Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

La medición electrofisiológica de las rodajas de hipocampo vivos in vitro es un potente enfoque experimental con numerosas ventajas. El experimentador puede utilizar un microscopio, micromanipuladores y un sistema de grabación para visualizar y recopilar directamente mediciones de neuronas individuales en el tejido. Las rodajas de tejido también son muy accesibles para la fototimulación o la administración de fármacos para experimentos optogenéticos, químicos o farmacológicos.

La red hipocampal genera una actividad poblacional altamente sincrónica in vivo,visible como oscilaciones en el potencial de campo local extracelular^1,2,3,4,5. Los métodos de corte cerebral se han aprovechado para obtener información sobre los mecanismos celulares y de circuito subyacentes a estas oscilaciones de la red neuronal. El trabajo fundacional de Maier et al. demostró que los complejos afilados de onda-ondulación (SWR) pueden emerger espontáneamente en rodajas del hipocampo ventral^6,7. Estudios posteriores de múltiples investigadores han aclarado gradualmente muchos aspectos de los SWR, incluyendo el papel de los neuromoduladores en la regulación del estado de red del hipocampo^8,9,10 y los mecanismos sinápticos que impulsan la reactivación in vitro de conjuntos neuronales previamente activos durante el comportamiento in vivo^11. Los experimentos de corte cerebral también han proporcionado información sobre la oscilación del rango gamma (30-100 Hz), un estado de red hipocampal distinto que se cree que admite la codificación de memoria y la recuperación^12,13. Por último, reconociendo el papel central del hipocampo y las estructuras asociadas en la fisiopatología de la epilepsia del lóbulo temporal^14,15,los investigadores han utilizado preparaciones de rebanadas de hipocampo para investigar la generación y propagación de la actividad epileptiforme. Carter y otros demostraron que las rodajas combinadas de corteza hipocampal-entorrinal preparadas a partir de animales crónicamente epilépticos pueden generar espontáneamente descargas epileptiformes in vitro^16. Posteriormente, Karlócai et al. exploró los mecanismos subyacentes a las descargas epileptiformes en rodajas de hipocampo mediante el uso de líquido cefalorraquídeo artificial modificado (ACSF) con concentraciones de iones alteradas (mg²⁺ reducido o K⁺elevado) o medicamentos añadidos (4AP o gabazina)^17.

Los investigadores han desarrollado numerosos enfoques de rebanadas de hipocampo que difieren de maneras clave: (1) la región del hipocampo contenida en la rebanada (dorsal, intermedia o ventral); 2) la presencia o ausencia de tejidos extrahippocampales como la corteza entorrina; (3) la orientación utilizada para cortar rodajas (coronales, sagitales, horizontales u oblicuas); y (4) las condiciones en las que se mantiene el tejido después del corte (sumergido completamente en ACSF o mantenido en la interfaz de ACSF y aire humidificado y rico en carbohidratos).

La elección de qué enfoque de corte debe determinarse mediante el objetivo experimental. Por ejemplo, las rodajas transversales o coronales del hipocampo dorsal mantenido en condiciones sumergidas se han utilizado muy eficazmente para la investigación de circuitos intrahippocampales y plasticidad sináptica^18,19,20. Sin embargo, tales preparaciones no generan espontáneamente oscilaciones de red tan fácilmente como las rebanadas del hipocampo ventral^21,22,23. Aunque un estado de actividad persistente de SWR puede ser inducido por estimulación tetánica en rodajas transversales del hipocampo dorsal y ventral^24,los SWR espontáneos se observan más fácilmente en las rodajas ventrales^7,25.

Una distinción fisiológica y anatómica inherente entre el hipocampo dorsal y ventral está respaldada por estudios realizados tanto in vivo como in vitro^26. Las grabaciones en ratas revelaron ritmos theta fuertemente coherentes a lo largo del hipocampo dorsal e intermedio, pero mala coherencia entre la región ventral y el resto del hipocampo^27. Los SWR in vivo se propagan fácilmente entre el hipocampo dorsal e intermedio, mientras que los SWR que se originan en el hipocampo ventral a menudo permanecen locales^28. Las proyecciones asociacionales originadas a partir de neuronas piramidales CA3 que residen en el hipocampo dorsal e intermedio proyectan largas distancias a lo largo del eje longitudinal del hipocampo. Las proyecciones ca3 procedentes de regiones ventrales siguen siendo relativamente locales y, por lo tanto, tienen menos probabilidades de ser cortadas durante el proceso de corte^29,30. Por lo tanto, las rodajas ventrales pueden conservar mejor la red recurrente necesaria para generar sincronia de población. La propensión de las rodajas ventrales a generar actividades espontáneas de red in vitro también puede reflejar una mayor excitabilidad intrínseco de las neuronas piramidales o una inhibición GABAérgica más débil en el hipocampo ventral en comparación con las regiones más dorsales^31. De hecho, las rodajas de hipocampo ventral son más susceptibles a la actividad epileptiforme^32,33. Así, muchos estudios de oscilaciones fisiológicas espontáneas de red^8,9,11,24 o patológicas^16,34,35,36 han utilizado tradicionalmente un enfoque de corte horizontal, a veces con un ligero ángulo en la dirección fronto-occipital, que produce rodajas de tejido paralelas al plano transversal del hipocampo ventral.

