Cuantificación de los flujos espontáneos de Ca²⁺ y sus efectos aguas abajo en las neuronas primarias de cerebro medio de ratón

Todos los procedimientos relacionados con el uso de sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas A&M (25 de noviembrede 2019; AUP 2019-0346). NOTA: La preparación de las soluciones de cultivo celular debe realizarse mediante un procedimiento estéril en un armario de seguridad biológica y filtrarse a 0,2 m para evitar la contaminación. 1. Preparación de soluciones y medio de cultivo Preparar la solución de recubrimiento de laminina diluyendo 20 ml de 1 mg/ml de stock de laminina en 2 ml de H2O estéril destilado. Preparar una solución de parada de 10% de suero equino (caballo) (ES) añadiendo 5 ml de ES a 45 ml de solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) de 1x. Filtro estéril con un sistema de filtro de 0,2 m o punta de filtro de jeringa. Conservar a 4oC. Preparar una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 4% añadiendo 2 g de polvo de BSA a 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) y llevando a un volumen final de 45 ml. Filtro estéril con un sistema de filtro de 0,2 m o punta de filtro de jeringa. Conservar a 4oC. Preparar la solución de papaína diluyendo la papaína a 3 mg/ml en 1x HBSS. Filtro estéril con un sistema de filtro de 0,2 m o punta de filtro de jeringa. Conservar a -20oC. Preparar la solución de desoxirribonucleasa (DNase) añadiendo 20 mg de polvo de DNase a H2O estéril y llevando a un volumen final de 20 ml. Filtro estéril con un sistema de filtro de 0,2 m o punta de filtro de jeringa. Conservar a -20oC. Preparar la solución de acido ascórbico añadiendo 352 mg de ácido ascórbico al destilado estéril H2O y llevando a un volumen final de 20 ml. Calentar en un baño de 37oC para disolver si es necesario. Filtro estéril con un sistema de filtro de 0,2 m o punta de filtro de jeringa. Conservar a -20oC. Preparar el medio de cultivo celular añadiendo lo siguiente a 50 ml de medio neurobasal: 500 l de Glutamax (100x), suero equino de 500 l, 1 ml de B-27, 100 ml de ácido ascórbico, 500 ml de penicilina-estreptomicina, 50 ml de kanamicina y 50 ml de ampicilina. Filtro estéril con un sistema de filtro de 0,2 m. Conservar a 4oC. Prepare la solución Triton X-100 del 0,01% añadiendo 1 ml de Tritón X-100 en 9 ml de 1x PBS para hacer una solución del 10%. Como Triton X-100 es viscoso, pipeta lentamente para permitir que la punta se llene por completo. Calentar en un baño de 37oC para disolver si es necesario. Conservar a 4oC. Para diluir 10% Triton X-100 stock a 0.01%, realice 3 diluciones en serie 1:10. Diluir 1 ml de 10% de stock en 9 ml de 1x PBS para hacer 1% de solución. Diluir 1 ml de solución al 1% en 9 ml de 1x PBS para hacer una solución del 0,1%. Diluir 1 ml de 0,1% de solución en 9 ml de 1x PBS para hacer una solución de 0,01%. Preparar una solución de suero de cabra normal (NGS) del 10% y 1% añadiendo 1 ml de NGS a 9 ml de 1x PBS para una solución del 10%. Añadir 100 l de NGS a 9,9 ml de 1x PBS para hacer una solución del 1%. Preparar la solución de material de glutamato (100 mM) añadiendo 735 mg de L(+)-glutámico a H2O destilado estéril y llevar a un volumen final de 50 ml. La solubilidad en esta concentración será un problema. La adición de pequeños volúmenes (100 l) de ácido clorhídrico de 1 M es suficiente para aumentar la solubilidad. Preparar la solución de stock NBQX (10 mM) añadiendo 50 mg de NBQX a H2O destilado estéril y llevar a un volumen final de 13 ml. 2. Preparación de platos de cultura y cubreobjetos (Hecho el día antes de la disección) NOTA: Hemos descubierto que la combinación de tres agentes de recubrimiento, poli-L-lisina, poli-L-ornitina y laminina permite una adherencia y viabilidad celular ideales. Coloque 10 platos Petri de 35 mm en un armario de seguridad biológica. Colocar dos cubreobjetos circulares de 12 mm en cada plato y rellenar con 70% EtOH durante 10 min. Utilice una línea de vacío para aspirar el EtOH restante de cada plato, permitiendo que el EtOH se evapore por completo. Pipetear 90-100 l de 0,1% de solución de poli-l-lisina en cada tapapción, asegurándose de que toda la cubierta esté cubierta por la solución de poli-L-lisina. Cubra los platos con tapas y colóquelos en una incubadora de 37oC durante 1 h. Aspirar la solución restante de poli-L-lisina de cada cubrelip y enjuagar con H2O estéril. Repita los pasos 2.2 – 2.3 con 0.1% de solución de poli-L-ornitina. Una vez más, repita los pasos 2.2 – 2.3 con 0.01% solución de laminin. Colocar en una incubadora de CO2 de 37oC/5% hasta que esté lista para el enchapado celular al día siguiente. 