Production automatisée de neurones corticals et dopaminergiques pluripotents induits par l’homme avec surveillance intégrée des cellules vivantes
Summary
Nous montrons l’automatisation des cultures de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HIPSC) et des différenciations neuronales compatibles avec l’imagerie et l’analyse automatisées.
Abstract
Les protocoles manuels de culture et de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HIPSC) sont difficiles à normaliser, présentent une grande variabilité et sont sujets à une différenciation spontanée en types de cellules indésirables. Les méthodes sont à forte intensité de main-d’œuvre et ne sont pas facilement accessibles à des expériences à grande échelle. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un système automatisé de culture cellulaire couplé à un système d’imagerie à haut débit et mis en œuvre des protocoles pour maintenir plusieurs lignes hiPSC en différenciation parallèle et neuronale. Nous décrivons l’automatisation d’un protocole de différenciation à court terme utilisant neurogenin-2 (NGN2) sur-expression pour produire des neurones corticals hiPSC dérivés dans les 6\u20128 jours, et la mise en œuvre d’un protocole de différenciation à long terme pour générer hiPSC dérivés midbrain dopaminergic (mDA) neurones dans les 65 jours. En outre, nous avons appliqué l’approche NGN2 à une petite molécule dérivée des cellules précurseurs neurales (smNPC) transduced avec le lentivirus GFP et a établi un essai automatisé de la prolifération des neurites à cellules vivantes. Nous présentons un système automatisé avec des protocoles adaptés à la culture hiPSC de routine et la différenciation en neurones corticals et dopaminergiques. Notre plate-forme convient à la culture mains libres à long terme et aux produits composés à base de hiPSC à haute teneur/à haut débit, aux dépistages RNAi et CRISPR/Cas9 afin d’identifier de nouveaux mécanismes de la maladie et de nouvelles cibles médicamenteuses.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) s’auto-renouvellent et peuvent se différencier dans presque n’importe quel type de cellule adulte. Ces caractéristiques font de hiPSC un outil utile pour la modélisation des maladies dans la recherche fondamentale et la découverte demédicaments 1. L’iPSC humain conserve l’arrière-plan génétique du donneur qui permet de dériver des types de cellules pertinentes à la maladie qui sont les plus affectés/impliqués dans le cours de la maladie, par exemple, différents sous-types neuronaux pour les maladies neurodégénératives2,3. En outre, hiPSC surmonte certaines des limitations des modèles animaux et cellulaires de sur-expression en modelant des maladies dans un contexte humain et des niveaux physiologiques d’expression de protéine, et se sont avérés être un atout précieux dans la modélisation des maladies allant des désordres monogéniques, complexes et épigénétiques aussi bien que des maladies de tard-début4.
Malgré ces avantages et ces possibilités, plusieurs limites de hiPSC doivent encore être abordées. Les protocoles actuels de culture et de différenciation hiPSC ne sont pas rentables, difficiles à normaliser et demandent beaucoup de main-d’œuvre. Les étapes de culture manuelle peuvent entraîner une grande variabilité des rendements et des phénotypes en raison de différences de croissance et de différenciation spontanée du hiPSC. Par conséquent, la variation dépendante des expérimentateurs doit être réduite en mettant en œuvre des techniques de manipulation plus normalisées et en simplifiant les protocoles qui peuvent être réalisés à l’aide del’automatisation 5. L’établissement de protocoles automatisés de culture et de différenciation hiPSC établira des normes communes pour les projets de recherche universitaire et industrielle, et permettra la génération de modèles de maladies biologiquement pertinents et de résultats plus reproductibles.
Des travaux antérieurs ont tenté d’automatiser les cultures hiPSC6,7,8, mais leurs protocoles ont été limités à des formats spécifiques de plaques de culture cellulaire dépendant du système et manquant d’adaptabilité aux différents formats d’analyse. Ces systèmes sont utiles dans le gonflement des cellules, mais peuvent ne pas convenir à la différenciation automatisée dans les types de cellules désirées, phénotypage de la maladie, et les fins de dépistage. En outre, une plate-forme automatisée à grande échelle pour la dérivation du fibroblaste, la génération hiPSC et la différenciation aété décrite 9, mais à une échelle qui ne peut être atteinte que par des laboratoires à haut débit dédiés à la production de lignes qui semble attrayant, mais peut être inabordable pour de nombreux laboratoires universitaires.
Nous avons développé un système de culture cellulaire entièrement automatisé basé sur une station de manutention liquide dans un environnement filtré par air particulaire à haut rendement (HEPA) en conjonction avec un incubateur de CO2 de grande capacité, un cytomètre d’imagerie à champ lumineux et un bras robotique pour le transport des plaques. Ces composants fournissent la base d’une culture et d’une différenciation hiPSC stables et reproductibles. Nous avons complété le système avec un système automatisé de stockage de -20 °C pour le stockage composé ou virus et un imageur confocal à cellules vivantes à disque de filature à grande vitesse. Des protocoles personnalisés ont été générés permettant l’ensemencement automatisé des cellules, les changements de médias, les vérifications des confluences, l’expansion cellulaire et la production de plaques d’analyse avec le traitement de l’échantillon et l’imagerie des plaques, ce qui rend le système compatible avec les criblages à haute teneur/à haut débit. Le système automatisé de culture cellulaire et d’imagerie est exploité à l’aide du logiciel de contrôle et de l’interface utilisateur graphique (GUI) sur mesure. L’interface graphique permet aux utilisateurs d’importer des fichiers CSV contenant des paramètres spécifiques à la ligne cellulaire nécessaires à l’exécution de la méthode. En outre, l’interface graphique permet de planifier de nombreuses expériences dans n’importe quelle séquence en utilisant la vue de calendrier intégrée permettant ainsi le plein contrôle de l’heure à partir de chaque méthode.
Notre système automatisé de culture cellulaire utilise des vitesses normalisées de pipetage, des temps de passage, des seuils de confluence, des densités d’ensemencement et des volumes moyens avec la souplesse nécessaire pour la culture des cellules dans une variété de formats de plaques (format de plaques de 96, 48, 24, 12, 6 ou 1 puits). Nous avons adapté un protocole de différenciation à court terme récemment publié pour convertir hiPSC en neurones qui peuvent produire tubb3 neurones positifs en 6jours 10,11. Nous avons également établi la différenciation automatisée et l’imagerie des cellules précurseurs neuronales de petites molécules (smNPC) en neurones exprimant constitutivement GFP sous le promoteur EF1a12 et iPSC dans les neurones dopaminergiques midbrain (mDA), en adaptant un protocole d’inhibition dual-SMADprécédemment publié 13 qui donne des neurones mDA dans les 65 jours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous introduisons un système automatisé de culture cellulaire avec des capacités d’imagerie intégrées pour la normalisation de la culture hiPSC et la différenciation neuronale. En raison de l’intervention minimale de l’utilisateur, la variation expérimentale est faible assurant la reproductibilité des phénotypes cellulaires pendant la différenciation. Le calendrier prend en charge l’organisation et la parallélisation des expériences et permet un haut degré de flexibilité au moment où les expériences sont menées. Les méthodes existantes peuvent être facilement adaptées et le spectre des méthodes disponibles peut être augmenté. En outre, un grand nombre de formats de plaques d’essai peuvent être utilisés ajoutant à la flexibilité de ce système. Le système minimal composé d’un incubateur de CO2, d’un bras robotique, d’un cytomètre à cellules brillantes et d’une station de manutention liquide constitue l’unité de base nécessaire à la culture et à la différenciation hiPSC, avec des coûts abordables pour les laboratoires de recherche universitaires. La combinaison du système automatisé de culture cellulaire avec un système de stockage automatisé de -20 °C pour le stockage des composés, des bibliothèques RNAi ou des bibliothèques CRISPR/Cas9, et l’intégration d’un microscope à haute teneur/à haut débit permettent l’exécution de criblages phénotypiques.
Dans l’étude actuelle, le système automatisé de culture cellulaire utilisait des conseils jetables et les supports culturels étaient remplis manuellement dans le réservoir, limitant ainsi l’utilisation de la station de manutention liquide pour les changements de médias et d’autres processus culturels, surtout du jour au lendemain. Pour contourner cette limitation, les méthodes peuvent être ajustées à l’utilisation d’aiguilles au lieu de conseils jetables et, après avoir installé des connexions de tube entre les lignes de médias et les sacs multimédias stockés dans un réfrigérateur, les réservoirs de médias peuvent être remplis automatiquement avec des supports frais préchauffés par des éléments chauffants. Cela réduirait les interférences des utilisateurs causées par le remplissage manuel des pourboires, des médias culturels et des échanges de réservoirs.
Notre système automatisé de culture cellulaire offre plusieurs avantages. L’un est le système de suivi des codes à barres. Les plaques chargées dans le système sont identifiées par un code à barres unique qui est lu et enregistré par le système permettant le suivi des échantillons pendant et après l’exécution de la méthode. Un autre avantage est la possibilité de créer des projets spécifiques à l’utilisateur. Ici, les plaques de culture chargées dans le système peuvent être attribuées à un projet spécifique et regroupées en lots. La structuration en lots simplifie l’exécution de la même procédure à toutes les plaques d’un certain lot puisqu’aucune plaque individuelle n’a besoin d’être sélectionnée. En outre, un éditeur de classe liquide permet d’ajuster la vitesse et la hauteur de pipetage ainsi que les paramètres d’aspiration et de distribution pour chaque étape de transfert liquide. Chaque processus est documenté dans des fichiers journaux permettant de retracer les tâches qui ont été exécutées pour une culture ou une plaque d’analyse donnée.
Les neurones et autres types de cellules dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HIPSC) sont des outils in vitro utiles pour étudier les mécanismes des maladies neurodégénératives dans des populations de patients spécifiques (p. ex. neurones dopaminergiques pour la maladie de Parkinson) offrant la possibilité de dépistages personnalisés des médicaments. La culture hiPSC est très intensive en temps et exige des personnes formées pour exécuter des protocoles de différenciation complexes, généralement limités à la production à basse échelle. Nous avons adapté la culture sans mangeoire de hiPSC à une culture automatisée et mis en œuvre deux protocoles de différenciation neuronale, un protocole rapide de différenciation corticale des neurones basé sur la surexsation NGN2 sous un promoteur tet-on10,11, et un protocole à long terme à base de petites molécules pour la génération de neurones dopaminergiques midbrain (mDA)13. Le transfert simple et la reproductibilité des protocoles de culture manuelle et de différenciation rendent le système de culture automatisé très utile. L’iPSC humain cultivé dans le système automatisé de culture cellulaire a montré la morphologie cohérente de cellules souches et a exprimé les marqueurs importants de pluripotence, reproductibles entre les expériences indépendantes. En outre, l’automatisation du protocole de culture hiPSC a favorisé la culture et l’expansion d’un plus grand nombre de lignées cellulaires en parallèle. Les vérifications automatisées de la confluence qui devraient être effectuées pendant la nuit ont permis de libérer le système pendant la journée des étapes de processus en aval effectuées lorsque l’utilisateur se trouvait en laboratoire (p. ex., la récolte de cellules ou le replacage manuel pour les différenciations). En atteignant le seuil de confluence défini par l’utilisateur, les cellules sont passages et replacés dans des plaques extracellulaires recouvertes de matrice disponibles sur l’empileur du système automatisé de culture cellulaire. Chaque tour de passage prend environ 70 min et génère quatre plaques d’un puits à partir d’une plaque parente, ce qui se traduit par une capacité de 20 passages par jour.
