حاد الدماغ الماوس تشريح للتحقيق عفوية نشاط شبكة فرس النهر

القياس الكهربائي من شرائح فرس النهر الحية في المختبر هو نهج تجريبي قوي مع العديد من المزايا. يمكن للمجرب استخدام المجهر ، micromanipulators ، ونظام تسجيل لتصور مباشرة وجمع القياسات من الخلايا العصبية الفردية في الأنسجة. شرائح الأنسجة هي أيضا في متناول جدا للتجارب الضوئية أو المخدرات أو تسليم للتجارب optogenetic، كيموجينيك، أو الدوائية.

شبكة فرس النهر يولد النشاط السكاني متزامن للغاية في الجسم الحي، مرئية كما التذبذبات في المجال المحلي خارج الخلية المحتملة^{1،2،3،4،5.} وقد تم الاستفادة من أساليب شريحة الدماغ للحصول على نظرة ثاقبة في الآليات الخلوية والدوائر الكامنة في هذه التذبذبات شبكة الخلايا العصبية. العمل التأسيسي من ماير وآخرون أظهرت أن مجمعات موجة حادة تموج (SWRs) يمكن أن تظهر تلقائيا في شرائح من الحصين البطني^6,7. وقد أوضحت الدراسات اللاحقة من العديد من المحققين تدريجيا العديد من جوانب SWRs، بما في ذلك دور neuromodulators في تنظيم حالة شبكة قرن آمون^8،9،10 والآليات متشابك التي تدفع إعادة تنشيط في المختبر من الفرق العصبية النشطة سابقا خلال السلوك في الجسم الحي¹¹. كما وفرت تجارب شريحة الدماغ نظرة ثاقبة في تذبذب نطاق جاما (30-100 هرتز)، وهي حالة شبكة فرس النهر متميزة يعتقد أنها تدعم ترميز الذاكرة واستدعاء^12،13. وأخيرا، الاعتراف بالدور المركزي لحصان القرن والهياكل المرتبطة بها في الفيزيولوجيا المرضية للصرع الفص الصدغي^14،15، وقد استخدم الباحثون الاستعدادات شريحة قرن آمون للتحقيق في توليد وانتشار نشاط الصرع. أثبت كارتر وآخرون أن شرائح قشرة الأنف المدمجة المعدة من الحيوانات المصابة بالصرع المزمن يمكن أن تولد تلقائياً إفرازات الصرع في المختبر¹⁶. في وقت لاحق، Karlócai وآخرون استكشاف الآليات الكامنة الكامنة في إفرازات الصرع في شرائح فرس النهر باستخدام السائل النخاعي الاصطناعي المعدل (ACSF) مع تركيزات أيونة معدلة (مخفضة Mg²⁺ أو مرتفعة K⁺) أو الأدوية المضافة (4AP أو gabazine)¹⁷.

وقد طور المحققون العديد من نهج شريحة قرن آمون التي تختلف بطرق رئيسية: (1) منطقة الحصين الواردة في الشريحة (الظهرية، وسيطة، أو فينتيال)؛ (1) منطقة الحصين الموجود في شريحة فرسان( (2) وجود أو عدم وجود أنسجة خارج المخيمات مثل قشرة الأنف؛ (3) التوجه المستخدم لقطع شرائح (إكلية، القوس، الأفقي، أو مائل)؛ و (4) الظروف التي يتم الحفاظ على الأنسجة بعد التقطيع (مغمورة بالكامل في ACSF أو عقدت في واجهة ACSF ورطوبة، وcarogen الغنية الهواء).

اختيار أي نهج تشريح للاستخدام ينبغي أن يحددها الهدف التجريبي. على سبيل المثال، تم استخدام شرائح عرضية أو إكليلية من الحصين الظهري الحفاظ على الظروف المغمورة بشكل فعال جدا للتحقيق في الدوائر داخل الحمل واللدونة متشابك^18،19،20. ومع ذلك، فإن مثل هذه الاستعدادات لا تولد تلقائيا التذبذبات الشبكة بسهولة كما شرائح من الحصين البطني^21،22،23. على الرغم من أن حالة من نشاط SWR المستمر يمكن أن يكون سببها التحفيز tetanic في شرائح عرضية من الحصين الظهري والبينتال²⁴, ويلاحظ أكثر SWRs عفوية بسهولة في شرائح بطنية^7,25.

ويدعم التمييز الفسيولوجية والتشريحية المتأصلة بين الحصين الظهري وقنين البطني من خلال الدراسات التي أجريت في كل من الجسم الحي وفي المختبر²⁶. وكشفت التسجيلات في الفئران إيقاعات ثيتا متماسكة بقوة في جميع أنحاء الحصين الظهري والمتوسط، ومع ذلك ضعف التماسك بين منطقة البطن وبقية الحصين²⁷. SWRs في الجسم الحي تنتشر بسهولة بين الحصين الظهري والمتوسط، في حين SWRs التي تنشأ في الحصين البطني غالبا ما تبقى المحلية²⁸. الإسقاطات الجمعياتية التي تنشأ من الخلايا العصبية الهرمية CA3 التي توجد في مشروع الحصين الظهري والمتوسط مسافات طويلة على طول المحور الطولي من الحصين. CA3 التوقعات التي تنشأ من المناطق فينترال لا تزال محلية نسبيا، وبالتالي أقل احتمالا أن تكون مقطوعة خلال عملية تشريح^29،30. لذلك، قد تحافظ شرائح البطينال على الشبكة المتكررة اللازمة لتوليد تزامن السكان. قد يعكس ميل شرائح البطن لتوليد أنشطة الشبكة العفوية في المختبر أيضًا إثارة جوهرية أعلى للخلايا العصبية الهرمية أو تثبيط GABAergic الأضعف في الحصين البطني مقارنة بالمناطق الظهرية³¹. في الواقع، شرائح فرس النهر البطني هي أكثر عرضة لنشاط الصرع^32،33. وهكذا، استخدمت العديد من الدراسات الفيزيولوجية العفوية^8،9،11،24 أو المرضية^{16،34،35،36} تذبذب شبكة تقليديا نهج التقطيع الأفقي ، وأحيانا مع زاوية طفيفة في اتجاه الأمامية القذال ، والتي تنتج شرائح الأنسجة موازية للطائرة عرضية من الحصين البطني.

يتأثر اتصال الشبكة بشكل لا مفر منه من قبل إجراء التقطيع حيث سيتم قطع العديد من الخلايا في الشريحة. وينبغي النظر في زاوية وسمك شريحة والأنسجة التي تحتفظ بها في إعداد لتحسين الاتصال في دوائر الاهتمام. وقد استخدمت العديد من الدراسات الأفقية مجتمعة شرائح قشرة entorhinal فرس النهر (HEC) لاستكشاف التفاعلات بين الهيكلين في سياق التذبذبات الفسيولوجية أو المرضية الشبكة. روث وآخرون تنفيذ تسجيلات مزدوجة من ca1 subfield من الحصين وطبقة V من القشرة entorhinal وسيط لإثبات انتشار نشاط SWR من خلال شريحة HEC³⁷. وقد استخدمت العديد من الدراسات من النشاط الصرع إعداد شريحة HEC للتحقيق في كيفية انتشار إفرازات الصرع من خلال شبكة كورتيكوهيبابوكامبال^16,35,36,38. من المهم أن نلاحظ أن الحفاظ على حلقة الكورتيكوهيبابوكامبال سليمة ليست شرطا مسبقا لSWRs عفوية, إفرازات الصرع, أو ذبذبات غاما; يمكن أن تنشأ التذبذبات الشبكية في شرائح عرضية من الحصين الظهري أو البطني مع عدم وجود أنسجة باراهيبابوكامبي المرفقة^{21،22،23، 25،39،40،41}. وهناك عامل أكثر أهمية لتوليد التلقائية من التذبذبات الشبكة في شرائح فرس النهر قد يكون سمك كل شريحة، كما شريحة سمكا (400-550 μm) سوف تحافظ على المزيد من الاتصال في CA2/CA3 شبكة متكررة^21،22،25.

على الرغم من أن شرائح هيك الأفقي الزاوية (قطع مع ما يقرب من 12 درجة زاوية في اتجاه الأمامية القذالي) وقد استخدمت لدراسة الاتصال الوظيفي من حلقة كورتيكوهيبابوكامبال^{11,16,34,35,42}, لا يلزم مثل هذه الاستعدادات الزاوية لنشاط شبكة عفوية^43,44,45. ومع ذلك ، فإن استخدام طائرة تشريح الزاوية لا يسمح للمحقق لجعل انتقائي شرائح تحافظ على أفضل شكل من الأشكال على lamellae عرضية المنحى من قرن آمون البطني أو المتوسط ، اعتمادا على ما إذا كان يتم تطبيق زاوية نزولية أو تصاعدية(الشكل 1). هذا النهج هو مشابه من الناحية المفاهيمية لتلك التي يستخدمها Papatheodoropoulos وآخرون، 2002، الذين تشريح كل قرن آمون الحرة ثم استخدم مروحية الأنسجة لإنشاء شرائح عرضية على طول المحور البطني الظهري بأكمله²¹. في ضوء التمييز الوظيفي المذكور أعلاه بين قرن آمون البطني والحصن الظهري الوسيط، ينبغي للمحققين النظر في الأصل التشريحي للشرائح عند تصميم التجارب أو تفسير النتائج. استخدام منحدر أجار أثناء إجراء تشريح هو وسيلة بسيطة لإنتاج شرائح بشكل تفضيلي من إما قرن آمين المتوسطة أو البطنية.

يمكن الحفاظ على شرائح فرس النهر إما في غرفة مغمورة (مع الأنسجة مغمورة بالكامل في ACSF) ، أو غرفة على غرار الواجهة (مثل غرفة أوسلو أو هاس ، مع شرائح مغطاة فقط بغشاء رفيع من الوسائط المتدفقة). صيانة واجهة يعزز الأوكسجين من الأنسجة, الذي يعزز بقاء الخلايا العصبية ويسمح لمستويات عالية مستدامة من النشاط interneuronal. تقليدياً، تستخدم ظروف التسجيل المغمورة معدل تدفق أبطأ ACSF لا يوفر الأكسجين الكافي للأنسجة للتعبير المستقر عن التذبذبات على مستوى الشبكة. في فرس النهر المغمورة شرائح تذبذبات غاما الناجمة عن carbachol لوحظ فقط عابرة^46،47، في حين أنها يمكن أن تكون ثابت في غرف تسجيل واجهة^10،48،49. على هذا النحو، وقد اعتمدت العديد من الدراسات من النشاط العفوي المعقدة في المختبر على غرف تسجيل واجهة للتحقيق في مجمعات موجة حادة تموج^{6،7،8،9،10،25،37}، ذبذبات غاما^10،13، والنشاط الصرع^{16،38،45،47}.

في غرفة تسجيل على غرار مغمورة، يمكن استخدام هدف المجهر الغمر لتصور الخلايا الفردية واستهداف انتقائي الخلايا صحية المظهر للتسجيلات. كما يسمح الإعداد المغمور بالسيطرة الدقيقة على الوسط الخلوي ، حيث يسهل الغمر الانتشار السريع للأدوية أو المركبات الأخرى في الأنسجة. وهكذا، فإن أي منهجية معدلة يتم فيها الحفاظ على التذبذبات الشبكية المستقرة في ظروف مغمورة تمثل نهجاً تجريبياً قوياً. ويتمثل هذا النهج في عمل Hájos وآخرون، حيث تسترد شرائح فرس النهر في غرفة احتجاز مبسطة على غرار الواجهة لعدة ساعات قبل نقلها إلى غرفة تسجيل مغمورة معدلة مع معدل تدفق مرتفع من ACSF (~6 مل/دقيقة) لتعزيز إمدادات الأكسجين إلى الأنسجة^12،48،49. وفي ظل هذه الظروف، يمكن الحفاظ على مستويات عالية من نشاط التورين الداخلي والتذبذبات الشبكية التلقائية المستقرة في غرفة تسجيل مغمورة. هذا النهج المعدل يسمح للمحققين لأداء بصريا تسترشد كامل خلية التصحيح التسجيلات المشبك وتوصيف مساهمة أنواع الخلايا التي تم تحديدها شكليا لذبذبات غاما الناجمة عن كارباكول¹². يمكن أن تحدث SWRs أيضا بشكل عفوي في شرائح فرس النهر المغمورة مع معدل تدفق سريع من ACSF^11،48،49. ماير وآخرون أظهرت أن شرائح فرس النهر التي تعافت في غرفة واجهة قبل نقلها إلى غرفة تسجيل مغمورة أظهرت بشكل موثوق SWRs عفوية، في حين أن الشرائح التي تعافت غارقة في beaker قبل نقلها إلى غرفة تسجيل مغمورة أظهرت استجابات ميدانية أصغر، ومستويات أقل من التيارات متشابك عفوية، ونادرا جدا جدا أظهرت SWRs عفوية⁴³. استخدم Schlingloff وآخرون هذه المنهجية المحسنة لإثبات دور خلايا السلة التي تعبر عن البارفالومين في توليد SWRs^{التلقائي 44}.

البروتوكول التالي يقدم طريقة تشريح من خلالها الخلايا العصبية النشطة تلقائيا في شرائح فرس النهر الأفقي يمكن استردادها في ظل ظروف واجهة والاحتفاظ بها في وقت لاحق في غرفة تسجيل مغمورة مناسبة للتلاعب الدوائية أو optogenetic والتسجيلات الموجهة بصريا.