La conectividad de red se ve inevitablemente afectada por el procedimiento de corte, ya que muchas celdas del sector se cortarán. El ángulo y el grosor de la rebanada y el tejido retenido en la preparación deben considerarse para optimizar la conectividad en los circuitos de interés. Muchos estudios han utilizado rodajas horizontales combinadas de corteza hipocampal-entorrinales (HEC) para explorar interacciones entre las dos estructuras en el contexto de oscilaciones fisiológicas o patológicas de la red. Roth et al. realizaron grabaciones duales desde el subcampo CA1 del hipocampo y la capa V de la corteza entorrinal medial para demostrar la propagación de la actividad SWR a través de la rebanada^{HEC 37.} Muchos estudios de actividad epileptiforme han utilizado la preparación de la rebanada HEC para investigar cómo se propagan las descargas epileptiformes a través de la red corticohippocampal^16,35,36,38. Es importante tener en cuenta que la preservación del bucle corticohippocampal intacto no es un requisito previo para los SWR espontáneos, descargas epileptiformes o oscilaciones gamma; las oscilaciones de red se pueden generar en rodajas transversales del hipocampo dorsal o ventral sin tejidos parahippocampales unidos^{21,22,23, 25,39,40,41.} Un factor más importante para la generación espontánea de oscilaciones de red en rodajas de hipocampo puede ser el grosor de cada rebanada, ya que una rebanada más gruesa (400-550 μm) preservará más conectividad en la red recurrente CA2/CA3^21,22,25.

Aunque se han utilizado rodajas HEC horizontales en ángulo (cortadas con un ángulo aproximado de 12° en la dirección fronto-occipital) para estudiar la conectividad funcional del bucle corticohippocampal^{11,16,34,35,42,}tales preparaciones en ángulo no son necesarias para la actividad espontánea de la red^43,44,45. Sin embargo, el uso de un plano de corte en ángulo permite al investigador hacer selectivamente rodajas que conserven mejor las lamellas orientadas transversalmente del hipocampo ventral o intermedio, dependiendo de si se aplica un ángulo hacia abajo o hacia arriba(Figura 1). Este enfoque es conceptualmente similar al utilizado por Papatheodoropoulos et al., 2002, que diseccionó cada hipocampo libre y luego utilizó un helicóptero de tejido para crear rodajas transversales a lo largo de todo el eje dorsal-ventral^21. A la luz de las distinciones funcionales antes mencionadas entre el hipocampo ventral y dorsal-intermedio, los investigadores deben considerar el origen anatómico de las rodajas al diseñar experimentos o interpretar resultados. El uso de una rampa de agar durante el procedimiento de corte es una manera sencilla de producir preferentemente rodajas del hipocampo intermedio o ventral.

Las rodajas de hipocampo se pueden mantener en una cámara sumergida (con el tejido completamente sumergido en ACSF), o una cámara de estilo interfaz (por ejemplo, cámara Oslo o Haas, con rodajas cubiertas sólo por una fina película de medios que fluyen). El mantenimiento de la interfaz mejora la oxigenación del tejido, que promueve la supervivencia neuronal y permite niveles altos sostenidos de actividad interneuronal. Tradicionalmente, las condiciones de registro sumergidas utilizan un caudal de ACSF más lento que no proporciona una oxigenación adecuada del tejido para una expresión estable de las oscilaciones a nivel de red. En las rodajas de hipocampo sumergido oscilaciones gamma inducidas por carbachol sólo se observan transitoriamente^46,47, mientras que se pueden mantener establemente en las cámaras de grabación de interfaz^10,48,49. Como tal, muchos estudios de actividad espontánea compleja in vitro se han basado en cámaras de registro de interfaz para investigar complejos de ondulación de ondulación aguda^{6,7,8,9,10,25,37,}oscilaciones gamma^10,13,y actividad epileptiforme^16,38,45,47.

En una cámara de grabación de estilo sumergido, se puede utilizar un objetivo de microscopio de inmersión para visualizar células individuales y dirigirse selectivamente a células de aspecto saludable para grabaciones. La preparación sumergida también permite un control fino sobre el entorno celular, ya que la inmersión facilita la rápida difusión de fármacos u otros compuestos al tejido. Por lo tanto, una metodología modificada en la que se mantienen oscilaciones estables de la red en condiciones sumergidas representa un enfoque experimental potente. Este enfoque se ejemplifica con el trabajo de Hájos et al., en el que las rodajas de hipocampo se recuperan en una cámara de sujeción simplificada de estilo interfaz durante varias horas antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida modificada con un alto caudal de ACSF (~6 mL/min) para mejorar el suministro de oxígeno al tejido^12,48,49. En estas condiciones, se pueden mantener altos niveles de actividad interneuron y oscilaciones espontáneas estables de la red en una cámara de grabación sumergida. Este enfoque modificado permite a los investigadores realizar grabaciones de abrazaderas de parches de células enteras guiadas visualmente y caracterizar la contribución de los tipos celulares identificados morfológicamente a las oscilaciones gamma inducidas por carbachol^12. Los SWR también pueden ocurrir espontáneamente en rodajas de hipocampo sumergidas con un caudal rápido de ACSF^11,48,49. Maier et al. demostraron que las rodajas de hipocampo que se recuperaban en una cámara de interfaz antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida mostraban de forma fiable swrs espontáneos, mientras que las rodajas que se recuperaban sumergidas en un vaso de precipitados antes de ser transferidas a una cámara de grabación sumergida mostraban respuestas de campo evocadas más pequeñas, niveles más bajos de corrientes sinápticas espontáneas, y sólo muy rara vez mostraban SWR espontáneos^43. Schlingloff et al. utilizaron esta metodología mejorada para demostrar el papel de las células de cesta que expresan parvalbumina en la generación de SWR^{espontáneos 44}.

El siguiente protocolo presenta un método de corte a través del cual las neuronas espontáneamente activas en rodajas de hipocampo horizontal pueden recuperarse en condiciones de interfaz y posteriormente mantenerse en una cámara de grabación sumergida adecuada para manipulaciones farmacológicas u optogenéticas y grabaciones guiadas visualmente.