失可以与细胞死亡引起的损失解偶联。与任何类型的发光或荧光测定类似,文库中的化合物有可能干扰或抑制信号,因此,使用不相关的融合或替代方法来监测蛋白质水平的先导化合物的正交后续实验对于评估这些测定中RLU的损失与靶蛋白降解直接相关非常重要。
长时间以活细胞动力学形式进行筛选的能力在很大程度上依赖于测定信号到背景(S:B)。 影响S:B的因素包括靶蛋白本身的表达水平,可以跨越几个数量级,选择用于肽插入的细胞系中LgBiT表达的效率, 以及标记靶标在其各种天然复合物中互补的可用性。我们已经建立了一个一般截止要求,包括S:B为15,以成功测量使用恩杜拉嗪或维瓦嗪在动力学模式下的降解。S:B是通过测量在恩杜拉嗪或Vivazine活细胞底物存在下单独表达LgBiT的未编辑亲本细胞相对于共表达LgBiT的HiBiT编辑细胞的基线信号来确定的。Vivazine会产生更高的发光信号,但衰减速度比Endurazine快,并且可能将信号采集限制在24小时或更短时间内。此外,S:B也可能高度依赖于是使用CRISPR池还是克隆。对于更适合CRISPR / Cas9工程且具有高效率的细胞系中的靶标,编辑细胞的异质CRISPR池群可能具有足够的S:B用于动力学分析。对于更困难的细胞系中的靶标,其中通过CRISPR进行效率较低的基因组整合导致具有低S:B的池,分离CRISPR克隆对于富集编辑的群体并获得足够高的S:B以进行动力学分析可能是必要的。对于上述任何一种情况,如果恩杜拉嗪或维瓦嗪底物的 S:B 小于 15,建议进行终点裂解筛查。
为了更好地理解和表征化合物,包括使用定量参数测定降解曲线,推荐的筛选方法14,18在活细胞中进行实时动力学分析。与上面讨论的终点分析一样,初始动力学筛选可以在100nM-10μM范围内的有限数量的浓度下以高通量方式完成。在 384 孔格式中,可以在单个板上以一种浓度轻松筛选 100 多种化合物,一式三份。由此产生的降解曲线不仅可以为观察到的降解程度提供指导,还可以为降解速率、降解持续时间和蛋白质的潜在回收率提供指导14,18(图 2 和图 3)。降解曲线的形状也会产生有价值的信息。特异性和强效降解剂通常在几个小时内显示出靶蛋白的初始快速损失到平台期18,53,而其他机制(如转录反馈或化合物毒性)通常会导致蛋白质随着时间的推移而发生更线性的损失。终点裂解分析忽略了这些细节和细微差别,并且在24-48小时内进行实时分析,人们不必预测在一组新的或未知化合物中捕获真实Dmax的时间。
实时动力学还允许进行有效的剂量反应筛选,以更好地了解化合物功效、化合物浓度如何影响初始降解速率,并提供根据多个参数对化合物进行排名的可能性。降解效力的经典测量涉及基于表观降解最大值的特定时间点的 DC50 计算。相比之下,我们评估效力的动力学方法结合了每种浓度下的真实降解最大值,无论它何时在时间 18 中发生。我们将这种动力学降解效力的测量称为Dmax5018。以这种方式进行分析的化合物在较低浓度下可能更慢地引发降解,因此处理后需要更长的时间才能达到其Dmax。根据降解速率和Dmax对化合物进行排名可能特别有用。对于最有效的降解剂,这将进一步区分缓慢但有效的降解剂与快速有效的降解剂。利用HiBiT CRISPR细胞系进行裂解和活细胞动力学筛选是强大的方法,可以更全面地了解靶向蛋白质降解、化合物功能,并通过增强关键降解参数实现从初始活性评估到下游化学优化的筛选过程。
The authors have nothing to disclose.
K.M.R、S.D.M、M.U. 和 D.L.D 都是 Promega Corporation 的员工
CellTiter-Glo 2.0 reagent | Promega | G9241 | Cell Viability luminescent assay |
CellTiter-Fluor Cell Viability Assay | Promega | G6080 | Cell Viability fluorescent assay |
CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045-088 | Cell culture |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | For compound dilution and control |
DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
Fetal Bovine Serum | Seradigm | 89510-194 | Cell culture |
HEK293 LgBiT stable cell line | Promega | N2672 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
HiBiT CRISPR mammalian cell line | Promega | https://www.promega.com/crispr-tpd | |
Hygromycin B solution | Gibco | 10-687-010 | Cell culture |
LgBiT BacMam | Promega | CS1956C01 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
LgBiT Expression Vector | Promega | N2681 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
Luminometer Plate Reader | Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000) | ||
NanoGlo Endurazine live cell substrate | Promega | N2570 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo Vivazine live cell substrate | Promega | N2580 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo HiBiT Lytic Detection system | Promega | N3030 | Enpoint lytic HiBiT reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher) | ThermoFisher | 11058-021 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 96 well plate | Costar | 3917 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 384 well plate | Corning | 3570 | Cell culture |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25300 | Cell culture |