Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.
De hippocampus is een sterk georganiseerde structuur in de hersenen die deel uitmaakt van het limbische systeem en betrokken is bij geheugenvorming en consolidatie, evenals de manifestatie van ernstige hersenaandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer en epilepsie. De hippocampus krijgt een hoge mate van intra- en interconnectiviteit, waardoor een goede communicatie met interne en externe hersenstructuren wordt gewaarborgd. Deze connectiviteit wordt bereikt via verschillende informatiestromen in de vorm van vezelbanen. Hersensegmenten zijn een veelgebruikte methodologie bij het verkennen van neurofysiologische functies van de hippocampus. Hippocampale hersensegmenten kunnen voor verschillende toepassingen worden gebruikt, waaronder elektrofysiologische opnames, licht microscopische metingen en verschillende moleculaire biologische en histochemische technieken. Daarom vertegenwoordigen hersensegmenten een ideaal modelsysteem om eiwitfuncties te beoordelen, om patofysiologische processen te onderzoeken die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen en voor drugsontdekkingsdoeleinden.
Er bestaan verschillende manieren om preparaten te snijden. Brain slice preparaten met een vibratome zorgen voor een betere conservering van de weefselstructuur en garanderen een voldoende zuurstoftoevoer tijdens het snijden, wat voordelen biedt ten opzichte van het traditionele gebruik van een tissue chopper. Bovendien kunnen verschillende snijvlakken worden toegepast voor vibratome brain slice preparaten. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor een succesvolle voorbereiding van vibratome-gesneden horizontale hippocampale plakjes muishersenen. In tegenstelling tot andere segmentpreparaten maakt horizontaal snijden het mogelijk om de vezels van het hippocampale invoerpad (perforantpad) in een volledig intacte toestand binnen een segment te houden, wat het onderzoek naar entorhinal-hippocampale interacties vergemakkelijkt. Hier bieden we een grondig protocol voor de dissectie, extractie en acute horizontale snijden van het murine-brein en bespreken we uitdagingen en mogelijke valkuilen van deze techniek. Tot slot zullen we enkele voorbeelden laten zien voor het gebruik van hersensegmenten in verdere toepassingen.
De uitgebreide verkenning van de hippocampus begon toen Scoville en Milner het onvermogen van een patiënt (H.M.) meldden om nieuw, declaratief geheugen te vormen na chirurgische verwijdering van de hippocampus en nabijgelegen temporale kwabstructuren als een behandeling voor ernstige epilepsie1. Vanaf dat moment is de hippocampus uitgebreid bestudeerd, beginnend met algemene neuronale eigenschappen en functies tot de ontwikkeling van ernstige hersenaandoeningen, zoals epilepsie en de ziekte van Alzheimer2,3,4,5. De hippocampus maakt deel uit van het limbische systeem, bestaande uit een groep verwante hersenstructuren die betrokken zijn bij emotie en geheugenvorming6,7. Een dicht netwerk van verschillende vezelroutes bereikt een nauwe hippocampale connectiviteit met interne en externe hersenstructuren. Deze paden omvatten het mediale en laterale perforantpad (entorhinale cortex om gyrus, CA3 – CA1 en subiculum te deuken)8,het bemoste vezelpad (dentaat gyrus tot CA3)9 en het Schaffer collateral/associational commissural pathway (CA3 tot CA1)10 (Figuur 1). De hippocampus presenteert een van de meest breed verkende hersengebieden tot nu toe vanwege de sterk geconserveerde laminaire organisatie van de neuronale laagvorming en de mogelijkheid om vitale neuronale culturen en hersensegmenten met relatief gemak te verkrijgen5.