3. Disecciones embrionarias de ratón NOTA: Utilizamos entre 4 y 6 ratones embarazadas cronobazes por cultivo. Si bien gran parte del proceso de disección ocurre fuera de un gabinete de seguridad biológica, sigue siendo importante mantener un procedimiento estéril. El uso abundante de 70% EtOH en superficies cercanas al microscopio de disección y en herramientas quirúrgicas es ideal. También se puede usar una máscara durante la disección para evitar aún más la contaminación. Además, utilizamos 4 antibióticos separados en el medio de cultivo, por lo que la contaminación es poco probable. Sin embargo, si el uso de antibióticos es problemático, esta configuración de disección podría moverse dentro de una capucha estéril. Para preservar la viabilidad celular, todas las soluciones de disección deben enfriarse previamente a 4 oC, y las disecciones deben completarse lo antes posible. No realizamos las disecciones sobre hielo. El método para la disección de las neuronas embrionarias de ratón es idéntico a los métodos descritos anteriormente9,10. Prepare un espacio en un banco cerca de un microscopio de disección con una almohadilla absorbente y rocíe liberalmente con 70% EtOH. Rocíe dos platos Petri de vidrio de 100 x 15 mm y un plato Petri de cristal de 50 x 10 mm con 70% EtOH y permita que EtOH se evapore. Una vez evaporado, coloque 50 ml de 1x HBSS estéril en cada plato petri de 100 x 15 mm. Sumerja las tijeras quirúrgicas, los fórceps y la cuchilla de microtoma en 70% EtOH durante 10 minutos como mínimo para esterilizar. Coloque los instrumentos en la almohadilla absorbente para secar. Usando CO2 seguido de dislocación cervical, eutanasia ratones de embarazo cronosizado de 2-3 meses de edad en el día embrionario 14. Rocíe el abdomen de los ratones eutanizados con 70% EtOH. Usando fórceps agarrar la parte inferior del abdomen y abrir la cavidad abdominal usando tijeras quirúrgicas. Comience a cortar cerca de donde los fórceps están sosteniendo el abdomen, haciendo cortes laterales en cada lado hasta que la pared abdominal se puede doblar hacia atrás y el útero es claramente visible. Usando tijeras quirúrgicas, corte ambos extremos del cuerno uterino. A continuación, retire el útero y colóquelo en la placa de Petri con 1x HBSS. El uso de fórceps de punta recta elimina cuidadosamente los embriones del útero. Deje embriones en HBSS durante todo este proceso. Usando los fórceps o una cuchilla de microtoma, decapitar rápidamente los embriones cortando cerca del cuello. Haciendo un corte lo más nivelado posible. Bajo un microscopio diseccionado, mueva la cabeza de un embrión a una placa petri seca de 50 mm y colóquela en el lado ventral. Estabilice la cabeza con fórceps colocando y penetrando cerca de los ojos/snout. Los fórceps deben inclinarse hacia abajo a 45o para evitar penetrar el mesencéfalo. Usando los fórceps en la otra mano, retire cuidadosamente la capa translúcida de la piel y el cráneo justo antes de la cresta prominente del mesencéfalo. Comience cerca de la línea media y retire la piel y el cráneo caudalmente hasta que el mesencéfalo esté completamente expuesto. Sostenga los fórceps perpendiculares al mesencéfalo expuesto con una punta entre la corteza y el mesencéfalo y la otra cerca del cerebelo. Presione hacia abajo y pellizca los fórceps para quitar todo el cerebro medio. El segmento de cerebro medio debe tener aproximadamente 0,5 mm de espesor. Coloque el segmento de cerebro medio en el segundo plato Petri lleno de 1x HBSS fresco. Repita este proceso para cada embrión. Usando el microscopio de disección, coloque el segmento cerebral con el lado ventral hacia arriba. Si las meninges todavía están unidas, retírela cuidadosamente agarrando con los fórceps y levantando y alejando el segmento cerebral. El segmento cerebral debe tener 4 cuadrantes visibles. Coloque el segmento de tal manera que los dos cuadrantes más pequeños se posicionen superior a los dos cuadrantes más grandes. Hay una cresta prominente que separa los dos (pequeños) cuadrantes superiores de los dos cuadrantes inferiores (grandes). