كشف دور المناطق المنفصلة من دماغ الفئران في تنظيم الإباضة من خلال تعطيل عكسها بواسطة الميكروبيكشنات التيترودوتوشين
Summary
يصف هذا البروتوكول بناء نظام حقن دقيق منخفض التكلفة ، وزرعه الاستريوتاكسيكي في هياكل الدماغ العميق وإجراء التجسيد الدقيق في الوقت المناسب من التيترودوتوشين في الفئران المستيقظة وغير المقيدة. والهدف من ذلك هو الكشف عن مشاركة هياكل تحت المهاد في تنظيم الإباضة عن طريق تثبيط نشاطها العصبي.
Abstract
وقد استخدمت العديد من النهج التجريبية لدراسة دور الدماغ في تنظيم الإباضة. ومن الأمثلة على ذلك آفة وصمم الآذان من المجموعات العصبية، وكلاهما أساليب الغازية التي تضعف بشكل دائم سلامة المنطقة المستهدفة. وترافق هذه الأساليب آثار جانبية يمكن أن تؤثر على تحليل الآليات التنظيمية الحادة والزمنية. يسمح الزرع المجسم للقنية المرشدة التي تستهدف مناطق معينة في الدماغ ، تليها فترة نقاهة ، للباحثين بتنقيح أدوية مختلفة بعد اختفاء الآثار غير المرغوب فيها للجراحة. وقد استخدم التيترودوتوشين لتحديد أدوار العديد من مناطق الدماغ في العمليات الفسيولوجية المتنوعة لأنه يمنع بشكل عابر إمكانات العمل المعتمدة على الصوديوم، وبالتالي منع جميع الأنشطة العصبية في المنطقة المستهدفة. يجمع هذا البروتوكول بين هذه الطريقة واستراتيجيات تقييم دورة استروس والإباضة للكشف عن دور مناطق الدماغ المنفصلة في تنظيم الإباضة في أوقات معينة من أي مرحلة معينة من دورة استروس. استخدمت الفئران مستيقظا وغير المقيد(Rattus norvegicus)لتجنب آثار الحجب التي التخدير وهرمونات الإجهاد تمارس على الإباضة. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع الأنواع الأخرى وأهداف الدماغ والعوامل الدوائية لدراسة العمليات الفسيولوجية المختلفة. وتشمل التحسينات المستقبلية لهذه الطريقة تصميم نظام الاقتصاص الدقيق باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر الصغير بدلا من القنية المرشدة. وهذا يقلل من كمية الأنسجة التالفة أثناء الزرع ويقلل من انتشار الأدوية المشبعة خارج المنطقة المستهدفة.
Introduction
الإباضة هي العملية التي يتم من خلالها إطلاق بويضة واحدة أو أكثر من البويضات الناضجة من المبيضين مرة واحدة في كل دورة استرال/الحيض. وبما أن جميع أنواع الثدييات تعتمد على إنتاج الأمشاج للتكاثر، فإن فهم الآليات التي تنظم الإباضة له تأثير كبير في مجالات تتراوح بين الطب الحيوي وصناعة الماشية وصيانة الأنواع المهددة بالانقراض. وينظم الإباضة محور ما تحت المهاد- الغدة النخامية – المبيض، والذي ينطوي على عدة مناطق تحت المهاد وخارج المهاد، وغدد الغونادوتروبي في الغدة النخامية الأمامية وخلايا الثكا والجرانولوزا التي تشكل، جنبا إلى جنب مع البويضات، بصيلات المبيض داخل المبيضين1.
بصيلات المبيض تنمو وتتطور وتبيض في نهاية المطاف استجابة للإفراز منشط وتدرجي من هرمون تحفيز الجريب والهرمون اللوتين، واثنين من gonadotropins يفرزها gonadotropes. نمط إفراز gonadotropin أمر محوري للتنمية الجريبي السليم والإباضة وينظمه هرمون إطلاق gonadotropin (GnRH)1،2. يتم تصنيع هذا الببتيد العصبي من قبل الخلايا العصبية المنتشرة في جميع أنحاء الدماغ القاعدي ثم يفرز إلى الأوعية الدموية البوابة التي تربط تحت المهاد والغدة النخامية الأمامية. النشاط إفرازي للخلايا العصبية GnRH-هو بدوره تحوير مدخلات متشابك الناشئة عن هياكل الدماغ المتنوعة. تنقل هذه الهياكل معلومات عن حالة البيئة الخارجية والداخلية للكائن الحي بما في ذلك توافر الطعام وطول الخلايا الضوئية وتركيز الهرمونات في الدم. وبهذا المعنى، فإنها تشكل النمط الإنجابي لكل نوع ويجب تحديد الأدوار المحددة لهذه الهياكل من أجل فهم الآليات التي تحكم الإباضة فهما سليما. وكمثال على ذلك، تبين أن التذبذب في مستويات استراديول خلال دورة استروس ينظم إفراز GnRH؛ ومع ذلك، GnRH-الخلايا العصبية لا تعبر عن ايزوفورم مستقبلات استراديول اللازمة للكشف عن مثل هذه التغييرات. وتقع مجموعتان من الخلايا العصبية التي تعبر عن هذه المستقبلات في المنطقة المحيطة بالبطين الوردي من البطين الثالث وفي نواة أركوات، على التوالي، ونقاط الاشتباك العصبي الطعنية مع الخلايا العصبية GnRH. هناك أدلة تشير إلى أن هذه الخلايا العصبية تفسير تركيز استراديول ومن ثم تحفيز نشاط الخلايا العصبية GnRH عن طريق الإفراج kisspeptin, محث قوية من إفراز GnRH3.
التجارب التي تنطوي على الآفات الثيرمية أو الكيميائية، وكذلك الصمم الميكانيكي، سمحت للباحثين بتحديد تورط العديد من هياكل الدماغ في تنظيم الإباضة4،5،6،7،8،9،10،11،12 . ومع ذلك ، فإن هذه التجارب لها عيب كونها الغازية والصدمة ، التي تتطلب عدة أيام من الشفاء قبل تقييم آثار العلاج ، مما يعوق تحليل الآثار الحادة للعلاج. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تؤثر بشكل دائم على المناطق المستهدفة وتعطل العمليات الفسيولوجية الأخرى على المدى الطويل. وبسبب هذه المشاكل، عادة ما تحجب الآليات التعويضية الهوستاتيكية في جسم الحيوان نتائج هذه التجارب، واستخراج معلومات دقيقة عن الديناميات التنظيمية الزمنية التي تشارك فيها المنطقة أمر صعب إلى حد ما.
الميكرويينجيكت من الأدوية التي تعطل بشكل عابر نشاط الخلايا العصبية من خلال القنية دليل هو بديل مناسب يتجاوز عيوب المذكورة أعلاه. يمكن وضع القنية في أي منطقة في الدماغ عن طريق جراحة ستيريوتاكسيك ، مما يسمح للباحث ببدء العلاج من المخدرات بعد اختفاء الآثار المحيرة للجراحة. يسمح الفحص الدقيق في الوقت المناسب للأدوية للباحثين باختبار الفرضيات المتعلقة بمساهمة المنطقة في خطوة معينة من العملية ويمكن إجراؤها في مقيدة أو حرة الحركة مستيقظة. يمكن أن يتم حقن مجموعة متنوعة من الأدوية بما في ذلك التخدير الموضعي وناهضات ومضادات الآلام العكسية والسموم البيولوجية مثل التيترودوتوكسيين (TTX) في منطقة الاهتمام في أوقات محددة.
TTX هو السم البيولوجي توليفها من قبل البكتيريا التي تعيش في الجسم من النفخة، فضلا عن الفقاريات واللافقاريات الأخرى. TTX يسكت النشاط العصبي من خلال الحصار الانتقائي والعابرة لقنوات الصوديوم، مما يؤدي إلى تثبيط إمكانات العمل التي تعتمد على الصوديوم. في وجود TTX ، تواجه الخلايا تغييرا في مرحلة إزالة الاستقطاب وبالتالي فهي ليست مثيرة ولكنها لا تزال على قيد الحياة. يتم تفسير تأثير حجب TTX بتكوينه الجزيئي: مجموعة جوانيدينيوم قادرة على المرور عبر الجانب خارج الخلية من قناة الصوديوم ، ولكن بقية الجزيء لا يمكن أن يمر بسبب حجمه ، لذلك فهو عالق ويمنع القناة13،14،15،16،17 . سمحت آلية عمل TTX باستخدامها كأداة لدراسة الجهاز العصبي في المختبر وفي الجسم الحي. وقد استخدمت الحقن داخل الدماغ من هذا السم لدراسة دور مناطق الدماغ منفصلة في عدة عمليات مثل الاحتفاظ الذاكرة18, النوم والإثارة19, مكان الاعتراف20, الملاحة المكانية21, تعاطي المخدرات22, التنظيم الحراري23, تطورالفصام 24, السلوك الجنسي25 وتنظيم الإباضة26 من بين أمور أخرى. في هذا البروتوكول نقوم بوصف الآثار على الإباضة من تعطيل عابرة من نواة تحت المهاد بواسطة الميكرويكشن TTX في الفئران مستيقظا وغير المقيد.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة طريقة لتثبيط بشكل عابر، في أي وقت من الأوقات، منطقة منفصلة في الدماغ من الفئران مستيقظا وغير المقيد. كما يتم توفير طريقة بسيطة لتتبع دورة استروس وتقييم الإباضة. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تحليل مباشر لمساهمة مناطق الدماغ المحددة في الآليات التي تدفع الإباضة من خلال مقارن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لريمون سانشيز في جامعة واشنطن على مساعدته القيمة في تحرير المخطوطات وعلى M.Sc جورجينا كورتيس M.Sc سينتيا خافيير على دعمهما التقني في توحيد هذه التقنية. كما أننا ممتنون لأعضاء الخدمات البيطرية في كلية الدراسات العليا سرقسطة: MVZ. أدريانا ألتاميرانو، MVZ. رومان هيرنانديز وMVZ. دولوريس إليزابيث غوزمان لصيانة ممتازة ورعاية الحيوانات التجريبية. تم دعم التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول برقم منحة DGAPA-PAPIIT: IN216015 ورقم منحة كوناسيت: 236908 لروبرتو دومينغيز. كارلوس كاميلو سيلفا هو طالب دكتوراه من برنامج الدكتوراه في السيكولوجيس، جامعة ناسيونال أوتونوما دي ميكسيكو (UNAM) ويدعمه المجلس الوطني للكنسية (رقم المنحة: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