Figuur 1: Cartoon ter illustratie van de verschillende hippocampale regio’s en belangrijkste vezelroutes. De verschillende hippocampale gebieden worden aangegeven door effen gekleurde lijnen: entorhinale cortex (EC; zwart), dentate gyrus (DG; oranje), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyaan), 2 (geel) en 1 (magenta) en het subiculum (groen). Vezelpaden worden weergegeven met een gekleurde stippellijn: het mediale (MPP, rood) en het laterale perforantpad (LPP, blauw) (van de entorhinale cortex tot de dentaat gyrus, CA3, CA1 en subiculum), de bemoste vezelroute (MF, violet) (van de dentate gyrus naar CA3) en de Schaffer collateral (SC, brown) (ipsilateral van CA3 naar CA1)/associational commissural pathways (AC, lichtgroen) (contralaterale van CA3 naar CA1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hersensegmentprotocollen leiden vaak tot het verlies van verbindingen van verder weg gelegen hersengebieden naar het interessegebied5. Bovendien zijn de haarvaten niet langer functioneel5 en wordt de bloedcirculatie beroofd11. Ondanks deze beperkingen worden hersenplakken nog steeds voornamelijk gebruikt voor het onderzoek naar neurofysiologische functies van de hippocampus vanwege een aantal voordelen. Ten eerste is de extractie van de hippocampus snel12 en vereist niet veel materialen. De enige essentiële instrumenten zijn een dissectiekit, een laboratoriumwaterbad, toegang tot carbogen en een trillende microtome (vibratome)13. Andere troeven van de hersenschijftechniek zijn de omzeiling van de bloed-hersenbarrière (BBB) en de wash-out van endogeen vrijgekomen moleculen vóór het begin van het experiment5, waardoor het mogelijk is het effect van geneesmiddelen met relatief nauwkeurige doseringscontrole te bestuderen14. Bovendien behouden hersensegmenten de cyto-architectuur en synaptische circuits binnen de hippocampus15,16, waar de neuroanatomie en de lokale omgeving met neuronale connectiviteit en complexe neuron-glia-interacties behouden blijven4,11,17. Bovendien zijn hippocampale vezelverbindingen overwegend unidirectioneel en hippocampale neuronen hebben een hoge synaptische plasticiteit, wat de verzameling en interpretatie van hoogwaardige elektrofysiologische opnames enorm vereenvoudigt om neurologische processen te begrijpen18,19. Belangrijk is dat hersensegmenten een waardevol goed vormen dat toepasbaar is in een breed scala aan verschillende wetenschappelijke technieken, variërend van moleculaire biologische technieken over beeldvormingsopnamen tot elektrofysiologische metingen12,20,21,22,23,24,25,26.
Zoals hierboven beschreven, hippocampale hersensegmenten presenteren een krachtig experimenteel hulpmiddel om structurele en functionele kenmerken van de synaptische connectiviteit te bestuderen. Dit biedt de mogelijkheid om de effecten van chemicaliën of mutaties op neuronale prikkelbaarheid en plasticiteit te beoordelen16.
Acute hersenschijfpreparaten vormen een relatief gevoelige techniek en de optimale snijkwaliteit is sterk afhankelijk van ideale experimentele omstandigheden, waaronder de leeftijd van het dier, de euthanasiemethode, de snelheid van dissectie en snijden, de snijoplossingen en parameters (bijv. snijsnelheid) en de omstandigheden voor plakherstel4. Daarom is een goed ontworpen protocol van het grootste belang en beveiligt het de reproduceerbaarheid in verschillende onderzoekseenheden13.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor acute horizontale hippocampale plakpreparaten, met als doel de integriteit van het hippocampale laterale en mediale perforantpad en het bemoste vezelpad te behouden, waardoor het onderzoek naar dentaat gyrusgerelateerde processen mogelijk is9. We zullen in detail de belangrijkste stappen beschrijven om de murinehersenen te ontleden, te extraheren en horizontaal te snijden, gevolgd door representatieve resultaten van calcium-microfluorimetrische opnamen en veldopwekkende postsynaptische potentiële opnames (fEPSP’s) onder basisomstandigheden en tijdens LTP-inductieprotocollen in hersensegmenten van wilde type C57BL/6J-muizen.
