Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography
Summary
Er wordt een protocol gepresenteerd dat de visualisatie van intacte Drosophila melanogaster in elk stadium van ontwikkeling mogelijk maakt met behulp van microcomputed tomografie.
Abstract
Biomedische beeldvormingstools maken onderzoek mogelijk van moleculaire mechanismen op ruimtelijke schalen, van genen tot organismen. Drosophila melanogaster, een goed gekarakteriseerd modelorganisme, heeft geprofiteerd van het gebruik van licht- en elektronenmicroscopie om de genfunctie op het niveau van cellen en weefsels te begrijpen. De toepassing van beeldvormingsplatforms die een goed begrip van de genfunctie op het niveau van het gehele intacte organisme mogelijk maken, zou onze kennis van genetische mechanismen verder vergroten. Hier wordt een hele dierbeeldvormingsmethode gepresenteerd die de stappen schetst die nodig zijn om Drosophila in elk ontwikkelingsstadium te visualiseren met behulp van microcomputertomografie (μ-CT). De voordelen van μ-CT omvatten commercieel verkrijgbare instrumentatie en minimale hands-on tijd om nauwkeurige 3D-informatie te produceren op micron-niveau resolutie zonder de noodzaak van weefseldissectie of clearing methoden. In combinatie met software die beeldanalyse en 3D-rendering versnelt, kan gedetailleerde morfometrische analyse van elk weefsel- of orgaansysteem worden uitgevoerd om mechanismen van ontwikkeling, fysiologie en anatomie beter te begrijpen voor zowel beschrijvende als hypotheseteststudies. Door gebruik te maken van een beeldvormingsworkflow die het gebruik van elektronenmicroscopie, lichtmicroscopie en μ-CT omvat, kan een grondige evaluatie van de genfunctie worden uitgevoerd, waardoor het nut van dit krachtige modelorganisme wordt bevorderd.
Introduction
Beeldvormingsmethoden die het mogelijk maken om de inwendige structuren van een object gedetailleerd te onderzoeken zonder de algehele 3D-architectuur te vernietigen, hebben bewezen op grote schaal gunstig te zijn voor een aantal verschillende disciplines, waaronder natuurkunde, techniek, materiaalkunde, archeologie, paleontologie, geologie en biologie1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Onder deze niet-destructieve beeldvormingsmethoden zijn op röntgen gebaseerde platforms vooral nuttig vanwege het vermogen van hoogenergetische röntgenstralen om veel verschillende soorten monsters en materialen te penetreren met minimale verstrooiing in vergelijking met zichtbare lichtgolven. Computertomografie (CT), Microcomputed Tomography (μ-CT), Nanocomputed Tomography (Nano-CT) en Synchrotron Microtomografie zijn daarom naar voren gekomen als de primaire technologieën voor röntgengebaseerde beeldvorming van monsters variërend van meters tot microns, met millimeter tot sub-micron resolutiemogelijkheden10,11,12,13,14.
Hoewel deze platforms verschillen in hun ontwerp, röntgengeometrie en componenten om de steekproefgrootte en resolutie in evenwicht te brengen, vertrouwen ze allemaal op hetzelfde basisprincipe voor het vastleggen van afbeeldingen: een bron van röntgenstralen die door het object reizen en worden opgevangen door een detector. Differentiële verzwakking van de röntgenstraal terwijl deze door verschillende dichtheden in het object gaat, genereert beeldcontrast. 3D-gegevens worden verkregen door het monster of de detector te roteren en een reeks 2D-projectiebeelden te verzamelen die vervolgens met behulp van algoritmen worden gereconstrueerd tot tomogrammen met 3D-informatie waarvan de resolutie isotroop is in x,y,z15. Voor veel benchtop μ-CT-scanners die een conusstraal röntgengeometrie gebruiken om röntgenstralen te projecteren op het object dat in beeld wordt gesteld, wordt het Feldkamp-algoritme gebruikt om het object nauwkeurig te reconstrueren met minimale fouten16.
De resolutie van een bepaald platform wordt voornamelijk bepaald door systeemparameters zoals de grootte van de röntgenstraal (spotgrootte), scannergeometrie (afstand van object tot röntgenbron), grootte van de pixels op de detector en het gebruikte reconstructiealgoritme. Aanvullende factoren, zoals scannertrillingen, fluctuaties van röntgenstralen, monsterbewegingen en materiaaltype of chemische vlek die wordt gebruikt om het object te visualiseren, kunnen ook de ruimtelijke resolutie onder reële beeldvormingscondities aanzienlijk beïnvloeden15.
Voor biomedische toepassingen hebben CT en μ-CT een sleutelrol gespeeld bij het bevorderen van ons begrip van anatomie, fysiologie, ontwikkeling en ziektemechanismen, en dienen als een hulpmiddel voor zowel diagnoses van menselijke patiënten als als een preklinisch beeldvormingsplatform voor modelorganismen17,18. Het Mouse International Phenotyping Consortium, dat tot doel heeft de functie van elk gen in het muizengenoom te identificeren, gebruikt bijvoorbeeld μ-CT als onderdeel van hun fenotyperingspijplijn19. Hun resultaten zijn van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van genen die betrokken zijn bij ontwikkelings- en ziekteprocessen, terwijl ze ook dienen als een atlas voor de anatomie en ontwikkeling van muizen20. Andere modelorganismen, zoals zebravissen en ratten, hebben ook het gebruik van μ-CT volledig omarmd voor het uitvoeren van fenotypering van een aantal genmutanten17,21,22,23.
Het voordeel van het combineren van beeldvorming van hele dieren met modelorganismen is dat een mechanistisch begrip van de genfunctie voor een bepaald biologisch proces volledig kan worden onderzocht. Dit is mogelijk vanwege de goed gekarakteriseerde genomen en vele genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in modelorganismen die nauwkeurige manipulatie van de genfunctie mogelijk maken op verschillende ontwikkelingstijdpunten, specifieke weefsels, individuele cellen en zelfs subcellulaire organellen. Deze omvatten binaire expressiesystemen zoals het UAS / GAL4-systeem (en zijn vele derivaten), CRISPR / Cas9 en RNAi24,25,26. Wanneer deze genetische hulpmiddelen worden gebruikt in combinatie met een krachtige beeldvormingspijplijn bestaande uit elektronenmicroscopie, lichtmicroscopie (fluorescerend en niet-fluorescerend) en beeldvorming van hele dieren zoals μ-CT, kan een grondige evaluatie van moleculen, cellen, weefsels, organen en het hele organisme worden bereikt, waardoor een veel dieper begrip van de genfunctie mogelijk wordt.
Dit protocol richt zich op het gebruik van μ-CT in het niet-zoogdiermodelorganisme Drosophila melanogaster, waarvan de talloze genetische hulpmiddelen hebben geholpen bij het ophelderen van tal van moleculaire mechanismen26,27. Het werd overgenomen uit eerdere protocollen in niet-modelinsecten1,28,29,30,31,32en bouwt voort op eerdere μ-CT-studies in Drosophila om een gestandaardiseerd protocol vast te stellen voor het gebruik ervan in dit dier33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. De stappen voor succesvolle monstervoorbereiding, beeldvorming en analyse van fly μ-CT-datasets met behulp van commercieel beschikbare scanners worden geschetst. Met dit protocol kunnen alle ontwikkelingsstadia van de vlieg met hoge resolutie worden gevisualiseerd voor zowel beschrijvende als hypothese-testende studies, waaronder taxonomie, anatomie, ontwikkeling, fysiologie en ziekte27. Dit protocol zal ook nuttig zijn voor het in beeld brengen van vrijwel elk insect en zelfs niet-levende materialen die chemische kleuring vereisen voor beeldcontrast om de visualisatie te verbeteren door μ-CT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het visualiseren van intacte Drosophila melanogaster in alle ontwikkelingsstadia is een uitdaging gebleven, voornamelijk vanwege de incompatibiliteit van lichtmicroscopie met de dikke, gepigmenteerde cuticel die bij dit dier wordt aangetroffen. Terwijl andere beeldvormingsmethoden voor hele dieren, zoals Magnetic Resonance Imaging (MRI), Optical Coherence Tomography (OCT) en ultramicroscopie in combinatie met weefselverwijdering met succes zijn gebruikt bij vliegen50,51,52,53,54,μ-CT een aantal voordelen biedt die het ideaal maken voor beeldvorming van hele dieren van dit organisme13,15,30 . Röntgenstralen dringen gemakkelijk de gepigmenteerde cutickel binnen en hun kleine golflengte maakt submicron beeldvorming mogelijk. Etikettering vereist minimale investeringen in algemeen beschikbare chemicaliën en geen gespecialiseerde bench skills13. μ-CT-scanners zijn ook commercieel verkrijgbaar en de kosten zijn vergelijkbaar met lichte microscopieplatforms, terwijl ze ook aantrekkelijker zijn voor een breder scala aan disciplines (geologie, paleontologie, engineering, enz.) die ook kunnen profiteren van de beschikbaarheid ervan bij een instelling. Synchrotron X-Ray bronnen kunnen ook worden gebruikt voor hoge resolutie μ-CT beeldvorming van vaste en levende insecten31,55,56,maar zijn minder toegankelijk dan commerciële benchtop scanners.
