Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi
Summary
Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster’ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Biyomedikal görüntüleme araçları, genlerden organizmalara kadar mekansal ölçeklerde moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin vermektedir. İyi karakterize edilmiş bir model organizma olan Drosophila melanogaster, hücre ve doku düzeyinde gen fonksiyonunu anlamak için ışık ve elektron mikroskopisi kullanımından yararlanmıştır. Tüm bozulmamış organizma düzeyinde gen fonksiyonunun anlaşılmasını sağlayan görüntüleme platformlarının uygulanması, genetik mekanizmalar hakkındaki bilgimizi daha da artıracaktır. Burada, mikro bilgisayarlı tomografi (μ-BT) kullanarak Drosophila’yı herhangi bir gelişim aşamasında görselleştirmek için gereken adımları özetleyen bir hayvan görüntüleme yöntemi sunulmaktadır. μ-CT’nin avantajları arasında, doku diseksiyonu veya temizleme yöntemlerine gerek kalmadan mikron düzeyinde çözünürlükte doğru 3D bilgi üretmek için piyasada bulunan enstrümantasyon ve minimum uygulamalı zaman bulunur. Görüntü analizi ve 3D işlemeyi hızlandıran yazılımlarla eşleştirilmiş, hem tanımlayıcı hem de hipotez test çalışmaları için gelişim, fizyoloji ve anatomi mekanizmalarını daha iyi anlamak için herhangi bir doku veya organ sisteminin ayrıntılı morfometrik analizi yapılabilir. Elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi ve μ-CT kullanımını içeren bir görüntüleme iş akışı kullanılarak, gen fonksiyonunun kapsamlı bir değerlendirmesi yapılabilir, böylece bu güçlü model organizmanın yararlılığı daha da arttırılabilir.
Introduction
Bir nesnenin iç yapılarının genel 3D mimarisini tahrip etmeden ayrıntılı olarak araştırılmasına izin veren görüntüleme yöntemlerinin fizik, mühendislik, malzeme bilimi, arkeoloji, paleontoloji, jeoloji ve biyoloji 1 ,2,3, 4 ,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere bir dizi farklı disipline yaygın olarak yararlı olduğukanıtlanmıştır. . Bu tahribatsız görüntüleme yöntemleri arasında, X-ışını tabanlı platformlar, özellikle yüksek enerjili X ışınlarının görünür ışık dalgalarına kıyasla çok farklı numune türlerine ve malzemelere minimum saçılma ile nüfuz edebilmesi nedeniyle yararlıdır. Bilgisayarlı Tomografi (BT), Mikro bilgisayarlı Tomografi (μ-CT), Nanocomputed Tomografi (Nano-CT) ve Synchrotron Mikrotomografisi, milimetreden mikrona kadar değişen örneklerin X-ışını tabanlı görüntüleme için birincil teknolojiler olarak ortaya çıkmıştır, milimetre ila mikron altı çözünürlük yetenekleri10,11,12,13,14.
Bu platformlar, numune boyutunu ve çözünürlüğünü dengelemek için tasarımlarında, X-ışını geometrilerinde ve bileşenlerinde farklılık gösterse de, hepsi görüntü yakalama için aynı temel ilkeye dayanır: nesnenin içinden geçen ve bir dedektör tarafından yakalanan bir X-ışın kaynağı. Nesne içindeki farklı yoğunluklardan geçerken X-ışını ışınının diferansiyel zayıflaması görüntü kontrastı oluşturur. 3B veriler, numune veya dedektör döndürülerek, daha sonra algoritmalar kullanılarak yeniden yapılandırılan bir dizi 2B projeksiyon görüntüsü toplanarak x,y,z15’teçözünürlüğü izotropik olan 3B bilgileri içeren tomogramlara toplanır. Görüntülenmekte olan nesneye X ışınları yansıtmak için koni ışını X-ışını geometrisi kullanan birçok tezgah üstü μ-CT tarayıcı için, Feldkamp algoritması nesneyi en az hatayla doğru bir şekilde yeniden oluşturmak için kullanılır16.
Belirli bir platformun çözünürlüğü öncelikle X-ışını ışınının boyutu (spot boyutu), tarayıcı geometrisi (nesneden X-ışını kaynağına uzaklık), dedektördeki piksellerin boyutu ve kullanılan yeniden yapılandırma algoritması gibi sistem parametrelerine göre belirlenir. Tarayıcı titreşimleri, X-ışını ışını dalgalanmaları, numune hareketi ve malzeme tipi veya nesneyi görselleştirmek için kullanılan kimyasal leke gibi ek faktörler de gerçek dünya görüntüleme çeşnileri altında mekansal çözünürlüğü önemli ölçüde etkileyebilir15.
Biyomedikal uygulamalar için BT ve μ-CT anatomi, fizyoloji, gelişim ve hastalık mekanizmaları anlayışımızı geliştirmede kilit rol oynamış, hem insan hasta tanıları için bir araç hem de model organizmalar için preklinik görüntüleme platformu olarak hizmet vermektedir17,18. Örneğin, amacı fare genomundaki her genin işlevini tanımlamak olan Mouse International Phenotyping Konsorsiyumu, fenotipleme boru hattı19’unbir parçası olarak μ-CT kullanır. Sonuçları, gelişim ve hastalık süreçlerinde yer alan genleri anlamak için kritik öneme sahipken, fare anatomisi ve gelişimi için bir atlas görevi degörür 20. Zebra balıkları ve sıçanlar gibi diğer model organizmalar da, bir dizi gen mutantının tüm hayvan fenotiplemesini gerçekleştirmek için μ-CT kullanımını tamamen benimsemiş17,21,22,23.
Tüm hayvan görüntülemeyi model organizmalarla birleştirmenin avantajı, belirli bir biyolojik süreç için gen fonksiyonunun mekanistik bir anlayışının tam olarak araştırılabilmesidir. Bu, iyi karakterize edilmiş genomlar ve farklı gelişimsel zaman noktalarında, belirli dokularda, bireysel hücrelerde ve hatta hücre altı organellerde gen fonksiyonunun hassas bir şekilde manipüle olmasına izin veren model organizmalarda bulunan birçok genetik araç nedeniyle mümkündür. Bunlar UAS/GAL4 sistemi (ve birçok türevi), CRISPR/Cas9 ve RNAi24 , 25,26gibi ikili ifade sistemlerini içerir. Bu genetik araçlar elektron mikroskopisi, ışık mikroskopisi (floresan ve floresan olmayan) ve μ-CT gibi tüm hayvan görüntülemeden oluşan güçlü bir görüntüleme boru hattı ile birlikte kullanıldığında, moleküllerin, hücrelerin, dokuların, organların ve tüm organizmanın kapsamlı bir değerlendirmesi elde edilebilir ve bu da gen fonksiyonunun çok daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Bu protokol, sayısız genetik aracı çok sayıda moleküler mekanizmanın aydınlatılmasına yardımcı olan memeli olmayan model organizma Drosophila melanogaster’da μ-CT kullanımına odaklanmaktadır26,27. Model olmayan böcekler1 , 28 ,29,30,31,32‘deki önceki protokollerden benimsendi ve bu hayvanda kullanımı için standartlaştırılmış bir protokol oluşturmak için Drosophila’daki önceki μ-CT çalışmalarından yola çıktı33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Ticari olarak kullanılabilen tarayıcılar kullanılarak fly μ-CT veri kümelerinin başarılı bir şekilde numune hazırlanması, görüntülenmesi ve analizi için adımlar özetlenmiştir. Bu protokol ile, sineğin tüm gelişim aşamaları taksonomi, anatomi, gelişim, fizyoloji ve hastalık dahil olmak üzere hem tanımlayıcı hem de hipotez testi çalışmaları için yüksek çözünürlükte görselleştirilebilir27. Bu protokol, μ-CT ile görselleştirmeyi geliştirmek için görüntü kontrastı için kimyasal boyama gerektiren hemen hemen her böcek ve hatta canlı olmayan malzemeleri görüntülemek için de yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm gelişim aşamalarında bozulmamış Drosophila melanogaster’ı görselleştirmek, öncelikle ışık mikroskopisinin bu hayvanda bulunan kalın, pigmentli kütikülle uyumsuzluğu nedeniyle bir zorluk olmaya devam etti. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), Optik Koherens Tomografi (OCT) ve ultramikroskop doku temizleme ile birleştiğinde diğer tüm hayvan görüntüleme yöntemleri sineklerde başarı ile kullanılmıştır50,51,52,53,54, μ-CT bu organizmanın tüm hayvan görüntülemesi için ideal kılan bir dizi avantajsunarken 13 , 15,30 . X ışınları pigmentli kütiküllere kolayca nüfuz eder ve küçük dalga boyları mikron altı görüntülemeye izin verir. Etiketleme, yaygın olarak bulunan kimyasallara minimum yatırım gerektirir ve özel tezgah becerileri yoktur13. μ-CT tarayıcılar da ticari olarak mevcuttur ve maliyetler hafif mikroskopi platformlarıyla karşılaştırılabilirken, aynı zamanda bir kurumda kullanılabilirliğinden de yararlanabilecek daha geniş disiplinler (Jeoloji, Paleontoloji, Mühendislik vb.) için daha çekicidir. Senkrotron X-Ray kaynakları, sabit ve canlı böceklerin31,55,56,ancak ticari tezgah üstü tarayıcılardan daha az erişilebilir olan yüksek çözünürlüklü μ-CT görüntülemesi için de kullanılabilir.
Bu protokol, sinek yetişkinleri, pupa, larva ve hücreselleştirilmiş embriyoların μ-CT görüntülerini elde etmenin etkili bir yolunu sağlar. Yukarıda özetlenen adımların çoğu için, görüntüleme için örnekler hazırlamak için alternatif yöntemlerin de uygulanabileceğini unutmayın. Diğer çalışmalar, böceklerde kullanılmak üzere farklı sabitleme, etiketleme ve kurutma adımlarının ayrıntılı bir karşılaştırmasını sağlamıştır ve bu tekniği benimsemek isteyenler, her yaklaşımın yararlarını değerlendirmeye teşvik edilir 1 ,4,13,29,30,57. Bu protokol nispeten basit olsa da, birkaç yararlı öneri sunulmaktadır.
İlk olarak, alttaki yumuşak dokuların önemli ölçüde bozulmaması için sağlam örneklerin seklisini bozarken dikkatli olunmalıdır. Larva ve erken pupal aşamalarının dürtmeden önce Bouin’in çözeltisinde 2 saat boyunca sabitlenmesine izin vermek önemlidir. Bu, dokuyu sertleştirecek ve organ mimarisini değiştirebilecek lütikül deliklerinden sızacak hemolimf miktarını sınırlayacaktır. İlgi çekici yapı (lar) orada bulunuyorsa, yetişkinin bireysel vücut segmentleri (baş, toraks ve karın) ayrılabilir. Bu segmentleri forsepsle ayırmak yerine temiz bir şekilde dilimlemek için bir neşter kullanılması önerilir, bu da örneğin bağırsak veya merkezi sinir sisteminin 3D mimarisini bozabilir. Zamanlama gelince, yetişkinler genellikle sadece 16 saat gerekir. tam fiksasyon için larva ve pupal aşamaları 24 saat gerekir. Ayrıca, iyot veya PTA lekesi düzensiz görünüyorsa, numune lekeleme bile elde edilene kadar daha uzun süre kuluçkaya yatmak için çözeltiye geri yerlenebilir. Son olarak, nemlendirilmiş numuneler 4 ° C’ye yerlendirilmemelidir, çünkü bu, oda sıcaklığına ısındıktan sonra vücut boşluğu içinde hava kabarcıklarının oluşumunu teşvik ediyor gibi görünmektedir.
İkinci olarak, numune montajı alete, sahne tipine ve numunenin hidratlı kalması gerekip gerekmediğine veya kritik noktanın kurutulup kurutulmadığına göre değişir. Nemlendirilmişse, numunenin sızmadığından emin olun ve muhtemelen tarayıcıyı yok edin. Numuneyi bir pipet ucunun içine monte ederken, numuneler hafif bir dirençle karşılaşana ve hareket edemeyinceye kadar körelmiş bir nesneyle hafifçe itdiğinizden emin olun. Çok fazla itmek oksikül deformasyonuna ve alttaki yapısal kusurlara yol açabilir. Ayrıca, numunenin tutucuda dönme eksenine mümkün olduğunca yakın hizalı olduğundan emin olun. Herhangi bir yalpalama, daha geniş görüş alanı nedeniyle tarama sürelerini artıracak ve yeniden yapılanma sonrasında son tomogramın çözünürlüğünü azaltacaktır.
Üçüncü olarak, projeksiyon görüntülerini elde etmek için tarayıcı ayarları da enstrümana göre değişir. Tarayıcının çözünürlük yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak için, X-ışını ışını nokta boyutu mümkün olduğunca küçük olmalıdır (5-10 μm). Bu, X-Ray voltajı ve akım ayarlarının toplam gücü 3-4 W olacak şekilde dengelenmesiyle elde edilebilir. Bu ayarlar ve kameradaki uygun pozlama süresi ile numune ile uygun X-ışını ışını zayıflaması ve optimum görüntü kontrastı elde edilebilir. Nesne ile X-ışını kaynağı arasındaki alüminyum veya bakır filtrelerin kullanımı, en iyi görüntü kontrastı için en uygun X-ışını enerjisi ayarlarında ince ayar yapmak veya daha yüksek güçlü kaynakların kullanılması için kirişi yeterince zayıflamak için kullanılabilir. Görüntü çözünürlüğüne gelince, bu leke türü, projeksiyon görüntüsü sayısı, görüntü piksel boyutu, kamera konumu, numune hareketi, tarayıcı titreşimleri ve yeniden yapılandırma parametreleri dahil olmak üzere birçok farklı değişkene bağlı olacaktır. Bilinen boyut işaretçilerini içeren bir çubuk desen hayaleti (QRM GmbH), belirli bir tarayıcı ve kamera ayarı için uzamsal çözünürlüğü değerlendirmeye yardımcı olabilir.
Ayrıca kritik nokta kurutulmuş veya hidratlı örnekleri görüntülemenin yararlarını değerlendirmeye değer. Sombke ve ark. iki yöntemin karşılaştırmalı bir değerlendirmesini yaptı ve eklembacaklıları içeren μ-CT uygulamaları için kritik nokta kurutmanın üstün olduğunu buldu30. Bununla birlikte, hidratlı örneklerin yararları, hayvanların hem nicel hem de morfolojik eserlere yol açabilecek daha az kimyasal ve mekanik maruziyete maruz kalmasıdır. Bu aynı zamanda hassas dokuları CPD’den daha iyi koruma eğilimindedir. Bununla birlikte, hidratlı numuneler çok daha kısa bir raf ömrüne sahiptir ve doku bozulması ve düşük görüntü kalitesi bu noktada belirgin hale geldiğinden, fiksasyondan en geç bir ay sonra görüntülenmelidir. Ayrıca, hidratlı numunelerin çözünürlüğü kritik bir nokta kurutulmuş numuneden biraz daha az olacaktır, çünkü X ışınları hem plastik pipet ucuna hem de çevredeki sıvıya (su veya tampon) nüfuz etmelidir. Kritik Nokta Kurutulmuş numuneler, özellikle Drierite’de tutulduğunda çok daha uzun süre korunabilir. Ayrıca, kanatları veya bacakları bir böcek pimine yapıştırarak ve montaj işlemini basitleştirerek sahne aynasına yerleştirerek doğrudan X-ışını ışını yoluna yerlenebilirler. Bununla birlikte, bu örneklerin geniş etanol dehidrasyonu doku büzülmesine ve hassas doku mimarisinin kaybına yol açabilir, bu nedenle bu etkileri en aza indirmek için bir dizi artan EtOH konsantrasyonu yapmak önemlidir. Bununla birlikte, paraformaldehit fiksasyonu ve hatta iyot lekelenmesi de dahil olmak üzere her türlü kimyasal tedavinin doku büzülmesine neden olabileceği belirtilmelidir58,59. Her iki yöntem de canlı bir sinekte ‘gerçek organ büyüklüğü’ ölçümleri sağlamazken, sabitleme, boyama ve kurutma adımları her iki numune kümesi için de aynı şekilde gerçekleştirildiği sürece mutant ve wildtype hayvanları karşılaştırırken morfometrik ölçümler hala geçerlidir ( tercihen paralel olarak).
Sonuç olarak, μ-CT Drosophila33 , 34 , 35,36,37,38,39,40,41için yararlı bir tüm hayvan görüntüleme aracı sağlar. Diğer birçok çalışma, böcek taksonomisi, ekoloji, fizyoloji, gelişim ve anatominin sineklerde gelecekteki çalışmaları bilgilendirmeye yardımcı olabilecek çeşitli yönlerini anlamak için bu teknolojinin gücünü sergilemiştir1,28,30,31,32,55,56,57 . Bu organizmada zaten yaygın olarak kullanılan genetik ve hafif mikroskopi araçlarıyla birlikte, μ-CT, genotip ve fenotip arasında daha derin bir anlayışa izin veren deneysel bir boru hattı içinde kendini konumlandırabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nasser Rusan’ın desteği olmasaydı bunların hiçbiri mümkün olmazdı. Nih Fare Görüntüleme Tesisi’nden H. Doug Morris, Danielle Donahue ve Brenda Klaunberg’e ve Micro Photonics’den Ben Ache’ye eğitim ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca Zeiss’li Mansoureh Norouzi Rad’e Xradia 520 Versa’daki karın örneklerini taradığınız için teşekkür ederim. Lauren Smith, Samantha Smith ve Rachel Ng de taramaya yardımcı oldu. Nesne Araştırma Sistemleri’nden Mike Marsh, Dragonfly teknik desteği sağladı. Ayrıca Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (1K22HL137902-01) ve Wyoming Üniversitesi’nden Start Up Fonları desteği için minnettarım. Ayrıca anonim yorumculara yararlı önerileri ve yorumları için teşekkür ederim.
Materials
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
References
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
- Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
- Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
- Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
- Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
- Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
- Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
- Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
- Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
- Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
- Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
- Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
- Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
- Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , 2 (2019).
- Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
- Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
- Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
- Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
- Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, 51-71 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures – the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
- Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
- Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
- Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
- Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
- Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
- Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
- Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, 374-377 (2008).
- Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
- Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
- Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
- Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
- Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
- Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