Hoewel vaak gebruikt onder de neurowetenschappen gemeenschap, hersenen slice preparaten worden ook geconfronteerd met verschillende nadelen. Invoer- en uitvoerverbindingen met de interessegebieden van de hersenen zijn bijvoorbeeld niet langer verbonden in een hersensegment. Bovendien begint het weefsel, eenmaal geïsoleerd, langzaam af te smelten in de loop van de tijd en dit proces kan de fysiologische omstandigheden van het hersensegment veranderen. Dit onderwerp in het bijzonder is zeer zorgwekkend omdat de meeste opnames van hersensegmenten enkele minuten tot uren duren, wat resulteert in lange experimentele dagen met opnames uitgevoerd op weefsel dat tot 6-8 uur voor het begin van het experiment werd geïsoleerd. Bovendien worden de cerebrospinale vloeistof en bloedcirculatie onderbroken tijdens plakjepreparaten, wat kan leiden tot het ontbreken van belangrijke endogene verbindingen in een hersenschijf. En het meest duidelijk is dat de snijprocedure zelf mechanische weefselschade kan veroorzaken die de verkregen resultaten in gevaar kan brengen. De werkelijke voordelen van hersenschijfpreparaten wegen echter nog steeds op tegen hun nadelen, daarom presenteren ze een zeer gewaardeerde en gebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek.
Acute hippocampale hersensegmenten vormen een krachtige en daarom veel gebruikte techniek om neuronale processen te onderzoeken van moleculair niveau tot complexe hersencircuitstudies. Dit is gebaseerd op de ideale neuroanatomie van de hippocampus die gemakkelijk kan worden bewaard in een plakbereiding18. Bijgevolg worden hippocampale hersensegmenten gebruikt in een breed scala aan wetenschappelijke onderzoeksprojecten, waaronder geneesmiddelenscreenings17, studies naar neuronale en synaptische eigenschappen die betrokken zijn bij cognitieve functies40,41, en onderzoeken naar pathologische hersenaandoeningen14,42,43. Een breed spectrum van verschillende toepassingen veroorzaakt echter ook een breed scala aan beschikbare segmentvoorbereidingsprotocollen die kunnen verschillen in verschillende parameters, zoals dissectieomstandigheden en snijvlakoriëntatie, onder andere. Daarom moet de exacte onderzoeksvraag van een wetenschappelijk project worden bepaald om een geschikt plakvoorbereidingsprotocol te kiezen.
De tissue chopper presenteert een van de oudste gebruikte technieken om hippocampale hersenschijfjes44, 45te bereiden. De belangrijkste voordelen van deze bereidingsmethode zijn de lage kosten van de chopper en het snelle en gemakkelijke gebruik46. Weefselhakselaars veroorzaken echter mechanische stress die resulteert in morfologische veranderingen en celdood47. Ter vergelijking: de vibratome is een vrij dure machine en de tijd voor de bereiding van de plakjes wordt aanzienlijk verhoogd, wat van invloed kan zijn op de kwaliteit van de plak. De vibratome biedt echter meestal een zachtere manier om de plakjes van het weefsel te scheiden en maakt het mogelijk om de hersenen mooi gekoeld en zuurstofrijk te houden gedurende de hele isolatieprocedure, waardoor de plakeigenschappen worden verbeterd46. Daarom maken verschillende groepen standaard gebruik van deze techniek en hebben ze protocollen voorgesteld voor de voorbereiding van acute hippocampale hersensegmenten met behulp van de vibratome16,30,48. Hoewel sommige protocollen slechts een paar details bieden voor het snijden zelf, maar zich eerder richten op een specifieke toepassing van een dergelijke segmentvoorbereiding48, bieden andere gedetailleerde segmentprotocollen die verschillen in snijvlak of andere protocoldetails (bijv. agarose-inbeddings – of slice/recovery-oplossingen) die in dit artikel27,30worden gegeven .
Het hier beschreven protocol presenteert een eenvoudige methode om acute horizontale hippocampale muishersenenschijfjes van hoge kwaliteit van jonge dieren te bereiden. Het protocol is bijzonder nuttig om het perforantpad (mediaal en lateraal) te behouden dat het hippocampale invoerpad presenteert, dat projecteert van de entorhinale cortex naar de hippocampus8,49,50. Sagittale, coronale, evenals geïsoleerde hippocampus transversale plakpreparaten behouden het perforantpad niet goed, dat voornamelijk afkomstig is uit lagen II en V van de entorhinale cortex en projecten naar verschillende gebieden binnen de hippocampus18. Vanwege de anatomische positionering van de entorhinale cortex ten opzichte van de hippocampus zijn horizontale hersensegmenten een noodzaak om volledig intacte perforante padvezels binnen de plakvoorbereiding te behouden31. Bovendien behoudt horizontaal snijden idealiter de bemoste vezels die projecteren van de dentate gyrus naar de CA3-neuronen in de hippocampus9,30,50. Daarom is deze bereidingsmethode van grote waarde voor studies die hippocampale inputtrajecten en DG-gerelateerde processen onderzoeken. Bovendien maakt dit protocol het onderzoek van het Schaffer collateral pathway50mogelijk . Sagittale en coronale brain slice preparaten worden echter vaker gebruikt bij het onderzoeken van CA3 tot CA1 vezelprojecties, vermoedelijk vanwege hun iets snellere bereidingstijd die de kans op het verkrijgen van plakjes van hoge kwaliteit kan vergroten. Niettemin vormen horizontale hippocampale segmentpreparaten een krachtig onderzoeksinstrument, omdat het het behoud en onderzoek van alle hippocampale vezelroutes binnen één segment halfrond mogelijk maakt. Dit kan met name nuttig zijn wanneer circuitreacties worden bestudeerd, bijvoorbeeld in multi-elektrodetestopnamen.
Een grote zorg bij het bereiden van hersenschijfjes is het goed bewaren van het hersenweefsel. Dit wordt bereikt door verschillende kritieke stappen in ons protocol, waaronder een snelle dissectie, de continue en voldoende oxygenatie en koeling van het weefsel en de bescherming van het hersenweefsel door gebruik te maken van de beschermende snijmethode met een natriumarme, hoogsucrose snijoplossing39,51. Ondanks het feit dat het hier beschreven protocol een slagingspercentage van ongeveer 90% oplevert, kunnen mogelijk aanvullende beschermende stappen nodig zijn bij het werken met weefsel afkomstig van oudere of genetisch diverse dieren of bij het proberen een specifieke celpopulatie te behouden. Verschillende methoden werden al gemeld om gevoelige hersenweefselpreparaten te beschermen. Deze methoden omvatten het gebruik van op NMDG gebaseerde snijoplossingen om de natriumpermeatie52te verminderen , het gebruik van hoge magnesiumgehalten in de snijoplossing om NMDA-receptoractiviteit53te blokkeren , en het langdurige gebruik van beschermende oplossingen ook tijdens de herstelperiode23. Al deze maatregelen zullen resulteren in een verminderde excitotoxiciteit. Bovendien wordt vaak een transcardiale perfusie met ijskoude beschermende ACSF-oplossingen gebruikt en noodzakelijk bij het werken met oudere dieren27.
Acute hippocampale hersenplakken zijn bij uitstek geschikt en worden veel gebruikt voor elektrofysiologisch onderzoek om redenen zoals de hoge amplitudesignalen die kunnen worden verkregen uit een relatief dikke (300-500 μm) acute hersenschijf, die een hoge signaal-ruisverhouding11garandeert. Standaard gebruikte elektrofysiologische toepassingen omvatten extracellulaire veldopnamen en intracellulaire hele celopnamen in een spannings- of stroomklemmodus. Om elektrofysiologische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen, is de gezondheid van de segmenten van primair belang en kan worden gegarandeerd door het gepresenteerde protocol strikt te volgen. Aangezien plakpreparaten echter een zeer gevoelige techniek vormen, moet een kwaliteitscontrole routinematig worden opgenomen vóór het begin van elk experiment. Verschillende parameters kunnen worden gebruikt als kwaliteitscontrole van het segment en worden standaard beoordeeld via input-outputcurven en baseline fEPSP – of EPSC-opnamen19. Niettemin moet worden opgemerkt dat suboptimale elektrofysiologische eigenschappen kunnen voortvloeien uit experimentele fouten zoals elektrodepositionering, oriëntatie of zelfs schade en niet alleen de gezondheid van de bereide plak vertegenwoordigen. Daarom is het raadzaam om aanvullende kwaliteitscontroles uit te voeren, zoals eenvoudige visualisatie en beoordeling van de cellen onder een 40x-doelstelling of een DAPI-kernkleuring. Dergelijke kwaliteitscontroles kunnen worden gebruikt om de constante segmentstatus tijdens verschillende segmentvoorbereidingssessies te bevestigen.
Calciummicrofluorimetrie presenteert een minder vaak gebruikte techniek om hippocampale hersensegmenten te bestuderen. Deze techniek is echter van toegevoegde waarde voor de standaard extracellulaire en intracellulaire elektrode-opnamen, omdat het intracellulaire calciumfluxen kan visualiseren en kwantificeren, die van groot belang zijn bij neuronale en synaptische signalering. Veranderingen in intracellulaire calciumconcentraties zijn betrokken bij de afgifte van neurotransmitterblaasjes, postynaptische potentiële generatie, regulering van synaptische plasticiteit en axonale zenuwgeleiding54,55,56. Ter illustratie van deze techniek(figuur 4)hebben we gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare calciumkleurstof. Ontegenzeggelijk kan de behandeling van weefselplakken met calciumkleurstoffen problemen opleveren, zoals een verhoogd experimenteel tijdsbestek en inefficiënte belasting van lager gelegen neuronale cellen. Variaties op deze techniek kunnen echter worden gebruikt om deze technische uitdagingen te omzeilen. Het is bijvoorbeeld mogelijk om calciummetingen en patchklemopnames in hippocampale plakjes te combineren. Op deze manier kan een calcium-fluorescerende kleurstof via de patchpipet in een specifieke cel worden geladen, waardoor de metingen van de calciumdynamiek in één specifieke cel van belangzijn 57. Als alternatief kunnen genetisch gemanipuleerde dieren die de calciumindicator uitdrukken, GCaMP58, hetzij in de hele hersenen, hetzij aangedreven door een celspecifieke promotor, worden gebruikt. Interessant is dat hersenweefsel van GCaMP-dieren met een directe linker naar een eiwit van belang mogelijkheden kan bieden om het neuronale expressiepatroon te bepalen of de betrokkenheid bij calciumvonken en golven te onderzoeken.
Al met al bieden we de richtlijnen voor de succesvolle voorbereiding van gezonde en levensvatbare horizontale hippocampale hersenplakken van muizen voor elektrofysiologische en beeldvormingsopnames. Deze methodologie is zeer nuttig om toegang te krijgen tot neurologische veranderingen die optreden in hersenpathologieën die worden beschreven in de dentaat gyrus.
The authors have nothing to disclose.
We danken de afdeling Elektrofysiologie van het VIB-KU Leuven Centrum voor Hersen- en Ziekteonderzoek onder begeleiding van Dr. Keimpe Wierda en Prof. Dr. Joris De Wit voor het gebruik van hun onderzoeksfaciliteiten. Verder bedanken we alle leden van het Laboratorium voor Ionenkanaalonderzoek en het Laboratorium voor Endometrium, Endometriose en Reproductieve Geneeskunde van de KU Leuven voor hun nuttige discussies en opmerkingen.
Dit project heeft financiering ontvangen van de Onderzoeksstichting-Vlaanderen (G.084515N en G.0B1819N aan J.V.) en de Onderzoeksraad van de KU Leuven (C1-funding C14/18/106 aan J.V.). K.P. is een FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow en ontving financiering van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie subsidieovereenkomst (665501) met de Onderzoeksstichting Vlaanderen (FWO) (12T0317N). K.H. is postdoctoraal fellow van de Onderzoeksstichting Vlaanderen, België (12U7918N).