L’automatisation du protocole de différenciation NGN2 a été effectuée avec succès et a permis la génération d’une population homogène de cellules neuronales à travers différents passages et comparables à des différenciations manuelles. De plus, les coûts expérimentaux des études de dépistage à grande échelle impliquant plusieurs lignées cellulaires ou des expériences de dépistage avec des milliers de conditions/composés d’essai seraient réduits en raison de différenciations rapides. Les readouts rentables et à haut débit, y compris les mesures de la prolifération des neurites à cellules vivantes, peuvent être facilement développés, implémentés et utilisés comme lectures phénotypiques pour la modélisation des maladies, commeindiqué précédemment 14,15,16. Ainsi, nous avons en outre adapté le protocole NGN2 à l’aide de petites molécules dérivées de cellules précurseurs neuronaux (SMNPC) qui constituent constitutivement sur-exprimer GFP. Les cellules smNPC offrent d’autres avantages, y compris la réduction des coûts avec les médias culturels (un tiers du coût avec la culture iPSC) et le temps nécessaire pour intensifier les expériences. Les rendements cellulaires de smNPC sont 7 à 10 fois plus élevés que ceux obtenus avec l’iPSC. Les neurones différeciants ont été surveillés et photographiés avec succès pendant plusieurs jours à l’aide d’un processus d’imagerie entièrement automatisé sans avoir besoin de colorants manuels d’anticorps ou d’étiquetage chimique, ce qui a permis d’économiser les coûts et le temps requis pour les procédures manuelles, y compris l’imagerie par elle-même. L’imagerie actuelle des 60 puits intérieurs d’une plaque de 96 puits prend environ 16 min par plaque lorsque 25 champs par puits sont photographiés, ce qui signifie que les données d’un dépistage à base d’imagerie pour 1000 composés, pourraient être acquises et analysées en une journée. À l’avenir, cette lecture pourrait être utilisée dans des études de dépistage composé pour le sauvetage des défauts de l’excroissance neurite.
En outre, nous démontrons également le transfert d’un protocole manuel de différenciation pour générer des neurones dopaminergiques midbrain (mDA) de l’iPSC. Ce petit protocole de différenciation à base de molécules prend 65 jours et est à forte intensité de main-d’œuvre en raison des multiples étapes de replacage et des changements fréquents des médias, la plupart du temps tous les 2 jours, ce qui limite la production de neurones mDA à quelques lignes iPSC en même temps. Le protocole automatisé de différenciation mDA a le grand avantage d’intensifier la différenciation à des dizaines de lignes iPSC. Jusqu’à 30 lignées cellulaires pourraient être différenciées en parallèle. Puisque la différenciation est principalement basée sur des changements de médias, presque tout le processus de différenciation peut être mené sans interférence humaine. En utilisant le calendrier du système automatisé, nous pourrions planifier les changements de médias en fonction des étapes de différenciation. L’une des limites du travail avec un si grand nombre de lignées cellulaires et de plaques de culture était l’impossibilité d’effectuer des changements médiatiques du jour au lendemain. La raison principale est le fait que notre système est mis en place pour l’utilisation de conseils jetables et le remplissage manuel des supports culturels nécessitant un utilisateur dans le laboratoire pour exécuter cette étape manuelle. Pour faciliter le processus de changement des médias, les plaques chargées dans le système ont été assignées à un projet et regroupées en lots. La taille du lot a ensuite été adaptée au nombre de pourboires jetables et au volume de supports culturels disponibles. Comme nous l’avons vu plus haut, cette limitation peut être facilement surmontée par la mise en œuvre d’aiguilles réutilisables/lavables et le remplissage automatisé des supports. Le passage/replacage automatisé des cellules, comme le montre l’iPSC, est l’une des commodités offertes par notre système automatisé de culture cellulaire. Nous avons testé le replaquement automatisé des neurones mDA le jour 25 de la différenciation. Cependant, la dissociation des neurones mDA nécessite une incubation plus longue (40 min) avec l’enzyme de dissociation que l’iPSC (8 min) prolongeant le processus de replacage automatisé à plus de 1 h par lignée cellulaire. En conséquence, le replacage automatisé de 30 lignes cellulaires dans la même journée est devenu impossible. Accélérer d’autres étapes lors du replacage automatisé (transport des plaques, pipetage) et adapter le système à l’utilisation d’aiguilles et de lignes multimédias qui rendent possible un travail de nuit permettrait de résoudre cette limitation. Malgré les inconvénients, nous pourrions réussir à transférer le protocole manuel à une différenciation automatisée des neurones mDA produisant des cultures avec des quantités substantielles de CELLULES MAP2 (neurones) et TH (neurones mDA).
La différenciation de dizaines de lignées cellulaires iPSC en parallèle est d’un grand intérêt pour les projets qui étudient les mécanismes moléculaires des maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson. Toutefois, accomplir des tâches plus rapidement avec moins d’erreurs et à des coûts réduits est un grand défi. Grâce à l’automatisation des protocoles présentés ici (iPSC, smNPC et mDA neurone), nous pourrions accélérer, réduire les coûts et augmenter la reproductibilité dans nos projets. Le développement de projets comme FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) impliquant des centaines de lignées cellulaires de patients montre la nécessité d’une culture automatisée et de protocoles de différenciation. Nos perspectives futures incluent le transfert de modèles manuels de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) au système automatisé. Des adaptations mineures dans les paramètres de définition des plaques et l’utilisation d’adaptateurs permettront l’utilisation de plaques commerciales ou sur mesure et de chambres microfluidiques requises pour les cultures 3D. De plus, la mise en œuvre d’un modèle automatisé d’imagerie sans étiquette nous permettra de suivre la croissance neuronale en temps réel et de traduire les changements dans l’excroissance des neurites, l’organisation des neurones et la mort cellulaire en une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les patients et leurs familles qui ont contribué au biomatériau pour cette étude. Les lignées de cellules utilisées dans l’étude proviennent de la collection NINDS avec Rutgers (ND41865 sous le nom d’iPS#1) et du laboratoire du Dr Tilo Kunath (iPS#2). Ces travaux sont soutenus en partie par la Fondation NOMIS (PH), RiMod-FTD, un programme conjoint de l’UE – Recherche sur les maladies neurodégénératives (JPND) (PH); L’initiative DZNE I2A (AD); PD-Strat, un projet financé par ERA-Net ERACoSysMed (PH) et la Foundational Data Initiative for Parkinson’s Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD fait partie du programme PATH to de la Fondation Michael J. Fox. Les auteurs remercient Steven Finkbeiner et Melanie Cobb (Gladstone Institutes) d’avoir contribué à la mise en place du protocole manuel de différenciation des neurones mDA et Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) pour son aide dans la configuration de l’analyse de la croissance des neurites.
Materials
| Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
| iPSC pluripotency marker | |||
| Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
| Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
| NGN2 neuron markers | |||
| Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
| Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
| mDA neuron markers | |||
| Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
| Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
| Nuclei counterstaining | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
| Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
| Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
| Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
| Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
| Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
| Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
| Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
| HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
| Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
| Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
| Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
| QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
| Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
| Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
| Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
| VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
| Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
| 1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| 6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
| 12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
| 96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
| Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
| Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
| Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
| Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
| Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
| Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
| Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
| Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
| Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
| iPSC pluripotency | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
| NGN2 neurons | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurons | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
| Housekeeping genes | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
| Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
| Coating matrix | |||
| Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
| Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 – 10 μg/mL |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
| Culture media | |||
| iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
| NGN2 neurons – NGN2 medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
| Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurons – SRM medium | |||
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
| Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| mDA neurons – N2 medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
| mDA neurons – Differentiation medium | |||
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
| NGN2 neurons – Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
| Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
| Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
| Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
| mDA neurons – Supplements | |||
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
| DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
| Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
| L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
| Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
| SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
| Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
| Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
| Dissociation reagents | |||
| Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
| RNA isolation and cDNA kit | |||
| RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
| Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
| Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
| Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
| CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
| CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
| Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
| Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
| Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |
References
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- Payne, N. L., Sylvain, A., O’Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
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