Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Hassina  Z. Bilheux; Maria Cekanova; Jeffrey  M. Warren; Matthew  J. Meagher; Ryan D. Ross; Jean  C. Bilheux; Singanallur Venkatakrishnan; Jiao  Y.Y. Lin; Yuxuan Zhang; Matthew  R. Pearson; Erik Stringfellow

doi:10.3791/61688

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Biology

Radiographie neutronique et tomodensitométrie des systèmes biologiques au réacteur isotopique à haut flux du Laboratoire national d’Oak Ridge

Published: May 07, 2021

doi:

10.3791/61688

Hassina Z. Bilheux*¹, Maria Cekanova*^2,3,4, Jeffrey M. Warren*⁵, Matthew J. Meagher⁶, Ryan D. Ross⁶, Jean C. Bilheux^1,7, Singanallur Venkatakrishnan⁸, Jiao Y.Y. Lin^1,9, Yuxuan Zhang¹, Matthew R. Pearson^9,10, Erik Stringfellow¹

¹Neutron Scattering Division,Oak Ridge National Laboratory, ²College of Veterinary Medicine,The University of Tennessee, ³UT-ORNL Graduate School of Genome, Science and Technology,The University of Tennessee, ⁴Integrity Laboratories, ⁵Environmental Sciences Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁶Department of Cell & Molecular Medicine, Rush Medical College,Rush University, ⁷Computer Science and Mathematics Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁸Electrification and Energy Infrastructures Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁹Now at Second Target Station Project,Oak Ridge National Laboratory, ¹⁰Neutron Technologies Division,Oak Ridge National Laboratory

Summary

Ce manuscrit décrit un protocole de radiographie neutronique et de tomodensitométrie d’échantillons biologiques utilisant une ligne de faisceau CG-1D du réacteur isotopique à haut flux (HFIR) pour mesurer un implant métallique dans un fémur de rat, un poumon de souris et un système racine / sol végétal herbacé.

Abstract

Les neutrons ont historiquement été utilisés pour un large éventail d’applications biologiques utilisant des techniques telles que la diffusion des neutrons aux petits angles, l’écho de spin des neutrons, la diffraction et la diffusion inélastique. Contrairement aux techniques de diffusion neutronique qui obtiennent des informations dans l’espace réciproque, l’imagerie neutronique basée sur l’atténuation mesure un signal dans l’espace réel qui est résolu de l’ordre de dizaines de micromètres. Le principe de l’imagerie neutronique suit la loi de Beer-Lambert et repose sur la mesure de l’atténuation globale des neutrons à travers un échantillon. Une plus grande atténuation est présentée par certains éléments légers (notamment l’hydrogène), qui sont des composants majeurs des échantillons biologiques. Les agents de contraste tels que le deutérium, le gadolinium ou les composés de lithium peuvent être utilisés pour améliorer le contraste de la même manière que dans l’imagerie médicale, y compris des techniques telles que l’imagerie optique, l’imagerie par résonance magnétique, les rayons X et la tomographie par émission de positrons. Pour les systèmes biologiques, la radiographie neutronique et la tomodensitométrie sont de plus en plus utilisées pour étudier la complexité du réseau racinaire souterrain des plantes, son interaction avec les sols et la dynamique du flux d’eau in situ. De plus, des efforts pour comprendre les détails de contraste dans les échantillons d’animaux, tels que les tissus mous et les os, ont été explorés. Ce manuscrit se concentre sur les progrès de la bioimagerie neutronique tels que la préparation des échantillons, l’instrumentation, la stratégie d’acquisition de données et l’analyse des données à l’aide de la ligne de faisceau d’imagerie neutronique CG-1D du réacteur isotopique à haut flux. Les capacités susmentionnées seront illustrées à l’aide d’une sélection d’exemples en physiologie végétale (système herbacé plante/racine/sol) et en applications biomédicales (fémur de rat et poumon de souris).

Introduction

Le principe de la radiographie neutronique (nR) repose sur l’atténuation des neutrons à travers la matière qu’ils traversent. Contrairement aux rayons X qui sont diffusés par le nuage d’électrons d’un atome, les neutrons peuvent être absorbés ou dispersés par son noyau. Les neutrons sont sensibles aux éléments légers, tels que l’hydrogène (H), et peuvent donc être utilisés pour radiographier des applications biologiques telles que les tissus animaux 1,2,3,4,5,6,7 ou humains ^8,9 et les systèmes souterrains du sol / racines 10,11,12,13,14 ^,¹⁵. L’imagerie neutronique est une technique complémentaire à l’imagerie par rayons X, qui est capable de détecter des éléments lourds^16,17,18. Le nR basé sur l’atténuation est régi par les coefficients d’atténuation linéaires des matériaux dans l’échantillon et par l’épaisseur de l’échantillon, comme décrit par la loi de Beer-Lambert, qui stipule que le faisceau transmis est directement proportionnel à la quantité de matériau et à la longueur du trajet à travers le matériau. Ainsi, la transmittance, T, peut être calculée comme suit:

(1)

où I₀ et I sont, respectivement, les intensités incidente et transmise; μ et x sont respectivement le coefficient d’atténuation linéaire et l’épaisseur d’un échantillon homogène. Le coefficient d’atténuation μ est donné par:

(2)

où σ est la section efficace d’atténuation des neutrons de l’échantillon (diffusion et absorption), ρ est sa densité, N_A est le nombre d’Avogadro et M est sa masse molaire.

Le contraste en radiographie d’échantillons biologiques utilisant des neutrons de basse énergie (c.-à-d. des énergies inférieures à 0,5 eV) est principalement dû à un changement de densité de H (pour une épaisseur d’échantillon fixe). Cela est dû à la probabilité d’interaction d’un neutron avec le noyau H, qui est plus grande qu’avec les autres noyaux présents dans les échantillons biologiques, et au fait que la densité de l’atome H est primordiale car c’est l’atome le plus abondant dans les échantillons biologiques.

Depuis ses débuts, la nR et la tomodensitométrie neutronique (nCT) ont été largement utilisées pour les applications de matériaux et d’ingénierie 19,20,21,22,23. Les premières expériences de démonstration de la sensibilité des neutrons au H dans des échantillons biologiques ont commencé au milieu des années 1950²⁴ avec les mesures de spécimens de plantes. Les travaux se poursuivent tout au long des années 1960 avec, par exemple, la radiographie d’un thorax humain²⁵ ou de^rats26, dans laquelle l’utilisation d’agents de contraste, tels que l’oxyde de gadolinium (_Gd2O3), est explorée. De plus, on a émis l’hypothèse que le contraste entre le tissu tumoral humain et le tissu normal était dû à une augmentation locale de la teneur en H. Au cours de ces essais initiaux, il a été conclu qu’une augmentation du flux de neutrons et de la résolution spatiale améliorerait la qualité du nR et augmenterait probablement sa popularité en tant que technique complémentaire pour des applications industrielles ou biomédicales. Les études les plus récentes comprennent des mesures nR et nCT effectuées sur des échantillons de tissus cancéreux¹ et des sections d’organes animaux ^2,3,27 pour des applications biomédicales et médico-légales.

Situé au Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, le High Flux Isotope Reactor (HFIR) est une puissante source de neutrons qui produit des neutrons par réaction de fission. Ces neutrons ont des énergies de l’ordre de 2 MeV et sont « refroidis » dans la piscine du réacteur par des réactions cinétiques avec de l’eau lourde pour atteindre des énergies de l’ordre de 100-300 eV. L’optimisation d’une expérience neutronique, qu’elle soit de diffusion ou d’imagerie, commence par la compréhension de la source de neutrons et des propriétés de la ligne de faisceau telles que l’intensité du faisceau, la distribution de l’énergie et l’effet de fond (neutrons rapides, neutrons retardés, rayons gamma). Dans le hall de guidage froid HFIR où se trouve la ligne de faisceau d’imagerie, les neutrons sont en outre « refroidis » par des interactions cinétiques avec un modérateur H liquide. Ils sont ensuite transportés dans un système de guidage incurvé loin de la ligne de visée de la source, éliminant ainsi les neutrons rapides et la pollution gamma. Comme illustré sur la figure 1, la ligne de faisceau d’imagerie neutronique^{CG-1D 28,29} est placée sur un guide froid, ce qui implique que la gamme d’énergie neutronique varie de quelques meV à quelques dizaines d’eV (dans ce cas, la longueur d’onde de neutrons utilisable correspondante varie de ^0,8 à 10 Å) avec un flux compris entre 10⁷ n/(cm²∙s) à la position de l’échantillon. Un système d’ouverture/diffuseur motorisé définit la géométrie du sténopé de l’instrument d’imagerie. Les neutrons parcourent une distance de 6,59 m dans un tube de vol rempli d’hélium (He) avec des fenêtres en aluminium (Al) à chaque extrémité. Les tubes de vol sont utilisés pour transporter les neutrons tout en limitant la diffusion de l’air de sorte que la perte d’intensité du faisceau soit minimale. Pour les mesures décrites dans ce manuscrit, le diffuseur est constitué d’une nano-poudre d’oxyde d’aluminium (_Al2O3) de 50 nm d’épaisseur de 1 mm enfermée dans un récipient Al. Le diffuseur réduit les artefacts du faisceau provenant du guide neutronique (qui sont agrandis par la géométrie du sténopé d’une ligne de faisceau d’imagerie), sinon de fortes fluctuations d’intensité horizontales et verticales sont visibles dans la radiographie et la normalisation des données devient difficile. Pour les expériences illustrées ici, les neutrons sont convertis en lumière à l’aide d’un phosphore fluorure/sulfure de zinc de lithium-6 de 25 μm d’épaisseur (⁶LiF/ZnS:Ag).

L’optimisation de la collimation dépend de la position de l’échantillon au détecteur, de la résolution spatiale requise et du temps d’acquisition. Lorsque l’échantillon se trouve à quelques cm du scintillateur, des collimations élevées (L/D au-dessus de 800, où L est la distance entre l’ouverture du sténopé de diamètre, D et le détecteur) donnent une meilleure résolution spatiale au détriment du flux de neutrons. Une faible collimation (L/D inférieure à 800) est préférable pour les études dynamiques in situ lorsque la résolution temporelle prévaut sur la résolution spatiale. Pour les mesures décrites dans ce manuscrit, la résolution L/D et spatiale était d’environ 355 et 75 μm, respectivement. La résolution temporelle variait en fonction du rapport signal sur bruit (SNR). L’échantillon a été positionné aussi près du scintillateur que possible pour réduire la distorsion géométrique telle que le flou. Des étapes de translation et de rotation sont disponibles pour placer l’échantillon à proximité des détecteurs et effectuer la tomodensitométrie (TDM). CG-1D propose trois types de détecteurs: un dispositif à couplage de charge (CCD) de 2048 pixels x 2048 pixels avec un pas de pixel de 13,5 μm, un détecteur scientifique complémentaire à semi-conducteur à oxyde métallique (sCMOS) de 2560 pixels x 2160 pixels avec un pas de pixel de 6,5 μm et un détecteur à plaque à microcanaux (MCP)^30,31 avec 512 pixels x 512 pixels avec une taille de pixel de 55μm. Les neutrons dispersés sont absorbés avec du caoutchouc de bore de ~5 mm d’épaisseur pour protéger la puce du détecteur contre les neutrons visibles. Cette absorption génère des rayons gamma qui peuvent être arrêtés par du plomb (Pb) placé entre le caoutchouc de bore et le détecteur. Chaque détecteur est optimisé pour un champ de vision (FOV) différent ainsi que des résolutions spatiales et temporelles. Pour les mesures du fémur de rat et des poumons de souris, le détecteur CCD a été utilisé pour sa grande capacité de champ de vision (~ 7 cm x 7 cm) et sa résolution spatiale raisonnable d’environ 75 μm. La nCT du système racine/sol de la plante a été réalisée avec la sCMOS, car l’objectif était d’acquérir des nCT le plus rapidement possible au détriment du champ de vision (qui était limité à ~ 5 cm x 4,2 cm); Ainsi, la résolution spatiale en a évidemment souffert. Dans ces détecteurs, les neutrons sont convertis en lumière ou en particule alpha à des fins de détection. La rotation de l’échantillon autour de son axe vertical et l’acquisition de radiographies à des angles de rotation consécutifs permettent l’acquisition de nCT. Le modèle rendu volumétrique en 3 dimensions de l’échantillon étudié est obtenu à l’aide de l’ordinateur portable interne iMARS3D basé sur python Jupyter (FBP), pyMBIR ou d’un logiciel commercial, tous décrits ci-dessous.

Enfin, les neutrons qui n’ont pas interagi avec l’échantillon ou le détecteur sont recueillis en position d’arrêt du faisceau à environ 1 m en aval du système de détection afin de minimiser le bruit de fond. La butée de faisceau CG-1D mesure 0,75 m de large, 0,5 m de haut et 35 mm d’épaisseur et est en B₄C en époxy. La butée du faisceau est renforcée avec 10 mm de carbonate de lithium enrichi à 95% (6 Li₂CO₃) dans un époxy résistant au feu où frappe le faisceau de neutrons, avec une cavité doublée de ⁶Li, de plomb (Pb) et d’acier conçue pour contenir le taux élevé de rayons gamma secondaires. La butée de poutre est directement fixée au mur de blindage en acier de la ligne de faisceau. Une photographie de la ligne de faisceau CG-1D est donnée à la figure 2.

Trois logiciels de reconstruction ont été utilisés pour reconstruire les trois données expérimentales en 3D, respectivement. La reconstruction de l’échantillon de poumon de souris a été réalisée à l’aide d’Octopus³², un logiciel de reconstruction commercial qui utilise FBP. Le logiciel Octopus se trouve sur un PC serveur et peut être utilisé pour reconstruire les données recueillies à la ligne de faisceau. Un logiciel de reconstruction, nommé iMARS3D, est disponible chez CG-1D. Il est basé sur le code open source TomoPY³³ avec des fonctionnalités supplémentaires telles que la correction automatisée de l’inclinaison, les filtres de post-traitement, etc. iMARS3D comprend le prétraitement des données (soustraction de l’arrière-plan et du bruit), le recadrage, le filtrage médian (pour corriger les impacts gamma et les pixels morts), la correction automatisée de la fluctuation de l’intensité du faisceau et la correction de l’inclinaison de l’échantillon. Une fois les sinogrammes créés, d’autres traitements de données tels que la suppression des artefacts annulaires et le lissage sont une option. Les différentes étapes de la reconstruction sont enregistrées sur le serveur d’analyse (puis déplacées dans le dossier partagé de la proposition), tandis que les tranches 2D finales sont immédiatement stockées dans le dossier partagé de la proposition. Le fémur du rat a été reconstruit à l’aide d’iMARS3D. L’échantillon de racine/sol de la plante a été prétraité en filtrant les données médianes à l’aide de TomoPY, suivi d’une correction de l’axe d’inclinaison à l’aide de la bibliothèque SciPy de Python. La reconstruction a été réalisée à l’aide d’un paquet python développé en interne appelé pyMBIR (construit à l’aide de noyaux de la boîte à outils ASTRA³⁴) qui implémente une suite d’algorithmes tomographiques du FBP de base aux techniques avancées de reconstruction itérative basées sur des modèles³⁵ qui peuvent obtenir des reconstructions de haute qualité à partir d’ensembles de données sur les neutrons extrêmement clairsemés et bruyants. Tous les volumes rendus basés sur les outils de reconstruction susmentionnés sont représentés en contraste d’atténuation. Toute la visualisation a été réalisée à l’aide du progiciel commercial de visualisation, de segmentation et d’analyse de données AMIRA³⁶.

Ce manuscrit vise à démontrer la procédure d’utilisation de l’imagerie neutronique (nR et nCT) sur la ligne de faisceau HFIR CG-1D. Cette étude illustre également les capacités actuelles de pointe nR et nCT pour les échantillons biologiques, en particulier un poumon de souris, un os de rat et des systèmes racinaires / sol végétaux. Le poumon de souris a été choisi pour illustrer la complémentarité des neutrons pour mesurer le tissu pulmonaire, alors que les rayons X sont surtout sensibles aux os. L’échantillon osseux, un fémur de rat, avait un implant en titane (Ti), illustrant ainsi le contraste entre l’os et le métal, et la possibilité de voir l’interface os/métal (ce qui est difficile à mesurer avec les rayons X car les métaux les atténuent fortement⁴). Enfin, le système d’eau plante-racine illustre la capacité tridimensionnelle (3D) de la nCT à mesurer les systèmes racinaires/sol in situ. Il montre en outre les avantages / inconvénients de l’utilisation de nR pour les échantillons biologiques. De toute évidence, cette méthode peut être utilisée en toute sécurité pour mesurer la dynamique de l’eau dans un système racinaire végétal, mais ne peut pas être considérée comme une technique d’imagerie animale ou humaine vivante en raison des risques associés à l’exposition aux rayonnements, limitant ainsi les études à des souris (mortes) ou à des mesures de type pathologie dans lesquelles, par exemple, un échantillon de tissu est réséqué d’un patient (animal ou humain) et préparé par fixation avant d’être mesuré dans un faisceau de neutrons.

