Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Hassina  Z. Bilheux; Maria Cekanova; Jeffrey  M. Warren; Matthew  J. Meagher; Ryan D. Ross; Jean  C. Bilheux; Singanallur Venkatakrishnan; Jiao  Y.Y. Lin; Yuxuan Zhang; Matthew  R. Pearson; Erik Stringfellow

doi:10.3791/61688

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Biology

Radiografia de Nêutrons e Tomografia Computadorizada de Sistemas Biológicos no Reator de Isótopos de Alto Fluxo do Oak Ridge National Laboratory

Published: May 07, 2021

doi:

10.3791/61688

Hassina Z. Bilheux*¹, Maria Cekanova*^2,3,4, Jeffrey M. Warren*⁵, Matthew J. Meagher⁶, Ryan D. Ross⁶, Jean C. Bilheux^1,7, Singanallur Venkatakrishnan⁸, Jiao Y.Y. Lin^1,9, Yuxuan Zhang¹, Matthew R. Pearson^9,10, Erik Stringfellow¹

¹Neutron Scattering Division,Oak Ridge National Laboratory, ²College of Veterinary Medicine,The University of Tennessee, ³UT-ORNL Graduate School of Genome, Science and Technology,The University of Tennessee, ⁴Integrity Laboratories, ⁵Environmental Sciences Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁶Department of Cell & Molecular Medicine, Rush Medical College,Rush University, ⁷Computer Science and Mathematics Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁸Electrification and Energy Infrastructures Division,Oak Ridge National Laboratory, ⁹Now at Second Target Station Project,Oak Ridge National Laboratory, ¹⁰Neutron Technologies Division,Oak Ridge National Laboratory

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para radiografia de nêutrons e tomografia computadorizada de amostras biológicas usando uma linha de luz CG-1D do High Flux Isotope Reactor (HFIR) para medir um implante metálico em um fêmur de rato, um pulmão de camundongo e um sistema raiz/solo de planta herbácea.

Abstract

Os nêutrons têm sido historicamente usados para uma ampla gama de aplicações biológicas empregando técnicas como espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, eco de spin de nêutrons, difração e espalhamento inelástico. Ao contrário das técnicas de espalhamento de nêutrons que obtêm informações no espaço recíproco, a imagem de nêutrons baseada em atenuação mede um sinal no espaço real que é resolvido na ordem de dezenas de micrômetros. O princípio da imagem por nêutrons segue a lei de Beer-Lambert e é baseado na medição da atenuação de nêutrons em massa através de uma amostra. Maior atenuação é exibida por alguns elementos leves (mais notavelmente, hidrogênio), que são os principais componentes de amostras biológicas. Agentes de contraste como deutério, gadolínio ou compostos de lítio podem ser usados para aumentar o contraste de maneira semelhante à que é feita em imagens médicas, incluindo técnicas como imagens ópticas, ressonância magnética, raios-X e tomografia por emissão de pósitrons. Para sistemas biológicos, a radiografia de nêutrons e a tomografia computadorizada têm sido cada vez mais utilizadas para investigar a complexidade da rede radicular subterrânea de plantas, sua interação com os solos e a dinâmica do fluxo de água in situ. Além disso, esforços para entender detalhes de contraste em amostras animais, como tecidos moles e ossos, têm sido explorados. Este manuscrito se concentra nos avanços em bioimagem de nêutrons, como preparação de amostras, instrumentação, estratégia de aquisição de dados e análise de dados usando a linha de luz CG-1D de imagem de nêutrons do High Flux Isotope Reactor. As capacidades acima mencionadas serão ilustradas usando uma seleção de exemplos em fisiologia vegetal (planta herbácea/raiz/sistema solo) e aplicações biomédicas (fêmur de rato e pulmão de camundongo).

Introduction

O princípio da radiografia de nêutrons (nR) baseia-se na atenuação dos nêutrons através da matéria que atravessam. Ao contrário dos raios X que são espalhados pela nuvem de elétrons de um átomo, os nêutrons podem ser absorvidos ou espalhados por seu núcleo. Os nêutrons são sensíveis a elementos leves, como o hidrogênio (H), e podem, consequentemente, ser utilizados para aplicações biológicas radiográficas, como tecidos animais 1,2,3,4,5,6,7 ou humanos ^8,9 e sistemas solo/radiculares abaixo do solo 10,11,12,13,14 ^,¹⁵. A imagem por nêutrons é uma técnica complementar à imagem radiográfica, capaz de detectar elementos pesados^16,17,18. O nR baseado em atenuação é governado pelos coeficientes de atenuação linear dos materiais dentro da amostra e pela espessura da amostra, conforme descrito pela lei de Beer-Lambert, que afirma que o feixe transmitido é diretamente proporcional à quantidade de material e ao comprimento do caminho através do material. Assim, a transmitância, T, pode ser calculada como:

(1)

onde I ₀ e I são, respectivamente, as intensidades incidente e transmissão do feixe; μ e x são o coeficiente de atenuação linear e a espessura de uma amostra homogênea, respectivamente. O coeficiente de atenuação μ é dado por:

(2)

onde σ é a seção transversal de atenuação de nêutrons da amostra (espalhamento e absorção), ρ é sua densidade, N_A é o número de Avogadro e M é sua massa molar.

O contraste na radiografia de amostras biológicas usando nêutrons de baixa energia (ou seja, energias abaixo de 0,5 eV) é principalmente devido a uma mudança na densidade de H (para uma espessura de amostra fixa). Isso se deve à probabilidade de interação de um nêutron com o núcleo H, que é maior do que com outros núcleos presentes em amostras biológicas, e ao fato de que a densidade do átomo H é primordial, pois é o átomo mais abundante em amostras biológicas.

Desde seus primórdios, a nR e a tomografia computadorizada por nêutrons (nCT) têm sido extensivamente utilizadas para aplicações em materiais e engenharia19,20,21,22,23. Os primeiros experimentos de demonstração da sensibilidade de nêutrons ao H em amostras biológicas começaram em meados da década de 1950²⁴ com as medidas de espécimes de plantas. O trabalho continuou até a década de 1960 com, por exemplo, a radiografia de tórax humano25 ou de^ratos26, na qual foi explorado o uso de agentes de contraste, como o óxido de gadolínio (Gd₂O₃). Além disso, hipotetizou-se que o contraste no tecido tumoral humano versus tecido normal era devido a um aumento local no conteúdo de H. Durante esses ensaios iniciais, concluiu-se que o aumento do fluxo de nêutrons e da resolução espacial melhoraria a qualidade da nR e provavelmente aumentaria sua popularidade como uma técnica complementar para aplicações industriais ou biomédicas. Os estudos mais recentes compreendem medidas de nR e nCT realizadas em espécimes de tecido cancerígeno¹ e cortes de órgãos de animais ^2,3,27 para aplicações biomédicas e forenses.

Localizado no Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, o High Flux Isotope Reactor (HFIR) é uma poderosa fonte de nêutrons que produz nêutrons por reação de fissão. Esses nêutrons têm energias da ordem de 2 MeV e são “resfriados” na piscina do reator por reações cinéticas com água pesada para atingir energias da ordem de 100-300 eV. A otimização de um experimento de nêutrons, seja espalhamento ou imagem, começa com a compreensão da fonte de nêutrons e das propriedades da linha de luz, como sua intensidade de feixe, distribuição de energia e o efeito de fundo (nêutrons rápidos, nêutrons atrasados, raios gama). No hall de guia frio HFIR, onde a linha de luz de imagem está localizada, os nêutrons são ainda mais “resfriados” por interações cinéticas com um moderador H líquido. Eles são então transportados em um sistema de guia curvo para longe da linha de visão da fonte, eliminando assim nêutrons rápidos e poluição gama. Como ilustrado na Figura 1, a linha de luz CG-1D para imagem de nêutrons^28,29 é colocada em uma guia fria, implicando que a faixa de energia de nêutrons varia de alguns meV a algumas dezenas de eV (neste caso, o comprimento de onda de nêutrons utilizável correspondente varia de ^0,8 a 10 Å) com um fluxo na faixa de 10^{a 7} n/(cm²∙s) na posição da amostra. Um sistema motorizado de abertura/difusor define a geometria pinhole do instrumento de imagem. Os nêutrons percorrem uma distância de 6,59 m em um tubo de voo cheio de hélio (He) com janelas de alumínio (Al) em cada extremidade. Os tubos de voo são usados para transportar nêutrons, limitando a dispersão do ar de tal forma que a perda na intensidade do feixe seja mínima. Para as medidas descritas neste manuscrito, o difusor é feito de um nanopó de óxido de alumínio (Al₂O₃) de 1 mm de espessura e 50 nm, envolto em um recipiente de Al. O difusor reduz os artefatos do feixe provenientes da guia de nêutrons (que são ampliados pela geometria pinhole de uma linha de luz de imagem), caso contrário, flutuações horizontais e verticais acentuadas de intensidade são visíveis na radiografia e a normalização dos dados torna-se um desafio. Para os experimentos ilustrados aqui, nêutrons são convertidos em luz usando um fluoreto de lítio-6 de 25 μm de espessura/fósforo de sulfeto de zinco (⁶LiF/ZnS:Ag).

A otimização da colimação depende da posição da amostra para o detector, da resolução espacial necessária e do tempo de aquisição. Quando a amostra fica a poucos cm de distância do cintilador, altas colimações (L/D acima de 800, onde L é a distância da abertura do orifício de diâmetro, D, e do detector) produzem melhor resolução espacial ao custo do fluxo de nêutrons. Baixa colimação (L/D abaixo de 800) é preferível para estudos dinâmicos in situ quando a resolução temporal prevalece sobre a espacial. Para as medidas descritas neste manuscrito, L/D e resolução espacial foram de aproximadamente 355 e 75 μm, respectivamente. A resolução temporal variou de acordo com a relação sinal-ruído (SNR). A amostra foi posicionada o mais próximo possível do cintilador para reduzir a distorção geométrica, como borramento. Estágios de translação e rotação estão disponíveis para fixar a amostra próxima aos detectores e realizar tomografia computadorizada (TC). CG-1D oferece três tipos de detectores: um dispositivo acoplado à carga (CCD) com 2048 pixels x 2048 pixels com um passo de pixel de 13,5 μm, um detector científico complementar de semicondutor de óxido de metal (sCMOS) com 2560 pixels x 2160 pixels com um passo de pixel de 6,5μm, e um detector de placa de microcanal (MCP)^30,31 com 512 pixels x 512 pixels com um tamanho de pixel de 55μm. Nêutrons espalhados são absorvidos com borracha de boro de ~5 mm de espessura para proteger o chip do detector de ver nêutrons. Essa absorção gera raios gama que podem ser interrompidos pelo chumbo (Pb) colocado entre a borracha de boro e o detector. Cada detector é otimizado para um campo de visão diferente (FOV), bem como resoluções espaciais e temporais. Para as medidas de fêmur de rato e pulmão de camundongo, o detector CCD foi utilizado por sua grande capacidade de FOV (~ 7 cm x 7 cm) e resolução espacial razoável de aproximadamente 75μm. O nCT da raiz/sistema solo da planta foi realizado com o sCMOS, pois o objetivo era adquirir nCTs o mais rápido possível ao custo de FOV (que foi limitado a ~ 5 cm x 4,2 cm); assim, a resolução espacial evidentemente sofreu. Nesses detectores, os nêutrons são convertidos em luz ou em uma partícula alfa para fins de detecção. A rotação da amostra em torno de seu eixo vertical e a aquisição de radiografias em ângulos de rotação consecutivos permitem a aquisição de nCT. O modelo renderizado volumétrico tridimensional da amostra sob investigação é obtido utilizando-se o notebook interno Jupyter baseado em píton iMARS3D baseado em píton (FBP), pyMBIR ou um software comercial, todos descritos abaixo.

Finalmente, os nêutrons que não interagiram com a amostra ou com o detector são coletados em uma posição de parada do feixe aproximadamente 1 m a jusante do sistema detector para minimizar o ruído de fundo. O batente do feixe CG-1D tem 0,75 m de largura, 0,5 m de altura e 35 mm de espessura e é feito de B₄C em epóxi. O batente do feixe é reforçado com 10 mm de carbonato de lítio enriquecido a 95% (6 Li₂CO₃) em um epóxi resistente ao fogo onde o feixe de nêutrons atinge, com uma cavidade revestida com ⁶Li, chumbo (Pb) e aço projetado para conter a alta taxa de raios gama secundários. O batente da viga é diretamente ligado à parede de blindagem de aço da linha de luz. Uma fotografia da linha de luz CG-1D é apresentada na Figura 2.

Três softwares de reconstrução foram utilizados para reconstruir os três dados experimentais em 3D, respectivamente. A reconstrução da amostra de pulmão de camundongo foi realizada com o Octopus³², um software de reconstrução comercial que utiliza FBP. O software Octopus fica em um PC servidor e pode ser usado para reconstruir dados coletados na linha de luz. Um software de reconstrução, chamado iMARS3D, está disponível na CG-1D. Ele é baseado no código fonte aberto TomoPY³³ com recursos adicionais, como correção de inclinação automatizada, filtros de pós-processamento, etc. O iMARS3D inclui pré-processamento dos dados (subtração do fundo e ruído), corte, filtragem mediana (para corrigir golpes gama e pixels mortos), correção automatizada da flutuação da intensidade do feixe e correção da inclinação da amostra. Uma vez que os sinogramas são criados, o processamento de dados adicionais, como a remoção de artefatos de anel e suavização são uma opção. As diferentes etapas da reconstrução são salvas no servidor de análise (e posteriormente movidas na pasta compartilhada da proposta), enquanto as fatias 2D finais são imediatamente armazenadas na pasta compartilhada da proposta. O fêmur de ratos foi reconstruído com iMARS3D. A amostra de raiz/solo da planta foi pré-processada por mediana filtrando os dados usando TomoPY seguido de correção do eixo de inclinação usando a biblioteca SciPy de Python. A reconstrução foi realizada usando um pacote python desenvolvido internamente denominado pyMBIR (construído usando kernels da caixa de ferramentas ASTRA³⁴) que implementa um conjunto de algoritmos tomográficos desde a linha de base FBP até técnicas avançadas de reconstrução iterativa baseadas em modelos³⁵ que podem obter reconstruções de alta qualidade a partir de conjuntos de dados de nêutrons extremamente esparsos e barulhentos. Todos os volumes renderizados com base nas ferramentas de reconstrução acima mencionadas são representados em contraste de atenuação. Toda a visualização foi realizada utilizando-se o software de visualização comercial, segmentação e análise de dados AMIRA³⁶.

Este manuscrito tem como objetivo demonstrar o procedimento de utilização de imagens de nêutrons (nR e nCT) na linha de luz HFIR CG-1D. Este estudo também ilustra as capacidades atuais de nR e nCT de última geração para amostras biológicas, especificamente um pulmão de camundongo, um osso de rato e sistemas de raiz/solo de plantas. O pulmão de camundongo foi escolhido para ilustrar a complementaridade de nêutrons para medir o tecido pulmonar, enquanto os raios X são mais sensíveis aos ossos. A amostra óssea, um fêmur de rato, tinha um implante de titânio (Ti), ilustrando o contraste entre o osso e o metal, e a oportunidade de ver a interface osso/metal (que é difícil de medir com radiografias, pois os metais os atenuam fortemente⁴). Finalmente, o sistema de água planta-raiz ilustra a capacidade tridimensional (3D) do nCT para medir sistemas raiz/solo in situ. Além disso, mostra as vantagens/desvantagens do uso de nR para amostras biológicas. Evidentemente, este método pode ser usado com segurança para medir a dinâmica da água em um sistema planta-raiz, mas não pode ser considerado como uma técnica de imagem animal vivo ou humano devido aos riscos associados à exposição à radiação, limitando os estudos a camundongos (mortos) ou medições semelhantes a patologias em que, por exemplo, uma amostra de tecido é ressecada de um paciente (animal ou humano) e preparada por fixação antes de ser medida em um feixe de nêutrons.

Protocol

1. Configuração do instrumento (ver Figura 3, secção 3) No computador da linha de luz, abra uma janela de terminal, digite css e pressione Enter para iniciar a interface do usuário. Se não for aberto por padrão, escolha a opção Página inicial do usuário na guia Menu para abrir a interface de imagem do Experimental Physics and Industrial Control System (EPICS). Usando a primeira aba (chamada Proposta/Câmera/ Dispositivo SE) da interface, selecione a óptica da linha de luz clicando no botão Óptica ao lado de Câmera/Detectores, ou seja, o tamanho da abertura do orifício e a abertura do sistema de fenda clicando no botão Fendas . Parafusar o estágio de rotação nos estágios XY, onde a amostra deve ser colocada, e posicionar o detector (sCMOS ou CCD).Para o CCD ou o detector sCMOS, selecione a lente com a ampliação que fornece a resolução espacial e a distância focal desejadas, em consulta com a equipe de instrumentos. Usando a luz primeiro, foque a câmera movendo o detector para mais perto ou mais longe do espelho, ou ajustando manualmente a lente em uma posição fixa do detector. Focalize a imagem no local do cintilador de nêutrons. Para o CCD ou o detector sCMOS, ajuste o foco da lente com nêutrons usando uma máscara de resolução absorvedora de nêutrons37 colocada contra o cintilador do detector. Colete radiografias sucessivas usando diferentes configurações (ou seja, diferentes posições do detector do espelho automatizado movendo o motor do detector em EPICS). Compare radiografias avaliando pares de linhas no ImageJ/Fiji39 ou em uma ferramenta de software de imagem semelhante. Se for caso disso, fixar a amostra num recipiente adequado (recipiente Al e/ou folha de serviço pesado Al), colocando a amostra no estádio de rotação o mais próximo possível do detector. Blinde o detector e o equipamento usando blindagem de nêutrons (borracha de boro) e gama (tijolos de Pb). Meça a distância amostra-detector e remova a amostra. Substitua-o pela máscara de resolução para avaliar o tamanho do pixel na posição da amostra nesta configuração de linha de luz. Usando uma dimensão de recurso conhecida, avalie o número de pixels no recurso para determinar o tamanho do pixel. Reposicione a amostra no estágio de rotação. Usando a interface EPICS e a guia Alinhar amostra, alinhe a amostra com o feixe de nêutrons fazendo radiografias rápidas sucessivas (ms a 1 s) enquanto a amostra está se movendo até que esteja em plena visão do detector. Salve o arquivo de alinhamento de exemplo como um arquivo .csv, que será reutilizado antes do início da verificação de TC. Antes de iniciar a tomografia computadorizada, use a opção automatizada CT Alignment Check (na guia Alinhamento ) para verificar se a amostra permanece no campo de visão em diferentes ângulos, avaliando as radiografias à medida que são geradas em diferentes orientações de amostra com o feixe. 2. Preparação de espécimes e estratégia de aquisição de dados NOTA: Os protocolos de amostra animal foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Tennessee para o pulmão de camundongos e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Rush para o fêmur de ratos. Fêmures de ratoImplante Ti6Al4V bastões (1,5 mm de diâmetro e 15 mm de comprimento) nos fêmures de ratos machos da raça Sprague-Dawley, colocando-os no espaço intramedular através dos côndilos femorais distais. Sacrificar os ratos após 12 semanas e colher os fêmures. Remova todo o tecido mole (que contribui para a atenuação dos nêutrons) e congele os fêmures com implantes em gaze embebida em soro fisiológico. Submerja totalmente as esponjas de gaze quadradas de 2 polegadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e envolva cada amostra totalmente nessas esponjas embebidas (consulte a Tabela de Materiais). Descongelar os fêmures à temperatura ambiente para microtomografia computadorizada baseada em raios X38, antes de transportá-los em estado congelado para o HFIR.Antes da nCT, redescongele a amostra e leve-a à temperatura ambiente no laboratório HFIR Biohazard Safety Level 2 (BSL2) localizado perto da linha de luz CG-1D de imagem de nêutrons. Uma vez à temperatura ambiente, envolva a amostra em papel alumínio de Al resistente e coloque-a num cilindro de Al. Posicione o cilindro verticalmente no estágio de rotação na linha de luz e digitalize o fêmur na linha de luz à temperatura ambiente de 0 a 360°, com um ângulo de passo de 0,25°. Adquira cada radiografia por 50 s.OBS: Considerando o tempo morto para o movimento do estágio de rotação e transferência de cada radiografia do CCD para o computador de aquisição de dados, o tempo total do exame foi de aproximadamente 24 h. Uma vez que o nCT esteja concluído e a amostra tenha sido autorizada a ser removida da linha de luz, traga a amostra de volta ao laboratório BSL2, remova a contenção e recongele a amostra para preservá-la para medições experimentais adicionais. Pulmões de camundongosRessecção de tecido pulmonar de um camundongo morto usado para experimentos não relacionados a este estudo. Fixar a amostra numa solução de etanol a 70% antes das experiências com neutrões. Embrulhe o tecido em folha de Al resistente e transporte-o do laboratório BSL2 diretamente para a linha de luz CG-1D. Inserir a amostra num cilindro de Al para dupla contenção e para manter a posição da amostra no feixe durante a nCT. Posicione a amostra perto do CCD e realize a varredura durante a noite à temperatura ambiente.OBS: Cada radiografia foi de 150 s, e o ângulo de rotação foi de 0,5°, de 0 a 182°. O tempo total para a varredura foi em torno de 16 h. Raiz de planta herbácea/sistema do soloNOTA: Tal como acontece com outras amostras biológicas, os sistemas planta-solo são limitados em tamanho devido à forte atenuação do hidrogénio, particularmente água no solo ou raízes das plantas. Sementes ou rametes podem ser plantados em recipientes (Al ou quartzo – ambos com seções transversais de baixa atenuação de nêutrons), ou uma planta mais madura pode ser transplantada para um recipiente.Escavar cuidadosamente e transplantar uma erva local que cresce no local (aqui, erva daninha amoreira (Fatoua villosa (Thunb.) Nakai) em um recipiente Al de seção transversal de 2,38 cm x 2,58 cm, altura de 6,3 cm, espessura de parede de 0,055 cm e contendo areia pura (SiO2). Lave as raízes das plantas com água deionizada e exiba-as cuidadosamente dentro do recipiente de Al enquanto enche o recipiente com uma pasta de areia molhada.OBS: Ao encher recipientes com terra, é importante utilizar solo úmido, pois o solo seco se separará por tamanho de partícula e criará artefatos texturais nos recipientes12,13. Após o plantio, meça o peso saturado do sistema da planta e pese o sistema da planta todos os dias para avaliar a taxa de uso de água. Aplique água na superfície superior do solo ou através de uma porta ou orifício no fundo do recipiente usando um tubo ou seringa.OBS: Aqui, o sistema da planta foi colocado em uma balança, e água foi aplicada no topo a cada dia para substituir o uso diário de água com base no peso. A água pode ser retida antes da aquisição de imagens para reduzir o conteúdo de água no solo e aumentar o contraste nas raízes. Propagar o sistema vegetal em câmara de crescimento no local com temperatura e luzcontroladas 12. Manter o sistema da planta por 1 semana antes da obtenção de imagens para permitir a aclimatação da raiz da planta ao recipiente de Al.NOTA: Assim que a imagem começar, não regue a planta. Execute as varreduras nCT em ~1,75 h cada, e digitalize continuamente durante um período de 2,5 dias para mapear mudanças dinâmicas em 3D no solo e no conteúdo de água da planta. Para essas medidas, diminua a resolução espacial para algumas centenas de μm em favor da resolução temporal (ou seja, tempo de aquisição mais rápido para cada projeção).OBS: Cada exame foi realizado com ângulo de rotação de 0,93° e tempo de aquisição de 10 s por projeção. Para fins deste manuscrito, apenas a primeira tomografia computadorizada é apresentada. 3. Aquisição de dados OBS: O sistema de aquisição de dados da CG-1D utiliza o software EPICS40. O EPICS é desenvolvido para orientar o protocolo experimental e minimizar o erro humano; essa interface percorre logicamente as diferentes etapas necessárias antes da medição de uma amostra, conforme ilustrado na Figura 3. O protocolo de aquisição de dados do EPICS é o seguinte (Figura 3). A seção à esquerda fornece um status do experimento em andamento, juntamente com posições motoras e detalhes do experimento (informações da amostra, número da proposta e membros da equipe). Cada experimento é associado a um número de proposta e uma ou várias amostras. As informações da proposta, como membros da equipe e nome da amostra selecionada, também estão disponíveis no lado direito (primeira guia chamada “Proposta/Câmera/Dispositivo de Ambiente de Amostra”). A seção central compreendeu a radiografia atual com uma barra de escala de faixa dinâmica na lateral, juntamente com informações de status e log abaixo da imagem. Selecione a primeira guia EPICS intitulada Proposta/Câmera/Dispositivo SE. Clique no botão Mudar de proposta ou Exemplo . Selecione o número do projeto e o ID de amostra a serem medidos na Lista de Propostas (esquerda) e Amostra (direita) que substituíram a guia anterior. Use a seta para trás para voltar à interface principal do EPICS. Selecione o detector a ser usado (sCMOS ou CCD) escolhendo um dos quatro detectores disponíveis (Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD ou MCP) na lista de opções Câmera/Detector .NOTA: O SBIG CCD é utilizado para testes pelo instrumento e pode ser ignorado para o presente manuscrito. Selecione o estágio de rotação a ser usado na seção Dispositivo de Ambiente de Amostra .Primeiro, clique em Estágio de Rotação (CT Scan) na lista Sample Environment Device . Em seguida, selecione um dos estágios de rotação (que corresponde à amostra a ser digitalizada). Finalmente, na parte inferior da guia, selecione o Modo de Aquisição de Dados. Nesse caso, selecione a primeira opção, White Beam.NOTA: O modo de aquisição é de feixe branco (considerando toda a faixa de comprimento de onda de nêutrons) ou monocromático na linha de luz CG-1D. Selecione a segunda guia EPICS intitulada Alinhar amostra. Digite um nome de arquivo de exemplo e pressione Enter. Repita o processo para o nome da subpasta.NOTA: A interface EPICS é programada para salvar automaticamente os dados nos diretórios experimentais adequados, que o software de reconstrução interno usa para produzir fatias 2-dimensionais (2D) do objeto 3D sob investigação. A segunda aba, Align Sample, permite o alinhamento da amostra usando radiografias que são de poucos segundos, pois essas radiografias não são usadas posteriormente para processamento e análise de dados. Uma vez que todos os motores estão posicionados corretamente, suas posições podem ser salvas em um formato de arquivo .csv; assim, cada alinhamento de amostra tem seu arquivo de .csv correspondente que pode ser chamado de volta para posicionar as amostras para exames de TC em um momento posterior. Pule o alinhamento dos três motores, ou seja, assuma que a amostra está alinhada e pronta para a TC. Selecione o tempo de aquisição desejado e clique no botão Tirar Imagens Rápidas . Coletar uma série de radiografias com diferentes tempos de aquisição para avaliar a SNR. Abra o ImageJ/Fiji; Arraste e solte as diferentes radiografias. Traçar um perfil que vai da amostra para uma área aberta; avaliar a relação S/R. Se várias amostras forem definidas no estágio XY (vários estágios de rotação, cada um para uma amostra), registre cada posição de amostra após o alinhamento e salve os dados como arquivo .cvs clicando no botão Salvar em um arquivo . Selecione a terceira guia EPICS intitulada Coletar dados para configurar os parâmetros de tomografia computadorizada. Digite um nome de arquivo na primeira linha gravável e pressione Enter. Repita para o nome da subpasta.NOTA: O layout da guia Coletar dados depende da seleção de uma série de radiografias decorridas no tempo (sem SE) ou tomografias computadorizadas (seleção de um estágio de rotação) na primeira guia. Na seção Alinhar amostra usando o arquivo salvo, selecione o arquivo que registrou anteriormente as posições do motor de amostra (etapa 1.8). Use os arquivos salvos recentemente para navegar pelos arquivos de alinhamento de exemplo salvos recentemente . Clique em Alinhar usando arquivo para fazer a amostra voltar à posição no feixe de nêutrons. Calcule o número de projeções necessárias para a TC com base no teorema de amostragem de Nyquist. Calcule o número de pixels na dimensão horizontal da amostra e multiplique por 1,5 para obter o número de projeções necessárias para atender à amostragem de Nyquist. Insira o Ângulo de Início de Rotação (geralmente 0°), o Ângulo Final de Rotação (geralmente 180°), o Tamanho do Passo de Rotação, o Número de Imagens por Etapa (geralmente definido como 1) e o Tempo de Exposição para cada imagem. Inicie a tomografia computadorizada clicando no botão Coletar dados . 4. Reconstrução de volume e processamento/análise de dados NOTA: Todas as ferramentas de software CG-1D para normalização, reconstrução e análise de dados estão disponíveis no repositório Python da instalação ORNL e nos servidores de análise da instalação. Para medições 2D, o pré-processamento pode ser feito usando notebooks Jupyter Python41. Uma ilustração de um bloco de anotações está disponível na Figura 4. Pode-se carregar e visualizar seus dados antes de selecionar uma região de interesse fora da amostra que é usada para normalizar para 1 (ou 100%) transmissão qualquer flutuação do feixe. Esses notebooks podem ser adaptados a cada medição, tornando o pré-processamento um esforço simples. Além disso, a análise 2D pode ser realizada no mesmo caderno, como rastrear mudanças cinéticas (ou seja, absorção de água em uma amostra) em uma amostra ao longo do tempo. Faça logon no servidor de análise Linux usando o nome de usuário e a senha. Abra o navegador da Web e digite jupyter.sns.gov. Abra o bloco de anotações Python Jupyter chamado iMARS3D. Execute as primeiras linhas do código (que carrega as ferramentas necessárias para executar o iMARS3D). Carregue dados, campo plano e escuro. Verifique se todos os três conjuntos de dados estão carregados corretamente. Prossiga com o corte dos dados, filtragem (conforme necessário), normalização (com correção automatizada da inclinação da amostra) e reconstrução volumétrica (um processo longo). Salve os dados na pasta de número do projeto chamada Compartilhado. Depois de ativar o AMIRA36, que também está disponível nos servidores de análise de instalações, carregue as fatias reconstruídas no software e prossiga com a visualização, filtragem e análise adicionais.

Representative Results

A Figura 5A é uma fotografia de um fêmur representativo de rato de tamanho semelhante ao medido; A Figura 5B,C representa a nCT do fêmur de um rato com o implante de Ti. A Figura 5B mostra a nCT do fêmur baseada em atenuação de falsa cor, enquanto a Figura 5C representa um corte diagonal através do osso com a mesma orientação da Figura 5B para revelar o implante de Ti (em escala de cinza) semelhante a uma TC médica de raios-X. Este implante não interage tanto com nêutrons quanto o material ósseo; assim, sua atenuação é mínima, e parece mais escuro (isto é, menos atenuante) do que o osso circundante. O osso trabecular, presente no espaço medular do fêmur, é claramente visível na extremidade proximal da amostra (setas vermelhas na Figura 5B). A Figura 6A,B mostra fotografias representativas do pulmão de camundongo fixado em etanol, em duas posições diferentes, usado para nCT para demonstrar a capacidade dos nêutrons de detectar espécimes de tecidos moles. O volume reconstruído do pulmão de camundongos obtido a partir da nCT é mostrado na Figura 6C,D, posicionado de forma semelhante à Figura 6A,B. Um corte através do lobo direito do pulmão é ilustrado na Figura 6E. Apesar do tamanho relativamente pequeno da amostra, a sensibilidade a nêutrons é claramente demonstrada por uma detecção da estrutura do pulmão com resolução espacial de ~75 μm. Como esperado, a faixa de atenuação é bastante ampla, com uma grande porção correspondendo a uma atenuação de nêutrons baixa a média, já que os pulmões têm uma estrutura semelhante a uma esponja contendo ar. A Figura 7A mostra uma fotografia da amostra da planta, enquanto a Figura 7B representa a representação volumétrica de falsa cor da raiz/sistema do solo da planta em um recipiente retangular de Al (que não é visível porque o Al é principalmente transparente para nêutrons). Em comparação com os conjuntos de dados anteriores, a SNR é mais pobre, como esperado, pois os dados foram adquiridos mais rapidamente para rastrear os movimentos dinâmicos de captação de água na raiz em 3D ao longo de 2,5 dias. Assim, cada exame de TC foi otimizado para ser medido dentro de uma janela de ~1,75 h. Apesar da pobre relação S/R, o sistema radicular no solo é claramente visível nos cortes verticais da amostra apresentados na Figura 7C,D em falsa cor. Figura 1: Desenho esquemático da linha de luz HFIR CG-1D de imagem de nêutrons. O feixe de imagem é definido pelo sistema de abertura que define a geometria de um feixe de cone. O feixe é transportado através de um tubo de voo cheio de He, com raspadores de feixe para remover nêutrons perdidos indesejados. Um forro de borracha furada dentro do tubo de voo diminui o fundo das linhas de luz vizinhas. Abreviações: HFIR = High Flux Isotope Reactor; Ele = hélio; L = distância da abertura do orifício de diâmetro, D, e do detector. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Instalação de imagem de nêutrons CG-1D no Reator de Isótopos de Alto Fluxo. A fotografia mostra, da frente direita para a esquerda, os tubos de voo, a área da amostra e a parada do feixe. O feixe de nêutrons está vindo do lado direito da fotografia. O tubo de voo foi assinado pelas comunidades de pesquisa científica e industrial que utilizam o instrumento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Interface EPICS. A interface CG-1D EPICS é dividida em três seções: a seção de status (à esquerda), a área de exibição (neste exemplo, uma radiografia bruta de um relógio de sol náutico de latão) e a entrada de parâmetros para imagens 2D e 3D. Abreviações: EPICS = Física Experimental e Sistema de Controle Industrial; 2D = bidimensional; 3D = tridimensional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Uma captura de tela de um bloco de anotações Jupyter. Este notebook é utilizado para visualizar um conjunto de radiografias antes de normalizá-las. Neste exemplo, o mesmo relógio de sol náutico de latão mostrado na Figura 3 é visualizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Fêmur de rato com implante de titânio. (A) Fotografia de um fêmur representativo de rato. (B) Volume renderizado em 3D de fêmur de rato obtido a partir de nCT. (C) Corte diagonal mostrando a haste de titânio dentro do fêmur. As setas vermelhas mostram o osso trabecular. As barras de escala são apresentadas pelos eixos x e y, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Pulmão de camundongo nCT . (A) e (B) Fotografias representativas do pulmão de camundongo. (C) e (D) Volume renderizado 3D baseado em atenuação do mouse usando o mesmo posicionamento que (A) e (B). (E) Corte representativo através do lobo direito do pulmão de camundongos (D) mostrando uma estrutura do pulmão obtida com um gradiente diferente de atenuação de nêutrons (principalmente baixa atenuação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Tomografia computadorizada de nêutrons e cortes através do sistema raiz/solo da planta . (A) Fotografia da amostra vegetal. (B) Volume renderizado em 3D a partir da tomografia computadorizada de nêutrons da planta mostrando o caule acima do solo, e o sistema do solo com água (em vermelho). (C) e (D) são cortes através da amostra angulada para mostrar o caule e as raízes no solo (setas vermelhas). Áreas azuis mais escuras no solo indicam a presença de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A radiografia de nêutrons e a TC de amostras biológicas são técnicas de imagem promissoras e complementares às radiografias ou à ressonância magnética. As etapas críticas na realização de um experimento de imagem de nêutrons de uma amostra biológica estão relacionadas à sua preparação e sua contenção na linha de luz. A otimização de um experimento é impulsionada pela pergunta científica a ser respondida. Se a questão científica requer alta resolução espacial para observar um fenômeno, então longos tempos de aquisição são necessários, e a desvantagem da nCT (com campo de visão de tamanho cm) é que leva horas para realizar uma varredura. Isso se deve principalmente à diferença no fluxo geral de nêutrons disponível em um reator em comparação com uma fonte síncrotron, onde as tomografias computadorizadas de raios X podem levar de segundos a minutos para alguns mm² de campo de visão. Embora o método possa ser aplicado a amostras de tecido ex vivo extraídas de animais, não pode ser estendido in vivo a animais vivos ou humanos devido ao risco de exposição à radiação (como raios gama produzidos por nêutrons e interações de nêutrons com os átomos da amostra). No entanto, é adequado para a obtenção de imagens das interações raiz/solo da planta (Figura 7), como a dinâmica da absorção de água.

A vantagem do uso de nCT rápido para a dinâmica da planta é a sensibilidade ao H na água e a ausência de danos de radiação à planta, ao contrário da TC de raios X. Além disso, um contraste único pode ser observado a partir do uso de nêutrons em amostras de osso/metal, como um fêmur de rato, onde o metal é relativamente transparente em comparação com os tecidos circundantes (Figura 5), potencialmente evitando artefatos metálicos induzidos pela TC de raios-X³⁹. Tecidos animais, como o pulmão de camundongos (Figura 6), mostram impressionante detecção de estrutura de tecidos moles porque os nêutrons são sensíveis ao H, mas a resolução espacial é um pouco o fator limitante nessas medidas. O contraste é fornecido pelos átomos H presentes nas amostras biológicas^19,39.

Com o avanço de novas técnicas, como a interferometria de grade de nêutrons, e a melhoria na resolução espacial (alguns mícrons foram recentemente relatados^42,43), a imagem por nêutrons pode oferecer ainda novos mecanismos de contraste para tecidos biológicos com melhor resolução espacial. A exploração de nêutrons de maior energia (para permitir a medição de amostras espessas) também promete a capacidade de medir seções maiores de um tecido animal, como um camundongo intacto, oferecendo assim novas possibilidades para a pesquisa biomédica.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Parte desta pesquisa utilizou recursos do Reator de Isótopos de Alto Fluxo, operado pela ORNL, e patrocinado pelo Departamento de Energia dos EUA, Office of Science, User Facilities, sob contrato DE-AC05-00OR22725 com a UT-Battelle, LLC. Parte desta pesquisa foi apoiada pelo ORNL através do programa Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship. Esta pesquisa também foi patrocinada pelo DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. Amostras femorais de ratos foram obtidas de experimentos realizados em colaboração com o Dr. Rick Sumner no Rush University Medical Center com financiamento obtido do NIH (R01AR066562) e do prêmio Orthopedic Research and Education Foundation-Smith and Nephew. A equipe quer agradecer às equipes de suporte HFIR que permitem o uso das linhas de luz de espalhamento de nêutrons.

Materials

Aluminum containers	custom		Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample
Aluminum foil	Fisher	01-213-100	Mouse lung sample containment
Deionized water or deuterium oxide			Water or D₂O can be used to enhance contrast, plant sample
Ethanol	Fisher	04-355-223	Mouse lung sample
Gauze sponges	CardinalHealth		Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample
Growth chamber	Conviron	A1000	Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample
Laboratory balance			Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample
Pure silica sand	US Silica Co.	Flint#13	Pure SiO₂ provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample
Sprague-Dawley Rats	Harlan	Order Code: 002-US	Rat femur sample
Titanium Rod	Goodfellow	TI007905	Rat femur sample

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Bilheux, H. Z., Cekanova, M., Warren, J. M., Meagher, M. J., Ross, R. D., Bilheux, J. C., Venkatakrishnan, S., Lin, J. Y., Zhang, Y., Pearson, M. R., Stringfellow, E. Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory’s High Flux Isotope Reactor. J. Vis. Exp. (171), e61688, doi:10.3791/61688 (2021).

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