Ontrafeling van de rol van discrete gebieden van het rattenbrein in de regulatie van ovulatie door omkeerbare inactivatie door tetrodotoxine micro-injecteringen

Ovulatie is het proces waarbij een of meer volwassen eicellen eenmaal per oestrale / menstruatiecyclus uit de eierstokken worden vrijgegeven. Omdat alle zoogdiersoorten afhankelijk zijn van de productie van gameten om te broeden, heeft het begrip van de mechanismen die de ovulatie reguleren een enorme impact op gebieden variërend van biogeneeskunde, de vee-industrie en het onderhoud van bedreigde soorten. Ovulatie wordt gereguleerd door de hypothalamus-hypofyse-ovariële as, die verschillende hypothalamische en extra-hypothalamische gebieden omvat, de gonadotropen in de voorste hypofyse en de theca- en granulosacellen die, samen met de eicellen, de ovariële follikels in de eierstokken vormen¹.

Ovariële follikels groeien, ontwikkelen en ovuleren uiteindelijk als reactie op de tonische en fasische secretie van het follikelstimulerend hormoon en het luteïniserend hormoon, de twee gonadotrofinen die door de gonadotropen worden uitgescheiden. Het patroon van gonadotrofinesecretie is cruciaal voor een goede folliculaire ontwikkeling en ovulatie en wordt gereguleerd door het gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH)^1,2. Dit neuropeptide wordt gesynthetiseerd door neuronen verspreid over het basale diencephalon en vervolgens uitgescheiden naar de portal vasculatuur die de hypothalamus en de voorste hypofyse verbindt. De secretoire activiteit van de GnRH-neuronen wordt op zijn beurt gemoduleerd door synaptische input die voortkomt uit verschillende hersenstructuren. Deze structuren geven informatie over de toestand van de externe en interne omgeving van het organisme, inclusief de beschikbaarheid van voedsel, de lengte van de fotoperiode en de concentratie van hormonen in het bloed. In die zin vormen ze het voortplantingspatroon van elke soort en moeten de specifieke rollen van dergelijke structuren worden bepaald om de mechanismen voor ovulatie goed te begrijpen. Als voorbeeld is aangetoond dat de fluctuatie in oestradiolniveaus tijdens de oestruscyclus de secretie van GnRH reguleert; GnRH-neuronen drukken echter niet de oestradiolreceptorisovorm uit die nodig is om dergelijke veranderingen te detecteren. Twee populaties van neuronen die deze receptoren tot expressie brengen, bevinden zich respectievelijk in het rostrale periventriculaire gebied van de derde ventrikel en in de boogvormige kern, en stellen synapsen vast met GnRH-neuronen. Er zijn aanwijzingen dat deze neuronen de concentratie van oestradiol interpreteren en vervolgens de activiteit van GnRH-neuronen stimuleren door kisspeptine vrij te geven, een krachtige inductor van GnRH-secretie³.

Experimenten met thermische of chemische laesies, evenals mechanische deafferentatie, stelden onderzoekers in staat om de betrokkenheid van verschillende hersenstructuren bij de regulatie van ovulatie te bepalen^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Deze experimenten hebben echter het nadeel dat ze invasief en traumatisch zijn, waardoor enkele dagen herstel nodig zijn voordat de effecten van de behandeling worden geëvalueerd, waardoor de analyse van de acute effecten van de behandeling wordt belemmerd. Bovendien hebben ze permanent invloed op de beoogde gebieden en verstoren ze andere fysiologische processen op de lange termijn. Vanwege deze problemen worden de resultaten van deze experimenten meestal verduisterd door de homeostatische compensatiemechanismen in het lichaam van het dier en het extraheren van nauwkeurige informatie over de temporele regulerende dynamiek waarbij het gebied betrokken is, is nogal moeilijk.

De micro-injectie van geneesmiddelen die de activiteit van neuronen tijdelijk verstoren door middel van geleideules is een geschikt alternatief dat de hierboven genoemde nadelen overtreft. De canules kunnen door een stereotaxische operatie in elk hersengebied worden geplaatst, waardoor de onderzoeker de medicamenteuze behandeling kan starten nadat de verstorende effecten van de operatie zijn verdwenen. De getimede micro-injectie van de medicijnen stelt onderzoekers in staat om hypothesen te testen met betrekking tot de bijdrage van de regio aan een bepaalde stap van het proces en kan worden uitgevoerd bij wakkere ingehouden of vrij bewegende dieren. Een verscheidenheid aan geneesmiddelen, waaronder lokale anesthetica, agonisten, antagonisten, inverse agonisten en biologische toxines zoals tetrodotoxine (TTX) kunnen op specifieke tijdstippen in het gebied van belang worden geïnjecteerd.

TTX is een biologisch toxine gesynthetiseerd door bacteriën die in het lichaam van de kogelvis leven, evenals andere gewervelde en ongewervelde dieren. TTX legt neurale activiteit stil door de selectieve en voorbijgaande blokkade van natriumkanalen, wat resulteert in de remming van natriumafhankelijke actiepotentiaalen. In aanwezigheid van TTX ervaren cellen een verandering in de depolarisatiefase en zijn dus niet prikkelbaar maar blijven ze in leven. Het blokkerende effect van TTX wordt verklaard door de moleculaire samenstelling: een guanidiniumgroep kan door het extracellulaire aspect van het natriumkanaal gaan, maar de rest van het molecuul kan niet passeren vanwege zijn grootte, dus het zit vast en blokkeert het kanaal^{13,14,15,16,17} . Het werkingsmechanisme van de TTX maakte het mogelijk om het te gebruiken als een hulpmiddel om het zenuwstelsel zowel in vitro als in vivo te bestuderen. Intracerebrale injectie van dit toxine is gebruikt om de rol van discrete hersengebieden in verschillende processen zoals geheugenretentie¹⁸, slaap en opwinding¹⁹, plaatsherkenning²⁰, ruimtelijke navigatie²¹, drugsmisbruik²², thermoregulatie²³, ontwikkeling van schizofrenie²⁴, seksueel gedrag²⁵ en regulatie van ovulatie²⁶ onder andere. In dit protocol beschrijven we de effecten op de ovulatie van de voorbijgaande inactivatie van hypothalamische kernen door TTX micro-injectie bij wakkere en ongeremde ratten.