Anesthesia chamber | home made – Generic | N/A | plexiglas |
Anesthesia vaporizer | Dräger & MSS International Ltd | Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane | to vaporize isoflurane for rodent anesthetization |
Barrels for the perfusion system | TERUMO | Hypodermic syringes without needle | https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html |
Bicuculline methiodide | hellobio | HB0893 | https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html |
Borosilcate glass capillaries | Science Products | GB150F-8P | https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished |
Calcium chlorid dihydrate | Merck | 102382 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Calcium Imaging software | Till Photonics | LiveAcquisition v2.3.0.18 | |
Carbogen tank | Air Liquide | Alphagaz mix B50 | Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5 |
Cluster microelectrode | FHC | CE2C55 | https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/ |
Culture dish (35 mm) | Corning Life Sciences | 353001 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001 |
Culture dish (90 mm) | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20 |
Curved forceps | Fine Science tools | 11270-20 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20 |
D-AP5 | hellobio | HB0225 | https://www.hellobio.com/dap5.html |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma Aldrich | 16301 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE |
Digital CMOS camera | HAMAMATSU | ORCA-spark C11440-36U | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html |
Dissection scissors | Fine Science tools | 14058-09 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09 |
DNQX | hellobio | HB0262 | https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html |
EMCCD camera | Andor | iXon TM + DU-897E-CSO-#BV | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE |
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier | HEKA Elektronik | 895278 | https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf |
Filter paper | VWR | 516-0818 | grade 413 |
Fine brush | Raphael Kaerell | 8204 | Size #1 |
18G needle | Henke Sass Wolf Fine-Ject | 18G X 1 1/2" 4710012040 | https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/ |
Isoflurane | Dechra Veterinary Products | Iso-Vet 1000mg/g | 250 ml bottle |
Loctite 406 | Henkel Adhesive technologies | Loctite 406 | Super glue |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-10 with SM-7 remote control system | https://www.luigs-neumann.org |
Microscope (for calcium imaging) | Olympus | BX51WI | https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/ |
Microscope (for ephys recordings) | Zeiss | Axio Examiner.A1 | https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/ |
Microscope light source | CAIRN Research | dual OptoLed power supply | https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/ |
Monochromator | Till Photonics | Polychrome V | |
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) | Sigma Aldrich | M3262 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE |
Oregon Green® 488 BAPTA-1 | Invitrogen Molecular Probes | #06807 | 10x50ug |
Osmometer | Wescor | 5500 vapor pressure osmometer | to verify osmolarity of salt solutions |
Peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | Masterflex C/L 77120-62 | https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229 |
pH meter | WTW | inoLab series pH 720 | https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html |
Potassium chlorid | Chem-lab | CL00.1133 | https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528 |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Razor blade to prepare hemispheres | SPI supplies | Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10 | GEM Scientific Single Edge Razor Blades |
Razor blade for vibratome | Ted Pella Inc | 121-6 | double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel) |
Recovery chamber | home made – Generic | N/A | to collect and store brain slices in (see details in manuscript) |
Scissors | Any company | N/A | Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation |
Silver electrode wire | Any company | for recording and reference electrodes | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merck | 106342 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Sodium hydrogen carbonate | Alfa Aesar | 14707 | https://www.alfa.com/en/catalog/014707/ |
Sodium chlorid | Fisher Scientific | S/3160/60 | https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420 |
Software for field recordings | HEKA Elektronik | PatchMaster | https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf |
Spatula | Sigma Aldrich | S9147-12EA | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE |
Stimulator | A.M.P.I | ISO-FLEX | http://www.ampi.co.il/isoflex.html |
Sucrose | VWR International Ltd. | 102745C | https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 | Warner Instruments | 64-0167 | Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 | Fisher Scientific | 800/100/200 & 800/100/280 | Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing |
Vacuum pump | home made – Generic | N/A | |
8 valve multi-barrel perfusion system | home made | N/A | consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table) |
Magnetic valves (to control the perfusion lines) | NResearch Inc. | p/n 161P011 | https://nresearch.com/ |
Vibratome | Leica | 14912000001 | Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200 |
Water bath | Memmert | WNB 7 | https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf |
Water purification system | Merck | Synergy millipore | to obtain highly purified water |
12-well plates | Greiner Bio-One | CELLSTAR, 665180 | http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf |