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Biology

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Published: August 06, 2020
doi:
10.3791/61525
, , , , , , , , , ,
1Genome Biology of Neurodegenerative Diseases,German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases,German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 3Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research,University of Tübingen

Summary

Wir zeigen die Automatisierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC) und neuronalen Differenzierungen, die mit automatisierter Bildgebung und Analyse kompatibel sind.

Abstract

Manuelle Kultur- und Differenzierungsprotokolle für humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) sind schwer zu standardisieren, weisen eine hohe Variabilität auf und neigen zu spontaner Differenzierung in unerwünschte Zelltypen. Die Methoden sind arbeitsintensiv und nicht leicht für groß angelegte Experimente geeignet. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir ein automatisiertes Zellkultursystem, das an ein Bildgebungssystem mit hohem Durchsatz gekoppelt ist, und implementierten Protokolle zur Aufrechterhaltung mehrerer hiPSC-Leitungen in paralleler und neuronaler Differenzierung. Wir beschreiben die Automatisierung eines kurzfristigen Differenzierungsprotokolls mit Neurogenin-2 (NGN2) Überexpression, um innerhalb von 6-u20128 Tagen von hiPSC abgeleitete kortikale Neuronen zu erzeugen, und die Implementierung eines Langzeitdifferenzierungsprotokolls zur Erzeugung von hiPSC-abgeleiteten Midbrain-Neuronen (mDA) innerhalb von 65 Tagen. Außerdem haben wir den NGN2-Ansatz auf einen kleinen molekülabgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (smNPC) angewendet, der mit dem GFP-Lentivirus transduziert wurde, und einen automatisierten Neuriten-Auswuchs-Assay mit Live-Zell etabliert. Wir präsentieren ein automatisiertes System mit Protokollen, die für die routinemäßige hiPSC-Kultur und Differenzierung in kortikale und dopaminerge Neuronen geeignet sind. Unsere Plattform eignet sich für langfristige Freisprechkultur und High-Content/High-Throughput-HiPSC-basierte Verbindung, RNAi und CRISPR/Cas9 Screenings, um neuartige Krankheitsmechanismen und Arzneimittelziele zu identifizieren.

Introduction

Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) sind sich selbst erneuernd und können sich in fast jedem adulten Zelltyp unterscheiden. Diese Eigenschaften machen hiPSC zu einem nützlichen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung in der Grundlagenforschung und Arzneimittelentdeckung1. Human es psPSC behält den genetischen Hintergrund des Spenders bei, der die Ableitung krankheitsrelevanter Zelltypen ermöglicht, die am stärksten am Krankheitsverlauf betroffen sind/beteiligt sind, z. B. verschiedene neuronale Subtypen für neurodegenerative Erkrankungen2,3. Außerdem überwindet hiPSC einige der Grenzen tierischer und zellulärer Überexpressionsmodelle, indem es Krankheiten in einem menschlichen Kontext und physiologische Proteinexpressionsniveaus modelliert, und hat sich als wertvoller Vorteil bei der Modellierung von Krankheiten erwiesen, die von monogenen, komplexen und epigenetischen Erkrankungen bis hin zu spät auftretenden Krankheitenreichen 4.

Trotz dieser Vorteile und Möglichkeiten müssen noch einige Einschränkungen von hiPSC angegangen werden. Aktuelle hiPSC-Kultur- und Differenzierungsprotokolle sind nicht kosteneffektiv, schwer zu standardisieren und arbeitsintensiv. Manuelle Kulturschritte können aufgrund von Wachstumsunterschieden und spontaner Differenzierung von hiPSC zu einer hohen Variabilität der Erträge und Phänotypen führen. Daher müssen experimentierabhängige Variationen durch die Implementierung standardisierterer Handhabungstechniken und die Vereinfachung von Protokollen reduziert werden, die mit DerAutomation erreicht werden können5. Die Einführung automatisierter hiPSC-Kultur- und Differenzierungsprotokolle wird gemeinsame Standards für akademische und industrielle Forschungsprojekte festlegen und die Erstellung biologisch relevanter Krankheitsmodelle und reproduzierbarerer Ergebnisse ermöglichen.

Frühere Arbeiten haben versucht, die hiPSC Kulturen6,7,8 zu sanieren, aber ihre Protokolle wurden auf bestimmte Zellkulturplattenformate beschränkt, die vom System abhängig sind und nicht an verschiedene Assay-Formate angepasst sind. Solche Systeme sind nützlich bei der Füllstoffung von Zellen, aber möglicherweise nicht geeignet für die automatisierte Differenzierung in gewünschte Zelltypen, Krankheit Sphänotypisierung, und Screening-Zwecke. Darüber hinaus wurde eine groß angelegte automatisierte Plattform für Dieivation, hiPSC-Generierung und Differenzierung beschrieben9, aber in einem Maßstab, der nur durch Hochdurchsatzlabore erreicht werden kann, die sich der Herstellung von Linien widmen, die attraktiv erscheinen, aber für viele akademische Laboratorien unerschwinglich sein können.

Wir entwickelten ein vollautomatisches Zellkultursystem auf Basis einer Flüssigkeitsumschlagsstation in einer HOCHeffizienten Partikelluft (HEPA)-gefilterten Umgebung in Verbindung mit einem großflästigen CO2-Inkubator, einem Hellfeld-Bildzytometer und einem Roboterarm für den Plattentransport. Diese Komponenten bilden die Grundlage für eine stabile und reproduzierbare HiPSC-Kultur und Differenzierung. Ergänzt haben wir das System durch ein automatisiertes -20 °C-Speichersystem für die Compound- oder Virenspeicherung und eine hochgeschwindigkeits-Spinnscheibe konfokale Live-Zell-Imager. Es wurden maßgeschneiderte Protokolle erstellt, die automatisiertes Zellsäen, Medienwechsel, Konfluenzprüfungen, Zellerweiterung und Diessayplattengenerierung mit Probenbehandlung und Plattenbildgebung ermöglichen, wodurch das System mit Hochgehalts-/Hochdurchsatz-Screenings kompatibel ist. Das automatisierte Zellkultur- und Bildgebungssystem wird über die Steuerungssoftware und die maßgeschneiderte grafische Benutzeroberfläche (GUI) betrieben. Die GUI ermöglicht es Benutzern, CSV-Dateien zu importieren, die zelllinienspezifische Parameter enthalten, die für die Methodenausführung erforderlich sind. Darüber hinaus ermöglicht die GUI die Planung zahlreicher Experimente in beliebiger Reihenfolge mithilfe der integrierten Kalenderansicht, wodurch die volle Kontrolle über die Zeit ermöglicht wird, zu der jede Methode gestartet wird.

Unser automatisiertes Zellkultursystem verwendet standardisierte Pipettiergeschwindigkeiten, Passaging-Zeiten, Konfluenzschwellen, Sädichten und mittlere Volumina mit der Flexibilität, Zellen in einer Vielzahl von Plattenformaten (96-, 48-, 24-, 12-, 6- oder 1-Well-Plattenformat) zu befestigen. Wir haben ein kürzlich veröffentlichtes Kurzzeitdifferenzierungsprotokoll zur Umwandlung von HiPSC in Neuronen angepasst, die TUBB3-positive Neuronen in 6 Tagen10,11ergeben können. Wir etablierten auch die automatisierte Differenzierung und Bildgebung von kleinen neuronalen Vorläuferzellen (smNPC) in Neuronen, die GFP unter EF1a-Promotor12 und iPSC konstitutiv in mittelhirndopaminergen (mDA) Neuronen exzieren, und adaptieren ein zuvor veröffentlichtes Dual-SMAD-Hemmungsprotokoll13, das innerhalb von 65 Tagen mDA-Neuronen ergibt.

Protocol

1. Grundlegende Verfahren zur Automatisierung von Zellkulturen und Bildgebung Laden Sie neue Kulturplatten und Tipps Öffnen Sie die GUI und klicken Sie auf die Schaltfläche Ressourcen/Instrument-Prozessansicht. Um einen Ressourcen-/Instrumentenprozess auszuführen, wählen Sie den Ressourcen-/Instrumentenprozess aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Instrument ausführen. Führen Sie den Ressourcenprozess RunHepaHood und Reloading aus (siehe Schritt 1.1.1). Öffnen Sie die Tür, laden Sie die Zellkulturplatten und Einwegspitzen in der entsprechenden Position, wie im Pop-up-Bild auf dem steuernden PC angegeben. Wischen Sie die Tür mit 70% Ethanol für die Dekontamination und schließen Sie sie. Führen Sie den Instrumentenprozess Dekontamination über die GUI aus (siehe Schritt 1.1.1). Das System wird 30 min durch UV-Strahlung sterilisiert. Nachfüllkulturmedien und/oder Dissoziationsreagenz Führen Sie den Instrumentenschritt RunHepahood aus (siehe Schritt 1.1.1). Öffnen Sie die Eingangstür der Flüssigkeitsumschlagstation. Reservoirs (mit Medien, PBS und/oder Dissoziationsreagenz) mit 70 % Ethanol dekontaminieren und auf dem Deck auf das zugewiesene Positon legen (wie in cfg.csv-Datei definiert). Entdeckeln Sie die Reservoirs. Dekontaminieren Sie die Tür mit 70% Ethanol und schließen Sie sie. Schalten Sie die HEPA-Haube herunter, indem Sie den Ressourcen-/Instrumentenprozess “InitHepaHood” über die GUI ausführen. Erstellen einer neuen “Zellzeile” und eines Projekts in der GUI Erstellen/ändern Sie die benutzerdefinierten “Cell line”-Dateien, die aus den Dateien Config (*.cfg.csv), Import (*.imp.csv), Ressource (*.rsv.csv) und Workflowdateien (*.wfl.csv) bestehen. Öffnen Sie die GUI und erstellen Sie eine neue “Zellzeile”, indem Sie in der Ansicht “Zelllinien-Editor” auf die Schaltfläche Zelle linie hinzufügen klicken. Ein Assistent wird geöffnet, wobei die Config-Datei ausgewählt und ein Projektname mit einer kurzen Beschreibung eingegeben werden muss. Navigieren Sie mit der grünen Pfeilspitze durch diesen Assistenten und bestätigen Sie die Einstellungen, indem Sie auf das grüne Häkchen klicken. Erstellen Sie ein neues Projekt für die generierte “Zellenzeile”, indem Sie auf die Schaltfläche Projekt hinzufügen klicken. Geben Sie einen Projektnamen und eine Projektbeschreibung ein, und definieren Sie eine Projektfarbe, die in der Kalenderansicht der GUI sichtbar ist. Navigieren Sie zur nächsten Seite des Assistenten, indem Sie auf die Pfeilspitze klicken. Erstellen Sie einen neuen Stapel, indem Sie auf die Schaltfläche Batch hinzufügen klicken und im Popup-Fenster einen kurzen Namen und eine Beschreibung geben. Wählen Sie alle Prozessschritte aus, und planen Sie die Startzeit für jeden Prozessschritt. Schließen Sie das Fenster, indem Sie auf OKklicken. Ausführen einer automatisierten Methode mithilfe der GUI Wechseln Sie zur Kalenderansicht der GUI und klicken Sie auf die Schaltfläche Prozessschritt hinzufügen. Wählen Sie die Zeile Zelle aus, und wählen Sie nach dem Navigieren zur nächsten Seite des Assistenten das Projekt aus. Markieren Sie den zu verwendenden Stapel, und klicken Sie auf die Pfeilspitze, die nach rechts zeigt. Je nach verwendeter Methode müssen Chargen entweder leer sein (für den Empfang neuer Platten) oder Kulturplatten oder Assayplatten (alle anderen Prozesse) enthalten. Navigieren Sie zur nächsten Seite des Assistenten, und wählen Sie den Prozessschritt aus, der ausgeführt werden soll. Wechseln Sie zur letzten Seite dieses Assistenten, und planen Sie das Experiment. Im Abschnitt “Parameterdetails” können Variablen geändert werden, die zum Ausführen der Methode erforderlich sind. Bestätigen Sie dies, indem Sie auf OKklicken. Verladung von Kultur- und Assayplatten in den CO2-InkubatorHINWEIS: 1-Well-Platten werden als Kulturplatten definiert, da sie häufig für Massenzellen verwendet werden. Alle Multi-Well-Platten sind als Assayplatten definiert. Führen Sie den Instrumentenprozess “RunHepaHood” von der GUI aus aus, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. und öffnen Sie die Tür vor dem Roboterarm. Wischen Sie den Boden der Assayplatten mit 70% Ethanol und einem fusselfreien Gewebe ab, wenn Platten für die automatisierte Bildgebung geladen werden. Stellen Sie Kultur- oder Testplatten auf das linke Regal. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung der Platte korrekt ist. Bei Assayplatten muss A1 auf den Roboterarm zeigen, während die Kanten von Kulturplatten nach rechts zeigen müssen. Wischen Sie die Tür mit 70% Ethanol für die Dekontamination und schließen Sie sie. Führen Sie die Methode “Loading Of Culture Plates” zum Import von 1-Well-Platten oder “Loading Of Assay Plates” zum Importieren von Multi-Well-Platten aus, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Verwenden Sie einen leeren Batch, um beide Methoden auszuführen. Wenn Platten-Barcodes bereits in dieser Charge vorhanden sind, deaktivieren Sie sie, indem Sie auf die Kontrollkästchen klicken. Transportieren Sie einzelne Platten aus dem Regal zur CO2-Inkubatorplattform mit dem Roboterarm. Die eingebaute Platten-Shuttle-Station holt die Platte ab und speichert sie in einem der Regale des CO2-Inkubators. Die Zellen werden bei 37 °C und 5%CO2gehalten. Entladen von Platten aus demCO2-Inkubator Führen Sie die Methode “Platten entladen” aus (siehe Schritt 1.4). Wählen Sie die Charge aus, die die zu exportierenden Platten enthält. Einzelne Platten können anhand ihrer Barcodes ausgewählt werden. Transportieren Sie die Platten mit dem Roboterarm aus dem CO2-Inkubator in das linke Regal. Starten Sie die HEPA-Haube mit dem Instrumentenprozess “RunHepaHood”, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. und öffnen Sie die Tür vor dem Roboterarm. Entfernen Sie die Platten, dekontaminieren Sie die Tür mit 70% Ethanol, bevor Sie sie schließen, und schalten Sie die HEPA-Haube herunter. 2. Automatisierungsprotokolle Aussaat von Platten aus Rohren Starten Sie die HEPA-Haube, indem Sie den Instrumentenprozess RunHepaHood ausführen (siehe Schritt 1.1.1). Öffnen Sie die Tür vor der Flüssigkeitsumschlagstation. Geben Sie das 50 ml-Rohr ein, das die Zellsuspension enthält, und entdeckeln Sie das Rohr. Öffnen Sie die Tür vor dem Roboterarm und laden Sie beschichtete Kulturplatten, um Zellen im Regal aufzunehmen. Dekontaminieren und schließen Sie beide Türen. Führen Sie die Methode “Seeding of plates from tubes” (siehe Schritt 1.4) aus. Zählen Sie Zellen am hellfeldbildnisierenden Zytometer mit direkter Zellzählfunktion. Verwenden Sie für die Zellzählung 16 Bohrungen als Replikationen in einem 384-Well-Plattenformat. Transportieren Sie die 384-Well-Zählplatte vom Deck zum hellfeldbildnigen Zytometer über den Drehteller mit dem Roboterarm und starten Sie den Bildgebungsprozess. Das Zytometer bestimmt automatisch die Zellenzahl pro Milliliter. Bringen Sie die Zählplatte mit dem Roboterarm wieder in ihre ursprüngliche Position. Transportieren Sie eine beschichtete Kultur- oder Assayplatte mit dem Roboterarm vom Regal zum Pipettierdeck. Entfernen Sie Beschichtungs- und Seed-Zellen in der benutzerdefinierten Zahl und volumen geeignet für das Plattenformat (siehe Tabelle 1). Bewegen Sie die Platte auf den On-Deck-Shaker für 10 s bei 500 Rpm für die Zellverteilung und Übertragung in den CO2-Inkubator. Automatisierte Zusammenflussbewertung Führen Sie die in Schritt 1.4 beschriebene Methode “Confluency prüfen” aus. Wählen Sie eine Charge aus, die mindestens eine Kulturplatte und keine Assayplatten enthält. Im Abschnitt “Parameterdetails” eingabee “iPSCf_2020” für Einstellungen zur Bildaufnahme und Bildgebungsanalyse. Transportieren Sie die erste Platte vom CO2-Inkubator über den Drehteller mit dem Roboterarm zum hellfeldbildnisierten Zytometer. Bildgebung von Zellen im Hellfeld-Bildzytometer zur Zusammenflusskontrolle von HiPSC-Kolonien durchführen. Verwenden Sie “Confluence”-Anwendung und Bild 13 Felder der 1-Well-Paste und berechnen Sie automatisch die durchschnittliche Fläche, die von Zellen belegt wird. Transportieren Sie die Platte mit dem Roboterarm zurück zum CO2-Inkubator. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2. bis 2.2.4. für die restlichen Platten. Medienwechsel von Kulturplatten oder Assayplatten Führen Sie die in Schritt 1.4 beschriebene Methode “Media Change Of Culture Plates” aus. und wählen Sie eine Charge aus, die nur Kulturplatten enthält. Legen Sie die Variable fest, die angibt, ob Spitzen oder Nadeln für die Pipettierschritte im Abschnitt “Parameterdetails” verwendet werden. Führen Sie für den Medienwechsel einer Multi-Well-Platte die Methode “Media Change Of Assay Plates” aus und wählen Sie eine Charge aus, die Assayplatten enthält. Transportieren Sie die einzelnen Platten vom CO2-Inkubator mit dem Roboterarm zum Deck und entdecken Sie die Platten. Kippen Sie die Platten automatisch und aspirieren Sie alte Medien und entsorgen Sie sie in das Abfallsammelmodul. Fügen Sie 12 ml frische Medien hinzu. Verdeckeln Sie die Platte neu und transportieren Sie die Platten mit dem Roboterarm zurück zum CO2-Inkubator. SubkultivierungHINWEIS: Führen Sie den Instrumentenprozess “RunHepaHood” von der GUI aus aus, wie in 1.1.1 beschrieben. und öffnen Sie die Eingangstür der Flüssigkeitsumschlagstation. Lademedium und Dissoziationsreagenz an den gewünschten Stellen (siehe Schritt 1.2). Wenn Die Tipps nachgefüllt werden müssen, verwenden Sie das “Reloading”, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Geben Sie ein 50 ml-Rohr ein, um die Zellsuspension aufzunehmen und das Rohr zu entdeckeln. Führen Sie die Methode “Subkulturierung von anhaftenden Zellen” aus (siehe Schritt 1.4). Wählen Sie die Charge aus, die Kulturplatten enthält, die subkultiviert werden müssen. Transportieren Sie die Platten vom CO2-Inkubator mit dem Roboterarm zum Deck und entdecken Sie die Platten. Kippen Sie die Platten automatisch, entfernen Sie alte Medien und entsorgen Sie sie in das Abfallsammelmodul. Waschen Sie Zellen einmal mit 8 ml PBS. Fügen Sie 8 ml 0,5 mM EDTA für klumpenbasiertePassierung hinzu. Inkubieren Sie auf dem Deck für 8 min. Entfernen Sie die EDTA-Lösung von den Platten und entsorgen Sie sie in das Abfallsammelmodul. 12 ml frisches Medium hinzufügen und die Platten zum Shaker transportieren. Schütteln Sie bei 2000 Rpm für 1 min, um die Kolonien zu vertreiben. Trituieren Sie die Zellsuspension für fünf Zyklen der Pipetten, um die iPSC-Kolonien in eine kleinere Größe zu brechen (50,201280 m). Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml Rohr auf dem Deck. Samenzellen automatisch, wie in Schritt 2.1.5 beschrieben, mit einem Split-Verhältnis von 1 zu 7.HINWEIS: Optionale, einzellige Passaging. Generieren Sie eine Einzelzellsuspension mit Einzelzelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle). Anstelle von 0,5 mM EDTA in Schritt 2.4.2. 8 ml Einzelzelldissoziationsreagenz verwenden und 20 min bei 37 °C inkubieren. Sammeln Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Rohr und fügen Sie gleiche Medienmenge hinzu. Die Dissoziation mit dem reziziziationenreagenz mit Einzelzellen erfordert einen manuellen Schritt, um die Zellen zu pellet. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 12 ml des erforderlichen Mediums wieder auf und fahren Sie mit “Seeding of plates from tubes” fort (siehe Schritt 2.1). Ergänzen Sie die Medien mit 2 M Thiazovivin am Tag der Aussaat bei verwendung von einzelligen Suspension von HiPSCs. Automatisierte Hochauflösende Bildgebung mit hohem DurchsatzHINWEIS: Die Messeinstellung muss verfügbar sein (siehe Zusatzdatei 1: Schritt 1.1). Die zu bebildernden Assayplatten sind im Inkubator verfügbar. Führen Sie die Methode “Imaging” aus (siehe Schritt 1.4). Wählen Sie eine Charge aus, die mindestens eine Assayplatte und keine Kulturplatte enthält. Geben Sie im Abschnitt “Parameterdetails” den Plattentyp, die Plattendefinitionen (für Standard96-Well-Bildplatten: “Plate-96-20170918113842”) und den Namen der Messeinstellung ein. Transportieren Sie die Assayplatte über den Drehteller zum automatisierten Konfokalmikroskop, um mit dem Roboterarm den Bildprozess zu starten. Stellen Sie die Platte am Ende der Bildgebung vom Mikroskop zurück und transportieren Sie sie zurück zum CO2-Inkubator. Wiederholen Sie den Vorgang der verbleibenden Platten in der Charge. 3. Automatisierte Wartung und Erweiterung von hiPSC Die Abfolge von automatisierten Konfluenzprüfungen, Medienwechseln und Subkulturen Samenzellen auf 1-Well-Platten nach dem Verfahren “Seeding of plates from tubes” (siehe Schritt 2.1). Alternativ können Sie manuell gesäte 1-Well-Platten mit der Methode “Loading of culture plate” importieren (siehe Schritt 1.5). Planen Sie täglich automatisierte Konfluenzkontrollen, um das Wachstum der Kolonien vom ersten bis zum 6. Tag der Kultur für iPSC zu überwachen (siehe Schritt 2.2). Aktualisieren Sie Medien jeden zweiten Tag mit der Methode “Medienwechsel von Kulturplatten” (siehe Schritt 2.3). Pro Platte werden 12 ml Medium verwendet. Beginnen Sie am 6. Tag mit dem Prozess “Subkultivierung” (siehe Schritt 2.4.). 4. Automatisierte Differenzierung Human es iPSC zu kortikalen NGN2-NeuronenHINWEIS: Manuelle hiPSC Vorbereitung. Das Protokoll beinhaltet eine Überexpression von NGN2 unter Verwendung von lentiviralen Vektoren für die Lieferung. Transduce hiPSC mit NGN2 zu rTTA3 lentivirus im Verhältnis 1:2 (> 107 TU/ml). Die Zellen werden dann für einen Durchgang mit 0,5 g/ml Puromycin ausgewählt. Ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung stabiler hiPSC-NGN2-Leitungen befindet sich in der Zusatzdatei 1: Schritt 2. Fahren Sie mit dem “Subkultivierungsprozess” fort, wie in Anmerkung von Schritt 2.4.4 beschrieben, mit dem in Anmerkung 2.4.4 beschriebenen rezidivierenden Reagenz der einzelzelligen Dissoziation. wenn hiPSC 70-u201280% Konfluenz erreichen Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 12 ml NGN2-Medien(Materialtabelle) wieder aus, die 2,5 g/ml Doxycyclin (Dox) und 2 M Thiazovivin enthalten. Beginnen Sie mit der Differenzierung mit der Methode “Seeding of plates from tubes” (siehe Schritt 2.1). Stellen Sie die gewünschte Sädichte von iPSC auf 30.000/cm2 ein (siehe Tabelle 1). Die iPSC werden auf vorbeschichtete Platten mit 0,1 mg/ml Poly-L-Ornithin (PLO) und 5 g/ml Laminin plattiert.HINWEIS: 1-Well-Platten werden für RNA- und Proteomik-basierte Studien bevorzugt, während das 96-Well-Plattenformat für bildgebende Experimente bevorzugt wird. Andere Assayplattenformate wie 48-, 24-, 12- oder 6-Well-Platten können ebenfalls verwendet werden. Am ersten Tag der Differenzierung, Refresh Medien mit dem “Medienwechsel von Assay-Platten (siehe Schritt 2.3) mit NGN2 Medium, ergänzt mit 2,5 g/ml Dox und 10 ‘MN-[2S-(3,5-Difluorphenyl)acetyl]-L-Alanyl-2-phenyl-glycin, 1,1-Diethylester (DAPT). Fahren Sie mit Medienänderungen alle 2-20123 Tage bis zum gewünschten Tag der Differenzierung fort (siehe Schritt 2.3). Führen Sie am 4. Tag der Differenzierung eine weitere Medienveränderung (siehe Schritt 2.3.) mit NGN2-Medium durch, das mit 10 ng/mL neurotrophen Faktor (BDNF), 10 ng/ml glialzellabgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) und 10 ng/ml neurotrophen Faktor 3 (NT-3) ergänzt wird, um die Reifung zu verbessern. Exportieren Sie am Ende des Experiments die Kulturplatten aus dem System für nachgelagerte Experimente (siehe Schritt 1.6). Kleine Molekül-Neuralvorläuferzellen (smNPC) zu NGN2-NeuronenHINWEIS: Ableiten smNPC nach der angepassten Version des veröffentlichten Protokolls12 (siehe Ergänzende Datei 1: Schritt 5). Ändern Sie den smNPC mit dem NGN2- und rTTA3-Virus (siehe Ergänzende Datei 1: Schritt 2). Eine Runde NGN2- und rTTA-Transduktion reicht aus, um eine stabile Population zu erzeugen. Weiter modifizieren smNPC mit pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus ermöglicht live-Zell-Überwachung durchzuführen. Für die GFP-Lentiviraltransduktion wird eine Infektionsvielzahl (MOI) von 10 verwendet. Passage smNPC beim Erreichen der Konfluenz mit Einzelzelldissoziationsreagenz, wie in Schritt 2.4 beschrieben. Hinweis. Samenzellen mit dem automatisierten Zellkultursystem bei einer Zelldichte von 50.000/cm2 nach dem Verfahren “Seeding of plates from tubes” (siehe Schritt 2.1.) auf vorbeschichtete Platten mit 0,1 mg/ml PLO und 5 g/ml Laminin in NGN2-Medium, ergänzt mit 2,5 g/ml Dox. Führen Sie am 3. Tag einen Medienwechsel (siehe Schritt 1.3.) mit frischem NGN2-Medium aus, das 2,5 g/ml Dox und 10 M DAPT enthält. Führen Sie nach Tag 3 jeden dritten Tag Medienwechsel mit frischem NGN2-Medium mit je 2,5 ng/ml Dox, BDNF, GDNF und NT-3 mit je 10 ng/ml durch. Bildzellen täglich mit der Methode “Automated high content, high throughput imaging” (siehe Schritt 2.5) zur Überwachung des Differenzierungsstatus mit GFP als Auslese für Neuritenauswuchs. Stellen Sie die Laserleistung auf 80 % ein und verwenden Sie eine Belichtungszeit von 30 ms. Erwerben Sie eine große Anzahl von Feldern (z. B. 25 Felder) mit dem 20-fachen Objektiv. Batch-Bildanalyse Führen Sie die Bildanalyse mit der Bildanalysesoftware 1 mithilfe der Nerit-Auswuchsvorlage durch. Öffnen Sie die Software. Wählen Sie die Option “Daten” und navigieren Sie zum Ordner Imaging Data, klicken Sie auf OK, um die zu analysierenden Daten zu laden. Klicken Sie auf Öffnen und wählen Sie in der oberen Menüleiste das Protokoll aus und wählen Sie im Anwendungsmenü Neuritenauswuchsaus. Gehen Sie zu “Algorithmen” und verwenden Sie den Kanal “488”, um den Kern, den Zellkörper und das Neurit zu definieren. Passen Sie die Schwellenwertparameter für jeden an. Wählen Sie die Brunnen aus, die für die Bildanalyse verwendet werden sollen. Klicken Sie unten rechts auf den Link, und wählen Sie zu analysierende Features aus, z. B. den Durchschnitt der Zellenanzahl und die Gesamtgesamtlänge des Skeletts. Fahren Sie mit “Pre-Analyze” gefolgt von “Vorschau” fort. Überprüfen Sie, ob die Vorschaueinstellungen akzeptabel sind, und starten Sie die Analyse im Batchmodus. Die Ergebnisse sind im übergeordneten Ordner unter “Berichte” im .csv Dateiformat verfügbar, das in Excel geöffnet werden kann.HINWEIS: Bildanalyseskript ist auf Anfrage verfügbar. Plot durchschnittliche Neuritenlänge erhalten durch die gesamte Neuritenlänge normalisiert zu Zellzahl. 5. Automatisierte Differenzierung von HiPSC in Midbrain dopaminergen (mDA) Neuronen Manuelle hiPSC-Vorbereitung Dissoziieren Sie 70-u201280% konfluentes hiPSC in einzelne Zellen mit dem einzelzelligen Dissoziationsreagenz. Kurz gesagt, inkubieren Zellen mit Einzelzelldissoziationsreagenz (100 l/cm2) 30 min bei 37 °C, Sammeln Sie Zellsuspension in ein konisches Rohr, Zentrifuge bei 200 x g für 5 min und resuspendieren Sie Zellpellet in iPSC Kulturmedium. Samen 200.000 Zellen/cm2 auf extrazellulären Matrix-beschichteten 1-Well-Platten und iPSC-Kulturmedium, ergänzt durch 10 ‘M Y-27632. Kulturzellen über Nacht bei 37 °C und 5%CO2. Automatisierte Differenzierung: Phase 1 Bereiten Sie das automatisierte Kultursystem wie in Schritt 1.1-u20121.2 beschrieben vor. Laden Sie Kulturplatten, die Zellen enthalten, in den CO2-Inkubator des automatisierten Kultursystems (siehe Schritt 1.5). KSR-Medium vorbereiten (siehe Materialtabelle) und Ergänzung mit kleinen Molekülen (siehe Tabelle 2), die für den Start der Differenzierungstag 0 erforderlich sind. Verwenden Sie nur frisch zubereitete Medien mit kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren. Führen Sie Medienwechsel der Kulturplatten durch, wie in Schritt 2.3 an den Tagen 0 und 1 der Differenzierung beschrieben, und dann jeden zweiten Tag bis zum 25. Tag. Ab Tag 5, Schichtmedienformulierung nach und nach, wie in Tabelle 3ausführlich beschrieben. Fügen Sie am 11. Tag mDA Neurondifferenzierungsmedium hinzu, das mit CHIR (bis 13. Tag), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 und DAPT ergänzt wird (siehe Materialtabelle). Am 25. Tag Platten entladen (siehe Schritt 1.6.) Manuelle Replatierung 1 Dissoziate Tag 25 mDA Vorläufer in einzelzellen mit dem Einzelzelldissoziationsreagenz. Kurz gesagt, inkubieren Zellen mit Einzelzelldissoziationsreagenz (100 l/cm2) für 40 min bei 37 °C, sammeln Zellsuspension in einem konischen Rohr, Zentrifuge bei 200 x g für 5 min und resuspendieren Zellpellet in mDA Neuron Differenzierungsmedium. Samen 400.000 Zellen/cm2 in 1-Well-Kulturplatten, vorbeschichtet mit 0,1 mg/ml PLO, 10 g/ml Laminin und 2 g/ml Fibronectin in mDA-Neurondifferenzierungsmedium, ergänzt mit 10 ‘M Y-27632 (bis Tag 26) und kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, die in Tabelle 2beschrieben sind. Kulturzellen über Nacht bei 37 °C und 5%CO2. Automatisierte Differenzierung: Phase 2 Belasten Sie Kulturplatten, die mDA-Neuronen enthalten, in denCO2-Inkubator des automatisierten Kultursystems, wie in Schritt 1.5 beschrieben Vorbereiten des mDA-Neuronendifferenzierungsmediums (siehe Materialtabelle) und Ergänzung mit kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, die für die endgültige Differenzierung ab dem 26. Tag erforderlich sind (siehe Tabelle 2). Führen Sie Medienwechsel von Kulturplatten, wie in Schritt 2.3 beschrieben, am 26. Tag der Differenzierung und dann alle 3-u20124 Tage bis zum Tag 65 durch.HINWEIS: Für Bildgebungszwecke mit hohem Durchsatz wird empfohlen, die mDA-Neuronen in 96-Well-Platten mit geringer Dichte an Tag 32 der Differenzierung, wie in Schritt 5.5 beschrieben, neu zu veranersten. Manuelle Replatierung 2 Entladung von Kulturplatten, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Dissoziate Tag 32 mDA Neuronen in einzelne Zellen, wie in Schritt 5.3.1 beschrieben. Samen 100.000 Zellen/cm2 in 96-Well-Platten, vorbeschichtet mit 0,1 mg/ml PLO, 10 g/ml Laminin und 2 g/ml Fibronectin in mDA-Neurondifferenzierungsmedium, ergänzt mit 10 ‘M Y-27632 (bis Tag 33) und kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle 2). Kulturzellen über Nacht bei 37 °C und 5%CO2. Ersetzen Sie am 33. Tag das Medium durch frisch zubereitete DA-Neuronen differenzierungsmittel, ergänzt durch kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren (ohne Y-27632). Wechseln Sie das Medium manuell alle 3-u20124 Tage bis zum Tag 65. 6. Immunostaining, automatisierte Hochdurchsatz-Bildaufnahme und -analyse Fluoreszenzfärbung Führen Sie eine fluoreszierende Immunfärbung durch, wie in der Zusatzdatei 1:Schritt 4 beschrieben. Bildzellen, wie in der Zusatzdatei 1beschrieben: Schritt 1.2. Laden Sie vom Bildgebungssystem generierte Bildgebungsdateien zur weiteren Bildanalyse in die Bildanalysesoftware 2 (siehe Tabelle der Materialien) hoch, um sie zu analysieren, wie in Schritt 6.2 beschrieben. Bildanalyse mit der Bildanalysesoftware 2 Sobald Bildgebungsdateien in Bildanalysesoftware 2 hochgeladen werden, gehen Sie zur Funktion “Bildanalyse” und erstellen Sie den Analysealgorithmus mithilfe des Dropdown-Menüs. Wählen Sie Kerne mit der Aufgabe “Kerne finden”, die Regionen auf dem Bild erkennt, die zu Zellkernen gehören (hier mit Hoechst befleckt). Kerne aus abgestorbenen Zellen ausschließen (pyknotische Kerne), indem ein Schwellenwert für kerntechnische Saum oder Durchmesser gesetzt wird. Wählen Sie das Zellzytoplasma mit der Aufgabe “Totplasma finden”. Diese Aufgabe erkennt Regionen um Kerne, die zum Zellzytoplasma gehören. Schließen Sie nur gut segmentierte Zellen ein. Ausschließen mitotischer, apoptotischer und schlecht segmentierter Zellen. Entfernen Sie Zellen, die den Rahmen des Bildes berühren. Fügen Sie die Aufgaben “Morphologieeigenschaften berechnen” und “Intensitätseigenschaften berechnen” hinzu. Die Morphologieparameter umfassen die Berechnung von Morphologieeigenschaften, z. B. Fläche für eine Interessenregion. Die Intensitätsparameter umfassen die Berechnung von Intensitätseigenschaften wie mittlerer Intensität für eine Interessenregion (z. B. Zytoplasma von Neuronen). Wählen Sie eine Subpopulation (z. B. TH-positive Neuronen) der Eingangspopulation (alle ausgewählten Zytoplasmen) unter Verwendung einer oder mehrerer Bedingungen, Morphologie und/oder Intensität.HINWEIS: Normalerweise wird die Intensität für Neuronen gewählt. Basierend auf negativen Kontrollen ist es möglich zu definieren, über welche Intensitätsschwelle die Neuronen für TH als positiv angesehen werden. Definieren Sie die Ausgabeergebnisse. Dies ist der letzte Baustein jeder Analyse. Es definiert die Testauslesewerte für jeden Brunnen einer Kulturplatte (Ergebnisse pro Brunnen). Führen Sie die Batchanalyse aus, und exportieren Sie die Ergebnisse. Normalisieren Sie die Anzahl der positiven Zellen auf die Gesamtzahl der Kerne und stellen Daten als Prozentsatz der positiven Zellen dar. 7. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Führen Sie das qRT-PCR-Protokoll wie in der Zusatzdatei 1: Schritt 3 beschrieben durch.

Representative Results

Unser automatisiertes Zellkultur- und Bildgebungssystem wurde entwickelt, um menschliche Eingriffe zu minimieren, die es uns ermöglichen, die Kultivierung von HiPSC und die Differenzierung in verschiedene Zelltypen wie kortikale oder mittelhirndopaminerge (mDA) Neuronen zu standardisieren. Eine schematische Übersicht über unser automatisiertes Zellkultursystem mit integrierten Bildgebungsgeräten ist in Abbildung 1dargestellt. Die anfängliche Einführung von Zellkulturen in dieses automatisierte Zellkultursystem kann entweder durch automatisches Säen von Zellen aus einem 50 ml-Rohr oder durch die “Loading Of Culture Plates”- oder “Loading Of Assay Plates”-Methode für den Import von Kultur- oder Assayplatten erfolgen. Ein zentraler Bestandteil unseres Systems ist die Flüssigkeitsumschlagsstation, in der alle Flüssigkeitstransferschritte wie Medienwechsel oder Subkulturen durchgeführt werden. Das maßgeschneiderte Decklayout des Flüssigkeitshandlers ist in Abbildung 2dargestellt. Die Flüssigkeitsumschlagstation ist mit vier Positionen ausgestattet. Bis zu vier Platten können vom Inkubator auf das Deck übertragen werden, was parallele Medienwechsel ermöglicht. Da bei der Subkultivierungsmethode sowohl die Eltern- als auch die Tochterkulturplatten auf dem Deck untergebracht werden müssen, ist die maximale Anzahl parallel verarbeiteter Kulturplatten auf zwei begrenzt. Ein wichtiges Merkmal der Flüssigkeitsbehandlungsstation ist die Möglichkeit, die Platten während des Medienwechsels zur vollständigen Entfernung des Zellkulturüberstandes zu neigen. Auch die Flüssigkeitsabfertigungsstation ist mit Shakern ausgestattet, um die enzymatische Dissoziation von Zellen während der Ausführung des Subkultivierungsprotokolls zu begünstigen. Unser automatisiertes Kultursystem ist außerdem mit zwei Bildgebungssystemen ausgestattet: einem Lichtfeld-Bildgebungszytometer zur Durchführung von Zellzählungs- und Konfluenzprüfungen und damit zur Überwachung des Zellwachstums im Zeitverlauf und einem Konfokalmikroskop mit zwei Spinnscheiben für eine schnelle, hochklassige und hochauflösende Bildgebung von Zellen. Die HiPSC-Kulturen werden täglich auf das Wachstum des hellfeldbildnigen Zytometers überwacht und auf den Prozentsatz der Konfluenz analysiert. Das hellfeldbild im linken Bereich und im rechten Bereich eine grüne Maske aus der Analyse des hellfeldbildes, das mit dem Zytometer erhalten wurde (Abbildung 3A). Im Laufe der Zeit wird ein homogenes HiPSC-Wachstum beobachtet, wie die Zusammenflussprozentsätze zweier parallel angebauter HiPSC-Linien (n = 4 Platten) zeigen, die von Tag 1 bis Tag 6 einer Konfluenzprüfung unterzogen werden (Abbildung 3B). Nach Erreichen der eingestellten Schwelle werden die hiPSC durchgehen. Die Zelllinien wurden manuell (m) oder durch das Automatisierungssystem (a) kultiviert und zur Aufrechterhaltung der typischen Stammzellmorphologie für mindestens zwei Passagen, repräsentative Hellfeldbilder (Abbildung 4A) beobachtet. Das manuell (nicht gezeigt) oder im automatisierten System kultivierte HiPSC zeigte den typischen Stammzellmarker OCT4 (rot) und SSEA4 (grün), wie im Immunfluoreszenztest gezeigt (Abbildung 4B). Die Expression der Pluripotenzmarker OCT4, NANOG und REX1 wurde ebenfalls auf mRNA-Ebene mit qRT-PCR bewertet (Abbildung 4C). Relative Quantifizierungen wurden mit Proben durchgeführt, die aus einer manuell angebauten Zelllinie (m) und im automatisierten Kultursystem (a) in Duplikaten (Replikationen 1 und 2) entnommen wurden. Die Expressionsebenen aller drei Pluripotenzmarker in den im automatisierten Kultursystem kultivierten Repliken ähneln dem Markerausdruck nach der manuellen Kultur. An Tag 8 (D8) fehlte die Expression von Pluripotenzmarkern in kortikalen Neuronen, die (Diff) von HiPSC unterschieden. Eine wichtige Anwendung des automatisierten Kultursystems ist die Differenzierung von hiPSC in verschiedene Zelltypen einschließlich Neuronen. Hier zeigen wir die Differenzierung von HiPSC in Neuronen mit der NGN2-Strategie, die in sehr kurzer Zeit (ca. 6 Tage) eine reine kortikale Neuronenkultur erzeugt. Neuronen, die im automatisierten Kultursystem differenziert sind (a) präsentierten eine ähnliche Morphologie und neuronale Netzwerkorganisation wie die manuell kultivierten Neuronen (m) (Abbildung 5A). Automatisierte differenzierte kortikale Neuronen waren positiv für TUBB3 (neuronspezifische Klasse III β-Tubulin, rot) und BRN2 (obere kortikale Schichtmarker, grün) (Abbildung 5B), vergleichbar mit manuell differenzierten Neuronen (Daten nicht dargestellt). Die Expression neuronaler Marker einschließlich des mikrotubuli-assoziierten Proteins 2 (MAP2), des Nervenzelladhäsionsmoleküls (NCAM1) und Synapsin-1 (SYN1) sowie der kortikalen Neuronenmarker BRN2 und CUX1 (obere kortikale Schicht) wurden an Tag 8 (D8) der Differenzierung in Neuronen angereichert (Abbildung 5C). Bei hiPSC wurde ein sehr niedriger oder gar kein Ausdruck dieser Marker beobachtet. Relative Quantifizierungen wurden mit Proben durchgeführt, die aus einer manuell angebauten Zelllinie (m) und im automatisierten Kultursystem (a) in Duplikaten (Replikationen 1 und 2) entnommen wurden. Die Ausdrucksebenen in Replikationen zeigen ähnliche Abweichungen zwischen manuellen und automatisierten Differenzierungen. Die integrierte Bildgebungsfunktion des automatisierten Kultursystems ermöglicht die freihändige Datenerfassung für die Gesundheit von Kulturen und ermöglicht so eine langfristige automatisierte Erfassung von phänotypchen Auslesungen. Mit dem NGN2-Ansatz für eine kleine Molekül-abgeleitete neuronale Vorläuferlinie (smNPC) mit GFP-Lentivirus transduziert, haben wir einen livezellierten automatisierten Neuriten-Auswüchs-Assay etabliert, bei dem die Neuritenlänge über 11 Tage der Differenzierung ohne manuelle Eingriffe gemessen wurde. Die Komplexität des Neuriten nahm im Laufe der Zeit zu, wie das mit Neuriten belegte Gebiet am Tag 1, 3 und 11, GFP-Expression und maskierte Bilder aus der Analyse zeigt (Abbildung 6A, B). Der Anstieg der Neuritenlänge vom ersten bis zum elften Tag der Differenzierung wurde quantifiziert und zeigte eine ähnliche Entwicklung in verschiedenen Brunnen. Der Einfachheit halber werden Daten aus nur 3 Spalten mit je 6 Brunnen aus einer 96-Well-Platte in der repräsentativen Grafik dargestellt, obwohl alle inneren 60 Brunnen analysiert wurden (Abbildung 6C). Eine weitere Anwendung des hier gezeigten automatisierten Kultursystems ist die Differenzierung von hiPSC in mDA-Neuronen. Die Differenzierung basiert auf Medienänderungen nach einem vorab festgelegten Protokoll und wurde auf dem automatisierten Kultursystem von den Tagen 0 bis 65 durchgeführt. Automatisierte Medienänderungen verursachten keine Zellablösung oder andere visuell nachweisbare Änderungen in der Differenzierung. Am Ende der Differenzierung, am 65. Tag, zeigen mDA-Neuronen die zelluläre Organisation und Morphologie (sphärisches Soma, lange und stachelige Dendriten) vergleichbar mit manueller Differenzierung (Abbildung 7A, B). Auf mRNA-Ebene zeigen mDA-Neuronen, die im automatisierten Kultursystem differenziert sind, die Expression von neuronalen und mDA-Markern, MAP2 und TH (Tyrosinhydroxylase) bzw. (Abbildung 7C). Beide Differenzierungen erzeugten erhebliche Mengen an TH- und MAP2-positiven Neuronen (Abbildung 7D). Abbildung 1: Schematische Übersicht über die automatisierte Zellkultur- und Bildgebungsplattform.Das System wurde mit einem Polycarbonatgehäuse und zwei HEPA-Hauben (A und B) ausgestattet, die mit vier UV-Lampen ausgestattet sind und eine sterile Umgebung für Zellkulturanwendungen gewährleisten. Zellkulturplatten werden auf Regale vor dem Roboterarm geladen, die über die Haustür (C) zugänglich sind. Die Platten werden in denCO2-Inkubator (D) mit einer Kapazität von 456 Platten geladen. Ein Hellfeldzellzytometer (E) wird für Konfluenzprüfungen und Zellzählungen während der Subkultivierungsroutinen verwendet. Die Flüssigkeitsabfertigungsstation befindet sich unterhalb einer der HEPA-Hauben (B). Das Decklayout des Flüssigkeitshandlers ist in Abbildung 2beschrieben. Der Pipettierarm der Flüssigkeitsbehandlungsstation trägt einen 96-Kanal-Pipettierkopf, acht 1 ml Pipettierkanäle und vier 5 ml Pipettierkanäle. Bei den 1 ml Pipettierkanälen können Spitzen oder Nadeln für Flüssigkeitstransfers verwendet werden. Zu Screening-Zwecken können Zellen, die in Assayplatten gesät sind, nach dem Auftauen dieser Proben in einem zweiten Inkubator (G) mit Proben behandelt werden, die bei -20 °C im automatisierten -20 °C-Lagersystem (F) gelagert werden. Die Bildgebung mit hohem Durchsatz wird im automatisierten konfokalen Mikroskop (H) durchgeführt, das das Bild im konfokalen Modus mit zwei Spinnscheiben oder im Epifluoreszenzmodus erfasst. Eine in das Mikroskop integrierte Live-Zell-Kammer ermöglicht die Langzeitbildgebung kultivierter Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Das Decklayout der Flüssigkeitsumschlagstation.Die Spitzenpositionen werden durch “50 l” für 50 l Spitzen, durch “Standard” für 300 l Spitzen, durch “hoch” für 1 ml Spitzen und durch “5 ml” für 5 ml-Spitzen angezeigt. Deckkomponenten: (A) Vier beheizte Shakerpositionen (max. Geschwindigkeit: 2500 Rpm), die für jede Kulturplatte oder assay plate Format verwendet werden können. Die Schüttelpositionen sind mit klemmbaren Greifern ausgestattet, die auch für die Plattenausrichtung nach Transporten zum Deck verwendet werden. Darüber hinaus fungieren die Schüttelpositionen als Deckelparkposition für Platten während der Flüssigkeitstransferschritte. Für repräsentative Zwecke werden alle Shaker-Positionen mit 96 Well-Assay-Platten besetzt. (B) Vier Kippmodule zur gleichzeitigen Verarbeitung von vier Platten eines beliebigen Formats sind oben positioniert. Die unterste Position markiert die Abfallsammelkammer für Kultur- und Assayplatten und den 96-Kanal-Pipettierkopf. Für repräsentative Zwecke sind alle Kippmodule mit 96-Well-Assayplatten belegt. (C) An der oberen Position befindet sich die 384-Well-Platte für die Zellzählung. Unten sind zwei Positionen für Platten, die von 96-Well-Platten für repräsentative Zwecke besetzt sind und ein Rack für vier 50 ml und vier 15 ml Rohre. Die unterste Position wird mit 5 ml Spitzen belegt. (D) Drei Medienlinien mit Positionen für Medienreservoirs. Die Medienleitungen verfügen über Flüssigkeitsstandssensoren, die es ermöglichen, das Medienreservoir automatisch mit bis zu 250 ml Medien zu füllen. (E) Zwei Flüssigabfallmodule mit aktivem Abfluss basieren auf der Oberseite, unterhalb eines temperaturgeregelten Moduls mit einer Position für einen Behälter (weiß) und einem 5 ml Spitzenregal. (F) Fünf Positionen für 1 ml Spitzen. (G) Zwei temperaturgeregelte Module sind unten positioniert und eine Position zum Parken eines ihrer Deckel auf der Oberseite. (H) Positionen für zwei 50 l verschachtelte Spitzenracks (NTR) in der Spitze, gefolgt von zwei Positionen für Einkanal- und 96-Kanal-Aufnahme von 300 L-Spitzen und einem 5 ml-Spitzengestell an der Unterseite. (I) Ein Stapler für 384-Well-Zählplatten an der Spitze, gefolgt von drei 300 L NTR und einem 5 ml Spitzengestell an der Unterseite. (J) Aufbewahrungs- und Waschstation für drei Sätze von acht wiederverwendbaren Metall-1 ml-Nadeln. (K) Abfallposition für 1 ml und 5 ml Pipettierkanäle und leere NTR (grau) sowie einen Greiferblock für 1 und 5 ml Kanäle (weiß), die für Transportschritte an Deck verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Automatisierte Konfluenzprüfung von hiPSC.(A) Repräsentative Hellfeldbilder (BF) von HiPSC, die vom Zellzytometer (links) aufgenommen wurden, und nach einer automatisierten Konfluenzanalyse (rechts), die die proportionale Fläche angibt, die von Zellen in Grün belegt wird; (B) Konfluenzprozentsätze, die von zwei HiPSC-Linien (iPS #1 und #2) vom 1. bis 6. Tag der Kultur, n = 4 1-Well-Platten pro Zelllinie erfasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Passage von hiPSC.(A) BF-Bild einer hiPSC-Linie, die manuell (links) und mit dem automatisierten Kultursystem (rechts) gewachsen ist. Die Bilder wurden 6 Tage nach der zweiten Passage aufgenommen; (B) Repräsentative Bilder von hiPSC, gefärbt für die Pluripotenzmarker OCT4 und SSEA4, und mit Hoechst 33342 (Nuclei) kontragefärbt; (C) Ergebnisse der qRT-PCR für die Pluripotenzmarker OCT4, NANOG und REX1 in einer hiPSC-Linie, die in Duplikaten (1 und 2) manuell (m) und im automatisierten Kultursystem (a) und den entsprechenden hiPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen (Diff) an Tag 8 (D8) der Differenzierung kultiviert wird. Die Daten werden als relative Menge (RQ) dargestellt, indem iPS_a_1 als Referenzstichprobe verwendet wird. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung (SD) von 3 technischen Replikationen der qRT-PCR-Reaktion dar. GAPDH, RPL13A1 und RPLPO wurden als Haushaltsgene verwendet. Maßstabsleiste: 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Humane iPSC-abgeleitete kortikale Neuronen.(A) Helle Bilder von Tag 6, manuell (m) und automatisiert (a) differenzierte kortikale Neuronen, die ähnliche neuronale Netzwerke zeigen; (B) Repräsentative Bilder von Zellen, die für TUBB3 (Pan neuronal), BRN2 (kortikale Neuronen) und Hoechst 33342 (Kerne) am Tag 8 der Differenzierung gefärbt wurden; (C) Ergebnisse von qRT-PCR für Markergene kortikaler Neuronen (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 und SYN1) angereichert in Tag 8 (D8) der Differenzierung. Die Daten werden als relative Menge (RQ) dargestellt, indem iPS_a_1 als Referenzstichprobe verwendet wird. Fehlerbalken stellen die SD aus 3 technischen Replikationen der qRT-PCR-Reaktion dar. GAPDH, RPL13A1 und RPLPO wurden als Haushaltsgene verwendet. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Ein Sterntest mit hohem Durchsatz auf Neuritenwachstum.(A) Repräsentative Bilder von GFP-Exzesszellen an den Tagen 1, 3 und 11 der Differenzierung; (B) Repräsentative binäre Bilder von Neuriten an den Tagen 1, 3 und 11 der Differenzierung. Das Neuritenwachstum wurde mit der High Content Image Analysis Software 1 quantifiziert und als Neuritenlänge dargestellt; (B) Die Grafik zeigt die Zunahme der Neuritenlänge in NPC-abgeleiteten NGN2-Neuronen und die Bildung eines dichten Netzes. Drei 96-Well-Platten mit Zellen in den inneren 60 Brunnen sind abgebildet. Der Einfachheit halber werden nur drei Säulen von Brunnen pro 96-Well-Platte als Beispiel mit n = 6 Brunnen pro Spalte dargestellt. Pro Brunnen wurden durchschnittlich 1308 Zellen analysiert. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M. dar. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Humane iPSC-abgeleitete mDA-Neuronen.Midbrain DA Neuronen differenziert manuell (m) und im automatisierten (a) Kultursystem. (A, B) Repräsentative fluoreszierende Bilder von mDA-Neuronen, die für Tyrosinhydroxylase (TH, mDA-Neuronenmarker; grün), MAP2 (neuronaler Marker; rot) und Hoechst 33342 (Nuklei; blau) gebeizt werden; (C) Repräsentative qRT-PCR-Ergebnisse für Markergene von mDA-Neuronen, die manuell und im automatisierten Kultursystem differenziert sind. TH- und MAP2-Expressionsstufen werden als relative Menge (RQ) dargestellt, die zu Haushaltsgenen (OAZ1 und GAPDH)normalisiert wird. (D) Prozentsätze der TH- und MAP2-positiven Neuronen, die durch manuelle und automatisierte Differenzierung erzeugt werden. Fehlerbalken stellen die SD zweier unabhängiger Differenzierungen dar, die mit zwei unterschiedlichen iPSC-Linien (#1 und #2) durchgeführt werden. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Zelltyp Zweck Protokollschritt Zelldichte Plattenformat Zellennummer/gut NGN2-Differenzierung iPSC NGN2 stabile Liniengeneration S.2.3. 30.000 Zellen/cm2 12-well 1,17,000 iPSC NGN2-Neuronendifferenzierung 3.1.3. 30.000 Zellen/cm2 1-gut 25,20,000 iPSC NGN2-Neuronendifferenzierung 3.1.3. 30.000 Zellen/cm2 96-well 9,600 smNPC-Generierung smNPC Replating Tag 12 und 16 S5.9. und S5.11. 70.000 Zellen/cm2 6-gut 6,72,000 smNPC Replating aus Durchgang 5 5.11. 50.000 Zellen/cm2 6-gut 4,80,000 smNPC smNPC zu NGN2 Neuronen 3.2.2 50.000 Zellen/cm2 96-well 16,000 mDA-Differenzierung iPSC mDA Neurondifferenzierung 4.1.2. 200.000 Zellen/cm2 1-gut 1,68,00,000 DA-Neuronen Tag 25 Replating 4.3.2. 400.000 Zellen/cm2 1-gut 3,36,00,000 DA-Neuronen Tag 25 Replating 4.5.2. 100.000 Zellen/cm2 96-well 32,000 Beschichtung Zweck Protokollschritt Konzentration/Verdünnung Plattenformat Details der Beschichtung iPS-Kultur Extrazelluläre Matrix iPSC, NGN2 Linie,mDA-Neuronen 1.5.7. und S2.3. 1 aliquote*;25 ml DMEM/F-12 1-/12-gut 8/0,5 ml/well; 1 h bei RT NGN2-Differenzierung Poly-L-Ornithin NGN2-Neuronendifferenzierung 3.1.3. und 3.2.2. 0,1 mg/ml; Pbs 1-/96-gut 8/0,1 ml/gut; 12 h bei 37°C;3x PBS Waschen Laminin NGN2-Neuronendifferenzierung 3.1.3. und 3.2.2. 5 g/ml; Pbs 1-/96-gut 8/0,1 ml/gut; 4 h bei 37°C smNPC-Generierung Extrazelluläre Matrix smNPC-Generierung und -Kultur S5.6., S5.9.,S5.11. 1 aliquote*;25 ml DMEM/F-12 6-gut 1 ml; 2 h bei RT mDA-Differenzierung Extrazelluläre Matrix mDA-Differenzierung 4.1.2. 1 aliquote*;25 ml DMEM/F-12 1-gut 12 ml; 12 h bei 37°C Poly-L-Ornithin mDA-Differenzierung 4.3.2. und 4.5.2. 0,1 mg/ml; Pbs 1-/96-gut 12/0,1 ml/gut;12 h bei 37°C; 3x PBS Waschen Laminin mDA-Differenzierung 4.3.2. und 4.5.2. 10 g/ml; Pbs 1-/96-gut 12/0,1 ml/gut; 12 h bei 37°C Fibronektin mDA-Differenzierung 4.3.2. und 4.5.2. 2 g/ml; Pbs 1-/96-gut 12/0,1 ml/gut; 12 h bei 37°C *Eine extrazelluläre Matrix aliquot ist definiert als der Verdünnungsfaktor (in L), der im Analysezertifikat dieses Produkts enthalten ist. Tabelle 1: Saatzellendichte und Beschichtung entsprechend dem Plattenformat. Tag Reagenz Tag 0 – 1 100 nM LDN193189, 10 m SB431542 Tag 1 – 3 100 nM LDN193189, 10 m SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamin,100ng/mL FGF-8b Tag 3 – 5 100 nM LDN193189, 10 m SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamin,100ng/mL FGF-8b, 3 m CHIR99021 Tag 5 – 7 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamin, 100ng/mLFGF-8b,3 M CHIR99021 Tag 7 – 9 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 m CHIR99021 Tag 9 – 11 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 m CHIR99021 Tag 11 – 13 3 M CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-Ascorbinsäure (AA1), 20 ng/mLGDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 ‘M DAPT Tag 13 – 65 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-Ascorbinsäure (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP,1 ng/mL TGFß3, 10 M DAPT Tabelle 2: Kleine Molekülzugabe zur dopaminergen Neuronendifferenzierung. Tag KSR mittel N2 mittel Differenzierungsmedium Tag 0 – 1 100% 0 0 Tag 1 – 3 100% 0 0 Tag 3 – 5 100% 0 0 Tag 5 – 7 75% 25% 0 Tag 7 – 9 50% 50% 0 Tag 9 – 11 25% 75% 0 Tag 11 – 13 0 0 100% Tag 13 – 65 0 0 100% Tabelle 3: Mediengradient für dopaminerge Neuronendifferenzierung. Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Wir führen ein automatisiertes Zellkultursystem mit integrierten Bildgebungsfunktionen zur Standardisierung der HiPSC-Kultur und neuronalen Differenzierung ein. Aufgrund der minimalen Benutzerintervention ist die experimentelle Variation gering, um die Reproduzierbarkeit zellulärer Phänotypen während der Differenzierung zu gewährleisten. Der kalenderbasierte Scheduler unterstützt die Organisation und Parallelisierung von Experimenten und ermöglicht ein hohes Maß an Flexibilität, zu dem die Experimente durchgeführt werden. Bestehende Methoden können leicht angepasst und das Spektrum der verfügbaren Methoden erweitert werden. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von Assay-Plattenformaten verwendet werden, um die Flexibilität dieses Systems zu erhöhen. Das Minimale System bestehend aus einem CO2-Inkubator, einem Roboterarm, einem Hellfeldzellzytometer und einer Flüssigkeitsbehandlungsstation bildet die Basiseinheit, die für die HiPSC-Kultur und Differenzierung benötigt wird, mit erschwinglichen Kosten für akademische Forschungslabors. Die Kombination des automatisierten Zellkultursystems mit einem automatisierten -20 °C-Speichersystem zur Lagerung von Compounds, RNAi-Bibliotheken oder CRISPR/Cas9-Bibliotheken sowie die Integration eines hochklassigen/hochdurchsatzfähigen Mikroskops ermöglichen die Durchführung von phänotypischen Screenings.

In der aktuellen Studie nutzte das automatisierte Zellkultursystem Einwegspitzen und die Kulturmedien wurden manuell in das Reservoir aufgefüllt, wodurch der Einsatz der Flüssigkeitsabfertigungsstation für Medienveränderungen und andere Kulturprozesse vor allem über Nacht eingeschränkt wurde. Um diese Einschränkung zu umgehen, können die Methoden anstelle von Einwegspitzen an den Nadeleinsatz angepasst werden, und nach der Installation von Rohrverbindungen zwischen Medienleitungen und mediengelagerten Medienbeuteln können Medienbehälter automatisch mit Frischmedien aufgefüllt werden, die mit Heizelementen vorgewärmt werden. Dies würde Benutzerstörungen reduzieren, die durch das manuelle Nachfüllen von Tipps, Kulturmedien und Reservoiraustausch verursacht werden.

Unser automatisiertes Zellkultursystem bietet mehrere Vorteile. Eines davon ist das Barcode-Tracking-System. Die im System geladenen Platten werden durch einen eindeutigen Barcode identifiziert, der vom System gelesen und gespeichert wird, so dass Proben während und nach der Ausführung der Methode nachverfolgt werden können. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, nutzerspezifische Projekte zu erstellen. Hier können im System geladene Kulturplatten einem bestimmten Projekt zugeordnet und in Batches gruppiert werden. Die Strukturierung in Chargen vereinfacht die Ausführung des gleichen Verfahrens auf alle Platten einer bestimmten Charge, da keine einzelnen Platten ausgewählt werden müssen. Zusätzlich ermöglicht ein Flüssigkeitsklassen-Editor die Einstellung der Pipettiergeschwindigkeit und -höhe sowie der Aspirations- und Dosierparameter für jeden Flüssigkeitstransferschritt. Jeder Prozess wird in Protokolldateien dokumentiert, so dass nachverfolgt werden kann, welche Aufgaben für eine bestimmte Kultur oder Assayplatte ausgeführt wurden.

Neuronen und andere Zelltypen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitet werden, sind nützliche In-vitro-Werkzeuge zur Untersuchung der Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen in bestimmten Patientenpopulationen (z. B. dopaminerge Neuronen für Parkinson-Erkrankungen), die die Möglichkeit für personalisierte Arzneimittelscreenings bieten. Das Culturing hiPSC ist sehr zeitintensiv und erfordert geschulte Mitarbeiter, komplexe Differenzierungsprotokolle auszuführen, die in der Regel auf die Produktion in geringem Maßstab beschränkt sind. Wir passten die feederfreie Kultur von hiPSC an eine automatisierte Kultur an und implementierten zwei neuronale Differenzierungsprotokolle, ein schnelles kortikales Neuronendifferenzierungsprotokoll auf Basis der NGN2-Überexpression unter einem Tet-on-Promotor10,11, und ein langfristiges, auf kleinem Molekül basierendes Protokoll zur Erzeugung von mittelhirndopaminergen (mDA) Neuronen13. Die einfache Übertragung und Reproduzierbarkeit manueller Kultur- und Differenzierungsprotokolle macht das automatisierte Kultursystem sehr nützlich. Human es iPSC, das im automatisierten Zellkultursystem kultiviert wurde, zeigte eine konsistente Stammzellmorphologie und exprimierte wichtige Pluripotenzmarker, die zwischen unabhängigen Experimenten reproduzierbar waren. Darüber hinaus begünstigte die Automatisierung des hiPSC-Kulturprotokolls die Kultur und Erweiterung einer größeren Anzahl von Zelllinien parallel. Automatisierte Konfluenzprüfungen, die über Nacht durchgeführt werden sollen, sparen Zeit, so dass das System tagsüber für nachgelagerte Prozessschritte frei bleibt, die im Labor durchgeführt werden (z. B. Ernte von Zellen oder manuelles Replatieren für Differenzierungen). Bei Erreichen des benutzerdefinierten Zusammenflussschwellenwerts werden Zellen durchdrungen und in extrazelluläre Matrix-beschichtete Platten auf dem Stapler des automatisierten Zellkultursystems wieder aufgelegt. Jede Passage runde dauert etwa 70 min und erzeugt vier 1-Well-Platten aus einer Elternplatte, was zu einer Kapazität von 20 Passagen an einem Tag führt.

Die Automatisierung des NGN2-Differenzierungsprotokolls wurde erfolgreich durchgeführt und ermöglichte die Erzeugung einer homogenen Population neuronaler Zellen über verschiedene Passagen hinweg und vergleichbar mit manuellen Differenzierungen. Darüber hinaus würden die experimentellen Kosten für groß angelegte Screening-Studien mit mehreren Zelllinien oder Screening-Experimente mit Tausenden von Testbedingungen/-verbindungen durch schnelle Differenzierungen gesenkt. Kostengünstige und hochdurchsatzhohe Auslesungen einschließlich Live-Zell-Neuriten-Auswuchsmessungen können einfach entwickelt, implementiert und als phäotypische Auslesungen für die Krankheitsmodellierung verwendet werden, wie zuvorgezeigt 14,15,16. So haben wir das NGN2-Protokoll mit kleinen molekülabgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (smNPC) weiter angepasst, die konstitutiv GFP überexprimieren. Die smNPC-Zellen bieten weitere Vorteile, darunter reduzierte Kosten mit Kulturmedien (ein Drittel der Kosten mit iPSC-Kultur) und Zeit, die für die Skalierung von Experimenten benötigt wird. Die Zellausbeute von smNPC ist 7 bis 10 Mal höher als die mit iPSC erhaltenen. Die differenzierenden Neuronen wurden erfolgreich überwacht und mehrere Tage lang mit einem vollautomatischen Bildgebungsverfahren ohne manuelle Antikörperfärbung oder chemische Kennzeichnung abgeglichen, was Kosten und Zeit für manuelle Verfahren, einschließlich der Bildgebung selbst, spart. Die aktuelle Abbildung von inneren 60 Brunnen einer 96-Well-Platte dauert etwa 16 min pro Platte, wenn 25 Felder pro Brunnen abgebildet sind, was bedeutet, dass die Daten für ein bildgebendes Screening für 1000 Verbindungen an einem Tag erfasst und analysiert werden könnten. In Zukunft könnte diese Auslesung in zusammengesetzten Screening-Studien zur Rettung von Neuriten-Auswuchsdefekten verwendet werden.

Darüber hinaus zeigen wir auch die Übertragung eines manuellen Differenzierungsprotokolls zur Erzeugung von mittelhirndopaminergen (mDA) Neuronen aus iPSC. Dieses kleine molekülbasierte Differenzierungsprotokoll dauert 65 Tage und ist arbeitsintensiv wegen der mehrfachen Replatierungsschritte und häufigen Medienveränderungen, meist alle 2 Tage, was die Produktion von mDA-Neuronen auf wenige iPSC-Linien gleichzeitig beschränkt. Das automatisierte mDA-Differenzierungsprotokoll hat den großen Vorteil, dass die Differenzierung auf Dutzende von iPSC-Leitungen skaliert wird. Bis zu 30 Zelllinien könnten parallel unterschieden werden. Da die Differenzierung meist auf Medienveränderungen beruht, kann fast der gesamte Differenzierungsprozess ohne menschliche Eingriffe durchgeführt werden. Mit dem kalenderbasierten Scheduler des automatisierten Systems konnten wir die Medienänderungen entsprechend den Differenzierungsschritten planen. Eine Einschränkung der Arbeit mit einer so großen Anzahl von Zelllinien und Kulturplatten war die Unmöglichkeit, über Nacht Medienwechsel durchzuführen. Der Hauptgrund ist die Tatsache, dass unser System für die Verwendung von Einweg-Tipps und manuelle nachfüllen von Kulturmedien eingerichtet ist, die einen Benutzer im Labor benötigen, um diesen manuellen Schritt auszuführen. Um den Medienwechselprozess zu erleichtern, wurden im System geladene Platten einem Projekt zugeordnet und in Batches gruppiert. Die Chargengröße wurde dann an die Anzahl der Verfügbaren Einwegtipps und das Volumen der Kulturmedien angepasst. Wie bereits erwähnt, kann diese Einschränkung durch die Implementierung von wiederverwendbaren/waschbaren Nadeln und das automatisierte Nachfüllen von Medien leicht überwunden werden. Die automatisierte Passage/Replating von Zellen, wie für iPSC gezeigt, ist einer der Annehmlichkeiten, die unser automatisiertes Zellkultursystem bietet. Wir haben die automatisierte Replatierung von mDA-Neuronen am 25. Tag der Differenzierung getestet. Die Dissoziation von mDA-Neuronen erfordert jedoch eine längere (40 min) Inkubation mit dem Dissoziationsenzym als iPSC (8 min), wodurch der automatisierte Replating-Prozess auf mehr als 1 h pro Zelllinien verlängert wird. Infolgedessen wurde die automatische Replatierung von 30 Zelllinien am selben Tag unmöglich. Die Beschleunigung anderer Schritte beim automatisierten Replatieren (Transport von Platten, Pipettierung) und Anpassung des Systems an den Einsatz von Nadeln und Medienlinie, die eine Nachtarbeit ermöglicht, würde diese Einschränkung beheben. Trotz der Nachteile konnten wir das manuelle Protokoll erfolgreich auf eine automatisierte Differenzierung von mDA-Neuronen übertragen, die Kulturen mit erheblichen Mengen an MAP2 (Neuron) und TH (mDA Neuronen) positiven Zellen produzieren.

Die parallele Differenzierung Dutzender iPSC-Zelllinien ist von großem Interesse in Projekten, die die molekularen Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit, untersuchen. Es ist jedoch eine große Herausforderung, Aufgaben schneller mit weniger Fehlern und geringeren Kosten zu erledigen. Durch die Automatisierung der hier vorgestellten Protokolle (iPSC, smNPC und mDA neuron) konnten wir die Reproduzierbarkeit in unseren Projekten beschleunigen, reduzieren und die Reproduzierbarkeit erhöhen. Die Entwicklung von Projekten wie FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) mit Hunderten von Patientenzelllinien zeigt den Bedarf an automatisierten Kultur- und Differenzierungsprotokollen. Zu unseren Zukunftsperspektiven gehört die Übertragung manueller dreidimensionaler (3D) Zellkulturmodelle auf das automatisierte System. Geringfügige Anpassungen in den Plattendefinitionseinstellungen und die Verwendung von Adaptern ermöglichen die Verwendung von kommerziellen oder kundenspezifischen Platten und mikrofluidischen Kammern, die für die 3D-Kulturen erforderlich sind. Darüber hinaus wird die Implementierung eines automatisierten etikettenfreien Bildgebungsmodells es uns ermöglichen, das neuronale Wachstum in Echtzeit zu verfolgen und Veränderungen des Neuritenauswüchses, der Neuronenorganisation und des Zelltodes in ein besseres Verständnis der Krankheitsmechanismen zu übersetzen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen die Patienten und ihre Familien, die Biomaterial für diese Studie beigesteuert haben. Die in der Studie verwendeten Zelllinien stammten aus der NINDS-Sammlung mit Rutgers (ND41865 als iPS-Nr.) und dem Labor von Dr. Tilo Kunath (iPS-2). Diese Arbeit wird zum Teil von der NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, einem Gemeinsamen EU-Programm – Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); Die Initiative DZNE I2A (AD); PD-Strat, ein von ERA-Net ERACoSysMed gefördertes Projekt (PH) und die Foundational Data Initiative for Parkinson es Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD ist Teil des PATH to PD-Programms der Michael J. Fox Foundation. Die Autoren danken Steven Finkbeiner und Melanie Cobb (Gladstone Institutes) für ihren Beitrag zur Einrichtung des manuellen mDA Neuron Differenzierungsprotokolls und Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) für die Unterstützung bei der Einrichtung der Neuriten-Auswuchsanalyse.

Materials

Antibodies Distributor Catalog Number Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4 Abcam ab16287 1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4 Abcam ab19857 1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3 R & D MAB1195 1 to 500
Rabbit anti-BRN2 NEB 12137 1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH Pel-Freez Biologicals 12137 1 to 750
Mouse anti-MAP2 Santa Cruz sc-74421 1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11039 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342 Invitrogen H3570 1 to 8,000
Instruments Distributor Catalog Number Description/Application
Agilent TapeStation system Agilent technologies 4200 Automated electrophoresis
for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system Hamilton Storage
Technologies		 Sample Access Manager
(SAM -20C, 3200 series)		 Storage of reagents
Barcode reader Honeywell Barcode Reader Orbit Barcode scanner
Brightfield cell cytomat Nexcelom Celigo Confluence check and
cell counting
CellVoyager 7000 Yokogawa CellVoyager 7000 Automated confocal
microscope
Cytomat for cell cultures Thermo Fisher Scientific Cytomat 24 C, CU 12 stackers pitch 28 mm,
12 stackers pitch 23 mm
(total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples Thermo Fisher Scientific Cytomat 2-LIN, 60 DU
(Drying Unit)		 2 stackers pitch 28 mm
(total of 42 plates)
HEPA filters Hamilton Robotics Hood Flow Star UV Modified by Hamilton
Robotics
Liquid handling station Hamilton Robotics Microlab Star Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml
and 96 Channel MPH
Media reservoir Hamilton Robotics 188211APE Media/reagents reservoir
Pure water system Veolia Water ELGA PURELAB Classic Provides pure water for
needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time
PCR System		 Thermo Fisher Scientific QSTUDIO12KOA Real-time PCR machine
Robotic arm Hamilton Robotics Rackrunner Transport of plates
Turn table Hamilton Robotics Turn Table Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply APC Smart UPS RT Unit,
10000 VA Power supply		 Backup power supply
VIAFLO-pipettes Integra 4500 Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4453545 Real-time PCR machine
Materials Distributor Catalog Number Notes
1-well culture plate (84 cm2) Thermo Fischer Scientific 165218 Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2) Greiner Bio-One 657160 TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2) Greiner Bio-One 665180 TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2) Perkin Elmer 6005558 CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL Hamilton Robotics 235987 50-uL tips
Tips, 300-µL Hamilton Robotics 235985 300-µL tips
Tips, 1000-µL Hamilton Robotics 235939 1000-µL tips
Tips, 5-mL Hamilton Robotics 184022 5-mL tips
Tubes, 15-mL Greiner Bio-One 188271 15-mL tubes
Tubes, 50-mL Greiner Bio-One 227261 50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials Sigma Aldrich V5007 Cryovials
Plasmids Distributor Catalog Number Notes
pLV_hEF1a_rtTA3 Addgene 61472 Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro Addgene 61474 Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus Takara Bio 631983
Primers Sequence (forward) Sequence (reverse) Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1) CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3) CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1) AGAAACGGGCAAAGACAAGAC GCTGACAGGTTCTATTTCCGC PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1) CTCAGCACCGCTAACAGAGG CATTGGCGCTTCGGACAAG PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1) CGGCGGATCAAACTGGGATTT TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2) CGAGACCTCCACACTTCGTG TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3) TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC CTCACAGCGATAAGTGCCCTC PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) TGCTCAGCAGTACAACGTACC GACACTTGCGATGTCCTGGAA PrimerBank
mDA neurons
TH CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA NCBI primer-BLAST
MAP2 GGATCAACGGAGAGCTGAC TCAGGACTGCTACAGCCTCA NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG GAGCCCCAGCCTTCTCCATG NCBI primer-BLAST
OAZ1 AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT ATGAAGACATGGTCGGCTCG NCBI primer-BLAST
RPLPO CCTCATATCCGGGGGAATGTG GCAGCAGCTGGCACCTTATTG NCBI primer-BLAST
RPL13A GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC NCBI primer-BLAST
Media and Reagents Distributor Catalog Number Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel) Corning 354277 10 μg/mL
Fibronectin Corning 356008 2 μg/mL
Laminin Sigma L2020 5 – 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma P3655 0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium
(Essential 8 Flex medium)		 Gibco A2858501
NGN2 neurons – NGN2 medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.909 mL (50 µM)
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX Gibco 31331093 484.75 mL
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL ( 2 mM)
Insulin Sigma I9278 0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (0.5%)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (0.5%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
mDA neurons – SRM medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12 Gibco 12660012 409.5 mL
Knockout serum replacement
(serum replacement)		 Gibco 10828028 75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
mDA neurons – N2 medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (1%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 475 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL(1%)
mDA neurons – Differentiation medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
NGN2 neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 2 μM
Doxycyline (dox) Sigma D9891 2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate
magnesium (AA2)		 Sigma A8960 64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3) Peprotech 450-10 10 ng/mL
Purmorphamine (PMA) Cayman 10009634 0.5 μM
Puromycin Sigma P8833-10MG 0.5 μg/mL
Thiazovivin Merk Millipore 420220-10MG 2 μM
mDA neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 3 μM
DAPT Cayman 13197 10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) Sigma D0627 1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) Peprotech 100-25 100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1) Sigma A4403 0.2 mM
LDN193189 (LDN) Cayman 11802 100 nM
Purmorphamine (Purm) Cayman 10009634 2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II)
N-Terminus (SHH)		 R&D 1845-SH 100 ng/mL
SB431542 (SB) Cayman 13031 10 μM
Transforming Growth Factor type ß3
(TGFß3)		 R&D 243-B3 1 ng/mL
Y-27632 Cayman 10005583 10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent
(StemPro Accutase)		 Gibco A1110501 1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Gibco 11575020 0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit Qiagen 74106 Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer Thermo Fisher Scientific 15596018 Trizol lysis buffer (RNA
lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit) Thermo Fisher Scientific 18080-085 SuperScript III Reverse
Transcriptase
Software Company Catalog Number Description/Application
Cell Culture Framework (CCF)
(Graphical user interface, GUI)		 Hamilton Robotics Custom-made User interface for the automated system
CellPathFinder software
(image analysis software 1)		 Yokogawa CellPathfinder HCS Software Image analysis tool
CellVoyager Measurement System Yokogawa Included with
CellVoyager 7000		 Microscope controlling
software
Columbus software
(image analysis software 2)		 Perkin Elmer Columbus Image analysis tool
Cloud based qPCR app Thermo Fisher Scientific Themo Fisher cloud Analysis software for
qRT-PCR data
Venus software Hamilton Robotics VENUS Two Dynamic
Schedular 5.1 Software		 Controlling software for the
automated system
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References

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Dhingra, A., Täger, J., Bressan, E., Rodriguez-Nieto, S., Bedi, M., Bröer, S., Sadikoglou, E., Fernandes, N., Castillo-Lizardo, M., Rizzu, P., Heutink, P. Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring. J. Vis. Exp. (162), e61525, doi:10.3791/61525 (2020).
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