Protocol

1. Configuration de l’instrument (voir Figure 3, section 3) Sur l’ordinateur de ligne de faisceau, ouvrez une fenêtre de terminal, tapez css, puis appuyez sur Entrée pour lancer l’interface utilisateur. Si elle n’est pas ouverte par défaut, choisissez l’option Accueil de l’utilisateur dans l’onglet Menu pour ouvrir l’interface d’imagerie EPICS (Experimental Physics and Industrial Control System). À l’aide du premier onglet (appelé Proposition/Caméra/ Dispositif SE) de l’interface, sélectionnez l’optique de la ligne de faisceau en cliquant sur le bouton Optique à côté de Caméra/Détecteurs, c’est-à-dire la taille de l’ouverture du sténopé et l’ouverture du système de fente en cliquant sur le bouton Fentes . Boulonnez l’étage de rotation sur les étages XY, où l’échantillon doit être placé, et positionnez le détecteur (sCMOS ou CCD).Pour le capteur CCD ou sCMOS, sélectionnez l’objectif avec le grossissement qui fournit la résolution spatiale et la distance focale souhaitées, en consultation avec l’équipe de l’instrument. En utilisant d’abord la lumière, faites la mise au point de la caméra en rapprochant ou en éloignant le détecteur du miroir, ou en réglant manuellement l’objectif à une position fixe du détecteur. Focalisez l’image à l’emplacement du scintillateur à neutrons. Pour le détecteur CCD ou sCMOS, régler finement la mise au point de la lentille avec des neutrons à l’aide d’un masque de résolution absorbant les neutrons37 placé contre le scintillateur du détecteur. Recueillir des radiographies successives en utilisant différents réglages (c.-à-d. différentes positions du détecteur à partir du miroir automatisées en déplaçant le moteur du détecteur dans EPICS). Comparez les radiographies en évaluant les paires de lignes dans ImageJ/Fiji39 ou un outil logiciel d’imagerie similaire. Le cas échéant, fixer l’échantillon dans un récipient approprié (récipient Al et/ou feuille Al résistante), en plaçant l’échantillon sur l’étage de rotation aussi près que possible du détecteur. Protéger le détecteur et l’équipement à l’aide d’un blindage à neutrons (caoutchouc de bore) et gamma (briques Pb). Mesurez la distance entre l’échantillon et le détecteur et retirez l’échantillon. Remplacez-le par le masque de résolution pour évaluer la taille des pixels à la position de l’échantillon dans cette configuration de ligne de faisceau. À l’aide d’une dimension d’entité connue, évaluez le nombre de pixels sur l’entité pour déterminer la taille des pixels. Repositionnez l’échantillon sur l’étage de rotation. À l’aide de l’interface EPICS et de l’onglet Aligner l’échantillon , alignez l’échantillon avec le faisceau de neutrons en prenant des radiographies rapides successives (ms à 1 s) pendant que l’échantillon se déplace jusqu’à ce qu’il soit bien en vue du détecteur. Enregistrez l’exemple de fichier d’alignement en tant que fichier .csv, qui sera réutilisé avant le début de la tomodensitométrie. Avant de commencer la tomodensitométrie, utilisez l’option de vérification automatisée de l’alignement de la tomodensitométrie (dans l’onglet Alignement ) pour vérifier que l’échantillon reste dans le champ de vision à différents angles en évaluant les radiographies au fur et à mesure qu’elles sont générées à différentes orientations de l’échantillon avec le faisceau. 2. Préparation des échantillons et stratégie d’acquisition des données REMARQUE: Les protocoles d’échantillonnage d’animaux ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Tennessee pour le poumon de souris et le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Rush University Medical Center pour le fémur de rat. Fémurs de ratsImplanter des tiges Ti6Al4V (1,5 mm de diamètre et 15 mm de longueur) dans les fémurs de rats Sprague-Dawley mâles, en les plaçant dans l’espace intramédullaire à travers les condyles fémoraux distaux. Sacrifiez les rats après 12 semaines et récoltez les fémurs. Enlevez tous les tissus mous (ce qui contribue à l’atténuation des neutrons) et congelez les fémurs avec des implants dans de la gaze imbibée de solution saline. Immergez complètement les éponges de gaze carrées de 2 pouces dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et enveloppez complètement chaque échantillon dans ces éponges trempées (voir le tableau des matériaux). Décongeler les fémurs à température ambiante pour les microtomodensitogrammes à rayons X38, avant de les transporter à l’état congelé vers le HFIR.Avant la nCT, décongeler l’échantillon et le porter à température ambiante au laboratoire HFIR Biohazard Safety Level 2 (BSL2) situé près de la ligne de faisceau d’imagerie à neutrons CG-1D. Une fois à température ambiante, enveloppez l’échantillon dans une feuille d’aluminium résistante et placez-le dans un cylindre Al. Placez le cylindre verticalement sur l’étage de rotation à la ligne de faisceau et balayez le fémur à la ligne de faisceau à température ambiante de 0 à 360°, avec un angle de pas de 0,25°. Acquérir chaque radiographie pendant 50 s.REMARQUE : Compte tenu du temps mort pour le déplacement de l’étage de rotation et le transfert de chaque radiographie du CCD à l’ordinateur d’acquisition de données, la durée totale du balayage était d’environ 24 h. Une fois que la nCT est terminée et que l’échantillon a été autorisé à être retiré de la ligne de faisceau, rapportez l’échantillon au laboratoire BSL2, retirez le confinement et recongelez l’échantillon pour le préserver en vue d’autres mesures expérimentales. Poumons de sourisRéséquer le tissu pulmonaire d’une souris morte utilisé pour des expériences non liées à cette étude. Fixer l’échantillon dans une solution d’éthanol à 70 % avant les expériences sur les neutrons. Enveloppez le tissu dans une feuille d’aluminium résistante et transportez-le du laboratoire BSL2 directement à la ligne de faisceau CG-1D. Insérer l’échantillon dans un cylindre Al pour le double confinement et pour maintenir la position de l’échantillon dans le faisceau pendant le balayage nCT. Placez l’échantillon près du CCD et effectuez l’analyse pendant la nuit à température ambiante.NOTE: Chaque radiographie était de 150 s et l’angle de rotation était de 0,5°, de 0 à 182°. La durée totale de l’analyse était d’environ 16 h. Système racine/sol des plantes herbacéesREMARQUE : Comme pour d’autres échantillons biologiques, les systèmes plante-sol sont de taille limitée en raison de la forte atténuation de l’hydrogène, en particulier de l’eau dans le sol ou des racines des plantes. Les graines ou les ramets peuvent être plantés dans des récipients (Al ou quartz – les deux ayant une faible section efficace d’atténuation des neutrons), ou une plante plus mature peut être transplantée dans un récipient.Fouillez et transplantez soigneusement une herbe locale qui pousse sur place (ici, l’herbe de mûrier (Fatoua villosa (Thunb .) Nakai) dans un récipient Al de section transversale de 2,38 cm x 2,58 cm, d’une hauteur de 6,3 cm, d’une épaisseur de paroi de 0,055 cm et contenant du sable pur (SiO2). Rincez les racines des plantes avec de l’eau désionisée et affichez-les soigneusement dans le récipient Al tout en remplissant le récipient d’une boue de sable humide.REMARQUE: Lorsque vous remplissez des contenants avec de la terre, il est important d’utiliser de la terre humide, car la terre sèche se séparera selon la taille des particules et créera des artefacts texturaux dans les contenants12,13. Après la plantation, mesurez le poids saturé du système végétal et pesez le système végétal tous les jours pour évaluer le taux d’utilisation de l’eau. Appliquez de l’eau sur la surface supérieure du sol ou à travers un orifice ou un trou au fond du récipient à l’aide d’un tube ou d’une seringue.REMARQUE: Ici, le système de la plante a été placé sur une balance, et de l’eau a été appliquée sur le dessus chaque jour pour remplacer l’utilisation quotidienne d’eau en fonction du poids. L’eau peut être retenue avant l’imagerie pour réduire la teneur en eau du sol et améliorer le contraste dans les racines. Propager le système végétal dans une chambre de croissance sur site à température et lumière contrôlées12. Maintenir le système végétal pendant 1 semaine avant l’imagerie pour permettre l’acclimatation des racines de la plante au contenant Al.REMARQUE: Une fois que l’imagerie commence, n’arrosez pas la plante. Effectuez les scans nCT en ~1,75 h chacun, et scannez en continu sur une période de 2,5 jours pour cartographier les changements 3D dynamiques dans la teneur en eau du sol et des plantes. Pour ces mesures, diminuer la résolution spatiale à quelques centaines de μm au profit de la résolution temporelle (c’est-à-dire un temps d’acquisition plus rapide pour chaque projection).NOTE: Chaque tomodensitométrie a été réalisée avec un angle de rotation de 0,93° et un temps d’acquisition de 10 s par projection. Pour les besoins de ce manuscrit, seule la première tomodensitométrie est présentée. 3. Acquisition des données REMARQUE: Le système d’acquisition de données de CG-1D utilise le logiciel EPICS40. EPICS est développé pour guider le protocole expérimental et minimiser l’erreur humaine; cette interface parcourt logiquement les différentes étapes nécessaires avant de mesurer un échantillon, comme illustré à la figure 3. Le protocole d’acquisition des données EPICS est le suivant (Figure 3). La section de gauche fournit un état de l’expérience en cours, ainsi que les positions motrices et les détails de l’expérience (informations sur l’échantillon, numéro de proposition et membres de l’équipe). Chaque expérience est associée à un numéro de proposition et à un ou plusieurs échantillons. Des informations sur la proposition, telles que les membres de l’équipe et le nom de l’échantillon sélectionné, sont également disponibles sur le côté droit (premier onglet intitulé « Proposition/Caméra/Exemple de dispositif d’environnement »). La section centrale comprenait la radiographie actuelle avec une barre d’échelle à plage dynamique sur le côté, ainsi que des informations d’état et de journal sous l’image. Sélectionnez le premier onglet EPICS intitulé Proposition/Caméra/Dispositif SE. Cliquez sur le bouton Switch Proposal or Sample (Proposition de changement ou échantillon ). Sélectionnez le numéro de projet et l’ID d’échantillon # à mesurer dans la Liste des propositions (à gauche) et l’Exemple (à droite) qui ont remplacé l’onglet précédent. Utilisez la flèche de retour pour revenir à l’interface principale d’EPICS. Sélectionnez le détecteur à utiliser (sCMOS ou CCD) en choisissant l’un des quatre détecteurs disponibles (Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD ou MCP) dans la liste d’options Caméra/Détecteur .NOTE: Le CCD SBIG est utilisé pour les tests par l’instrument et peut être ignoré pour le présent manuscrit. Sélectionnez l’étape de rotation à utiliser dans la section Exemple de périphérique d’environnement .Tout d’abord, cliquez sur Étape de rotation (CT Scan) dans la liste Exemple de périphérique d’environnement . Sélectionnez ensuite l’une des étapes de rotation (qui correspond à l’échantillon à scanner). Enfin, en bas de l’onglet, sélectionnez le mode d’acquisition de données. Dans ce cas, sélectionnez la première option, Faisceau blanc.NOTE: Le mode d’acquisition est soit un faisceau blanc (prenant toute la gamme de longueurs d’onde de neutrons) ou monochromatique à la ligne de faisceau CG-1D. Sélectionnez le deuxième onglet EPICS intitulé Aligner l’échantillon. Tapez un exemple de nom de fichier, puis appuyez sur Entrée. Répétez le processus pour le nom du sous-dossier.REMARQUE: L’interface EPICS est programmée pour enregistrer automatiquement les données dans les répertoires expérimentaux appropriés, que le logiciel de reconstruction interne utilise pour produire des tranches en 2 dimensions (2D) de l’objet 3D étudié. Le deuxième onglet, Aligner l’échantillon, permet l’alignement de l’échantillon à l’aide de radiographies de quelques secondes seulement, car ces radiographies ne sont pas utilisées ultérieurement pour le traitement et l’analyse des données. Une fois que tous les moteurs sont positionnés correctement, leurs positions peuvent être enregistrées dans un format de fichier .csv; ainsi, chaque alignement d’échantillon a son fichier .csv correspondant qui peut être rappelé pour positionner les échantillons pour les tomodensitogrammes à une date ultérieure. Ignorez l’alignement des trois moteurs, c’est-à-dire supposez que l’échantillon est aligné et prêt pour la tomodensitométrie. Sélectionnez un temps d’acquisition souhaité et cliquez sur le bouton Prendre des images rapides . Recueillir une série de radiographies avec différents temps d’acquisition pour évaluer le SNR. Open ImageJ/Fiji; Glissez-déposez les différentes radiographies. Tracer un profil allant de l’échantillon à une zone ouverte; évaluer le SNR. Si plusieurs échantillons sont définis sur l’étape XY (plusieurs étapes de rotation, chacune pour un échantillon), enregistrez chaque position d’échantillon après l’alignement et enregistrez les données en tant que fichier .cvs en cliquant sur le bouton Enregistrer dans un fichier . Sélectionnez le troisième onglet EPICS intitulé Collecter les données pour configurer les paramètres de tomodensitométrie. Tapez un nom de fichier sur la première ligne accessible en écriture, puis appuyez sur Entrée. Répétez l’opération pour le nom du sous-dossier.REMARQUE : La disposition de l’onglet Recueillir des données dépend de la sélection d’une série de radiographies (pas d’ES) ou de tomodensitogrammes (sélection d’un étage de rotation) dans le premier onglet. Dans la section Aligner l’échantillon à l’aide du fichier enregistré, sélectionnez le fichier qui a précédemment enregistré les positions du moteur de l’échantillon (étape 1.8). Utilisez les fichiers récemment enregistrés pour parcourir les exemples de fichiers d’alignement récemment enregistrés. Cliquez sur Aligner à l’aide du fichier pour que l’échantillon revienne en position dans le faisceau de neutrons. Calculez le nombre de projections requises pour le CT en fonction du théorème d’échantillonnage de Nyquist. Calculez le nombre de pixels sur la dimension horizontale de l’échantillon et multipliez par 1,5 pour obtenir le nombre de projections nécessaires pour remplir l’échantillonnage de Nyquist. Entrez l’angle de début de rotation (généralement 0°), l’angle de fin de rotation (généralement 180°), la taille du pas de rotation, le nombre d’images par étape (généralement défini sur 1) et le temps d’exposition pour chaque image. Démarrez la tomodensitométrie en cliquant sur le bouton Collecter des données . 4. Reconstruction des volumes et traitement/analyse des données REMARQUE: Tous les outils logiciels CG-1D pour la normalisation, la reconstruction et l’analyse des données sont disponibles sur le référentiel Python de l’installation ORNL et sur les serveurs d’analyse de l’installation. Pour les mesures 2D, le prétraitement peut être effectué à l’aide de blocs-notes Jupyter Python41. Une illustration d’un ordinateur portable est disponible à la figure 4. On peut charger et prévisualiser leurs données avant de sélectionner une région d’intérêt en dehors de l’échantillon qui est utilisée pour normaliser à 1 (ou 100%) la transmission de toute fluctuation de faisceau. Ces carnets peuvent être adaptés à chaque mesure, ce qui rend le prétraitement un effort simple. De plus, l’analyse 2D peut être effectuée dans le même carnet, par exemple en suivant les changements cinétiques (c’est-à-dire l’absorption d’eau dans un échantillon) dans un échantillon au fil du temps. Connectez-vous au serveur d’analyse Linux à l’aide du nom d’utilisateur et du mot de passe. Ouvrez le navigateur Web et tapez jupyter.sns.gov. Ouvrez le bloc-notes python Jupyter nommé iMARS3D. Exécutez les premières lignes du code (qui charge les outils nécessaires à l’exécution d’iMARS3D). Charger les données, champ plat et sombre. Vérifiez que les trois ensembles de données sont correctement chargés. Procédez au recadrage des données, au filtrage (si nécessaire), à la normalisation (avec correction automatisée de l’inclinaison de l’échantillon) et à la reconstruction volumétrique (un long processus). Enregistrez les données dans le dossier de numéro de projet nommé Partagé. Après avoir activé AMIRA36, qui est également disponible sur les serveurs d’analyse des installations, chargez les tranches reconstruites dans le logiciel et procédez à la visualisation, au filtrage et à l’analyse.

Representative Results

La figure 5A est une photographie d’un fémur de rat représentatif de taille similaire à celui mesuré; La figure 5B,C représente la nCT du fémur d’un rat avec l’implant Ti. La figure 5B montre la nCT basée sur l’atténuation des fausses couleurs du fémur, tandis que la figure 5C représente une coupe diagonale à travers l’os avec la même orientation que dans la figure 5B pour révéler l’implant Ti (en échelle de gris) ressemblant à un scanner médical à rayons X. Cet implant n’interagit pas autant avec les neutrons qu’avec le matériau osseux; Ainsi, son atténuation est minimale et il semble plus foncé (c’est-à-dire moins atténuant) que l’os environnant. L’os trabéculaire, qui est présent dans l’espace médullaire du fémur, est clairement visible à l’extrémité proximale de l’échantillon (flèches rouges à la figure 5B). Les figures 6A,B montrent des photographies représentatives du poumon de souris fixé à l’éthanol, dans deux positions différentes, utilisé pour la nCT afin de démontrer la capacité des neutrons à détecter des échantillons de tissus mous. Le volume reconstruit du poumon de souris obtenu à partir de la nCT est représenté à la figure 6C,D, positionnée de manière similaire à la figure 6A,B. Une coupure à travers le lobe droit du poumon est illustrée à la figure 6E. Malgré la taille relativement petite de l’échantillon, la sensibilité aux neutrons est clairement démontrée par une détection de la structure pulmonaire à ~75 μm de résolution spatiale. Comme prévu, la plage d’atténuation est assez large, une grande partie correspondant à une atténuation des neutrons faible à moyenne, car les poumons ont une structure en forme d’éponge contenant de l’air. La figure 7A montre une photographie de l’échantillon de plante, tandis que la figure 7B représente le rendu volumétrique en fausses couleurs du système racine/sol de la plante dans un récipient rectangulaire Al (qui n’est pas visible car Al est principalement transparent aux neutrons). Par rapport aux ensembles de données précédents, le SNR est plus pauvre, comme prévu, car les données ont été acquises plus rapidement pour suivre les mouvements dynamiques de l’absorption d’eau dans la racine en 3D sur 2,5 jours. Ainsi, chaque tomodensitométrie a été optimisée pour être mesurée dans une fenêtre de ~1,75 h. Malgré un faible rapport signal, le système racinaire dans le sol est clairement visible dans les coupes verticales de l’échantillon illustrées à la figure 7C,D en fausse couleur. Figure 1 : Schéma de la ligne de faisceau d’imagerie à neutrons HFIR CG-1D. Le faisceau d’imagerie est défini par le système d’ouverture qui définit la géométrie d’un faisceau conique. Le faisceau est transporté via un tube de vol rempli de He avec des racleurs de faisceau pour éliminer les neutrons parasites indésirables. Une doublure en caoutchouc boré à l’intérieur du tube de vol diminue le bruit de fond des lignes de faisceau voisines. Abréviations : HFIR = High Flux Isotope Reactor; He = hélium; L = distance de l’ouverture du sténopé de diamètre, D et du détecteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Installation d’imagerie neutronique CG-1D du réacteur isotopique à haut flux. La photographie montre, de droite à gauche, les tubes de vol, la zone d’échantillonnage et l’arrêt du faisceau. Le faisceau de neutrons provient du côté droit de la photographie. Le tube de vol a été signé par les communautés de recherche scientifiques et industrielles qui utilisent l’instrument. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Interface EPICS. L’interface EPICS CG-1D est divisée en trois sections : la section d’état (à gauche), la zone d’affichage (dans cet exemple, une radiographie brute d’un cadran solaire nautique en laiton) et l’entrée de paramètres pour l’imagerie 2D et 3D. Abréviations : EPICS = Experimental Physics and Industrial Control System; 2D = bidimensionnel; 3D = tridimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : capture d’écran d’un bloc-notes Jupyter. Ce carnet est utilisé pour prévisualiser un ensemble de radiographies avant de les normaliser. Dans cet exemple, le même cadran solaire nautique en laiton illustré à la figure 3 est visualisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Fémur de rat avec implant en titane. (A) Photographie d’un fémur de rat représentatif. (B) Volume rendu 3D du fémur de rat obtenu à partir de nCT. (C) Tranche diagonale montrant la tige de titane à l’intérieur du fémur. Les flèches rouges montrent l’os trabéculaire. Les barres d’échelle sont présentées par les axes x et y, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : NCT pulmonaire de souris. (A) et (B) Photographies représentatives du poumon de souris. (C) et (D) Volume rendu 3D de souris basé sur l’atténuation en utilisant le même positionnement que (A) et (B). (E) Tranche représentative à travers le lobe droit du poumon de souris (D) montrant une structure pulmonaire obtenue avec un gradient différent d’atténuation des neutrons (généralement une faible atténuation). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Tomodensitométrie par neutrons et tranches à travers le système racine/sol de la plante. (A) Photographie de l’échantillon de plantes. (B) Volume rendu en 3D à partir de la tomodensitométrie à neutrons de la plante montrant la tige au-dessus du sol et le système du sol avec de l’eau (en rouge). (C) et (D) sont coupés à travers l’échantillon inclinés pour montrer la tige et les racines dans le sol (flèches rouges). Des zones bleues plus foncées dans le sol indiquent la présence d’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La radiographie neutronique et la tomodensitométrie d’échantillons biologiques sont des techniques d’imagerie prometteuses qui sont complémentaires à l’imagerie par rayons X ou à l’imagerie par résonance magnétique. Les étapes critiques de la réalisation d’une expérience d’imagerie neutronique d’un échantillon biologique sont liées à sa préparation et à son confinement à la ligne de faisceau. L’optimisation d’une expérience est motivée par la question scientifique à laquelle il faut répondre. Si la question scientifique nécessite une résolution spatiale élevée pour observer un phénomène, alors de longs temps d’acquisition sont nécessaires, et l’inconvénient de nCT (avec un champ de vision de taille cm) est qu’il faut des heures pour effectuer un balayage. Cela est principalement dû à la différence de flux global de neutrons disponible dans un réacteur par rapport à une source synchrotron, où les tomodensitogrammes aux rayons X peuvent prendre de quelques secondes à quelques minutes pour un champ de vision de quelques mm² . Bien que la méthode puisse être appliquée à des échantillons de tissus ex vivo extraits d’animaux, elle ne peut pas être étendue in vivo à des animaux vivants ou à des humains en raison du risque d’exposition aux rayonnements (tels que les rayons gamma produits par les neutrons et les interactions neutroniques avec les atomes de l’échantillon). Cependant, il est bien adapté à l’imagerie des interactions plantes/racines du sol (Figure 7) telles que la dynamique d’absorption d’eau.

L’avantage de l’utilisation de la nCT rapide pour la dynamique de la plante est la sensibilité au H dans l’eau et l’absence de dommages causés par les radiations à la plante, contrairement à la tomodensitométrie aux rayons X. De plus, un contraste unique peut être observé à partir de l’utilisation de neutrons dans des échantillons d’os / métaux tels qu’un fémur de rat où le métal est relativement transparent par rapport aux tissus environnants (Figure 5), évitant potentiellement les artefacts métalliques induits par la radiographie CT³⁹. Les tissus animaux, tels que les poumons de souris (Figure 6), montrent une détection impressionnante de la structure des tissus mous parce que les neutrons sont sensibles à H, mais la résolution spatiale est en quelque sorte le facteur limitant dans ces mesures. Le contraste est fourni par les atomes H présents dans les échantillons biologiques^19,39.

Avec les progrès de nouvelles techniques telles que l’interférométrie à réseau de neutrons et l’amélioration de la résolution spatiale (quelques microns ont récemment été rapportés^42,43), l’imagerie neutronique peut offrir de nouveaux mécanismes de contraste pour les tissus biologiques avec une résolution spatiale améliorée. L’exploration de neutrons de plus haute énergie (pour permettre la mesure d’échantillons épais) promet également la possibilité de mesurer de plus grandes sections d’un tissu animal comme une souris intacte, offrant ainsi de nouvelles possibilités pour la recherche biomédicale.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Une partie de cette recherche a utilisé les ressources du réacteur isotopique à haut flux, exploité par l’ORNL et parrainé par le département américain de l’Énergie, Office of Science, User Facilities, sous contrat DE-AC05-00OR22725 avec UT-Battelle, LLC. Une partie de cette recherche a été soutenue par l’ORNL dans le cadre du programme Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship. Cette recherche a également été parrainée par le DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. Des échantillons fémoraux de rats ont été obtenus à partir d’expériences réalisées en collaboration avec le Dr Rick Sumner au Rush University Medical Center avec un financement obtenu du NIH (R01AR066562) et du prix Smith and Nephew de l’Orthopedic Research and Education Foundation. L’équipe tient à remercier les équipes de soutien HFIR qui permettent l’utilisation des lignes de faisceau de diffusion de neutrons.

Materials

Aluminum containers	custom		Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample
Aluminum foil	Fisher	01-213-100	Mouse lung sample containment
Deionized water or deuterium oxide			Water or D₂O can be used to enhance contrast, plant sample
Ethanol	Fisher	04-355-223	Mouse lung sample
Gauze sponges	CardinalHealth		Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample
Growth chamber	Conviron	A1000	Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample
Laboratory balance			Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample
Pure silica sand	US Silica Co.	Flint#13	Pure SiO₂ provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample
Sprague-Dawley Rats	Harlan	Order Code: 002-US	Rat femur sample
Titanium Rod	Goodfellow	TI007905	Rat femur sample

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Bilheux, H. Z., Cekanova, M., Warren, J. M., Meagher, M. J., Ross, R. D., Bilheux, J. C., Venkatakrishnan, S., Lin, J. Y., Zhang, Y., Pearson, M. R., Stringfellow, E. Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory’s High Flux Isotope Reactor. J. Vis. Exp. (171), e61688, doi:10.3791/61688 (2021).

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