Dit protocol biedt een efficiënte manier om μ-CT-beelden van vliegenvolwassenen, poppen, larven en cellulaire embryo’s te verkrijgen. Merk op dat voor veel van de hierboven beschreven stappen ook alternatieve methoden kunnen worden toegepast om monsters voor te bereiden op beeldvorming. Andere studies hebben een gedetailleerde vergelijking opgeleverd van verschillende fixatie-, etiketterings- en droogstappen voor gebruik bij insecten en degenen die geïnteresseerd zijn in het toepassen van deze techniek worden aangemoedigd om de verdiensten van elke benadering1,4,13,29,30,57te evalueren. Hoewel dit protocol relatief eenvoudig is, worden een paar nuttige suggesties gepresenteerd.
Ten eerste moet voorzichtigheid worden besteed aan het verstoren van de cuticel van intacte exemplaren, zodat onderliggende zachte weefsels niet significant worden verstoord. Het is belangrijk om larvale en vroege popstadia gedurende 2 uur fixatie te laten ondergaan in bouin’s oplossing voordat je prikt. Dit verstijft het weefsel en beperkt de hoeveelheid hemolymfe die uit de cuticiekgaten sijpelt, wat de orgelarchitectuur kan veranderen. Individuele lichaamssegmenten (hoofd, thorax en buik) van de volwassene kunnen worden gescheiden als de structuur (en) van belang zich daar bevinden. Het wordt aanbevolen om een scalpel te gebruiken om deze segmenten netjes door te snijden in plaats van ze uit elkaar te trekken met een tang, wat bijvoorbeeld de 3D-architectuur van de darm of het centrale zenuwstelsel zou kunnen verstoren. Wat timing betreft, hebben volwassenen over het algemeen slechts 16 uur nodig. voor volledige fixatie, terwijl larvale en popstadia 24 uur nodig hebben. Ook als jodium- of PTA-kleuring ongelijk lijkt, kan het monster terug in oplossing worden geplaatst om langer te incuberen totdat een gelijkmatige kleuring is bereikt. Ten slotte mogen gehydrateerde monsters niet bij 4 °C worden geplaatst, omdat dit de vorming van luchtbellen in de lichaamsholte lijkt te induceren na opwarming tot kamertemperatuur.
Ten tweede zal de montage van het monster variëren per instrument, podiumtype en of het monster gehydrateerd moet blijven of op een kritiek punt is gedroogd. Indien gehydrateerd, zorg er dan voor dat het monster niet lekt en vernietig de scanner mogelijk. Wanneer u het monster in een pipetpunt monteert, moet u voorzichtig duwen met een afgestompt voorwerp totdat de monsters lichte weerstand ondervinden en niet kunnen bewegen. Te hard duwen kan leiden tot vervorming van de cutickel en onderliggende structurele defecten. Zorg er ook voor dat het monster zo dicht mogelijk bij de rotatieas in de houder is uitgelijnd. Elke wiebel zal de scantijden verlengen vanwege het grotere gezichtsveld en de resolutie van het uiteindelijke tomogram na reconstructie verminderen.
Ten derde zullen de scannerinstellingen voor het verkrijgen van projectiebeelden ook per instrument verschillen. Om de resolutiemogelijkheden van de scanner te maximaliseren, moet de spotgrootte van de röntgenstraal zo klein mogelijk zijn (5-10 μm). Dit kan worden bereikt door de röntgenspanning en stroominstellingen zodanig te balanceren dat het totale vermogen 3-4 W is. Met deze instellingen en de juiste belichtingstijd op de camera kan een goede röntgenstraalverzwakking door het monster en een optimaal beeldcontrast worden bereikt. Het gebruik van aluminium of koperen filters tussen het object en de röntgenbron kan worden gebruikt om de optimale röntgenenergie-instellingen voor het beste beeldcontrast af te stellen of de bundel voldoende te dempen om bronnen met een hoger vermogen te gebruiken. Wat de beeldresolutie betreft, hangt dit af van veel verschillende variabelen, waaronder het type vlek, het aantal projectiebeelden, de grootte van de beeldpixel, de camerapositie, de beweging van het monster, de trillingen van de scanner en de reconstructieparameters. Een staafpatroonfantoom (QRM GmbH) met bekende maatmarkeringen kan helpen bij het evalueren van de ruimtelijke resolutie voor een bepaalde scanner en camera-instelling.
Het is ook de moeite waard om de verdiensten van beeldvorming van kritische punt gedroogde of gehydrateerde monsters te evalueren. Sombke et al. voerden een vergelijkende beoordeling van de twee methoden uit en vonden dat het drogen van kritieke punten superieur was voor μ-CT-toepassingen met geleedpotigen30. Voordelen van gehydrateerde monsters zijn echter dat dieren worden blootgesteld aan minder chemische en mechanische blootstelling die kan leiden tot zowel kwantitatieve als morfologische artefacten. Dit heeft ook de neiging om delicate weefsels beter te behouden dan CPD. Gehydrateerde monsters hebben echter een veel kortere houdbaarheid en moeten uiterlijk een maand na fixatie in beeld worden gebracht, omdat weefselafbraak en verminderde beeldkwaliteit op dat moment duidelijk worden. Ook zal de resolutie van gehydrateerde monsters iets minder zijn dan een kritisch puntgedroogd monster, omdat röntgenstralen ook door zowel een plastic pipetpunt als de omringende vloeistof (water of buffer) moeten doordringen. Critical Point Gedroogde monsters kunnen veel langer worden bewaard, vooral wanneer ze op Drierite worden bewaard. Ze kunnen ook direct in het röntgenstraalpad worden geplaatst door de vleugels of poten eenvoudig op een insectenpen te lijmen en in de podiumhouder te plaatsen, waardoor het montageproces wordt vereenvoudigd. De uitgebreide ethanoluitdroging van deze monsters kan echter leiden tot weefselkrimp en verlies van delicate weefselarchitectuur, daarom is het belangrijk om een reeks toenemende EtOH-concentraties uit te voeren om deze effecten te minimaliseren. Niettemin moet worden opgemerkt dat alle vormen van chemische behandeling, inclusief paraformaldehydefixatie en zelfs jodiumkleuring, weefselkrimp kunnen veroorzaken58,59. Hoewel geen van beide methoden metingen van de ‘werkelijke orgaangrootte’ in een levende vlieg zal opleveren, zijn morfometrische metingen nog steeds geldig bij het vergelijken van mutante en wildtype dieren, zolang de fixatie-, kleurings- en droogstappen identiek worden uitgevoerd voor beide sets monsters – bij voorkeur parallel.
Kortom, μ-CT biedt een nuttig beeldvormingsinstrument voor hele dieren voor Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Veel andere studies hebben de kracht van deze technologie aangetoond voor het begrijpen van verschillende aspecten van insectentaxonomie, ecologie, fysiologie, ontwikkeling en anatomie die kunnen helpen toekomstige studies bij vliegen te informeren1,28,30,31,32,55,56,57 . In combinatie met de genetische en lichtmicroscopie-instrumenten die al veel in dit organisme worden gebruikt, kan μ-CT zich positioneren in een experimentele pijplijn die een dieper begrip tussen genotype en fenotype mogelijk maakt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Niets van dit alles zou mogelijk zijn geweest zonder de steun van Nasser Rusan. Ik wil graag H. Doug Morris, Danielle Donahue en Brenda Klaunberg van de NIH Mouse Imaging Facility en Ben Ache van Micro Photonics bedanken voor training en nuttige discussie. Ik dank ook Mansoureh Norouzi Rad van Zeiss voor het scannen van buikmonsters op de Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith en Rachel Ng hielpen ook met scannen. Mike Marsh van Object Research Systems leverde Dragonfly technische ondersteuning. Ik ben ook dankbaar voor de steun van het National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) en Start Up Funds van de Universiteit van Wyoming. Ik dank ook de anonieme recensenten voor hun nuttige suggesties en opmerkingen.
Materials
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
References
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
- Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
- Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
- Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
- Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
- Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
- Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
- Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
- Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
- Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
- Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
- Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
- Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
- Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , 2 (2019).
- Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
- Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
- Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
- Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
- Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, 51-71 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures – the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
- Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
- Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
- Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
- Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
- Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
- Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
- Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, 374-377 (2008).
- Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
- Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
- Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
- Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
- Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
- Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
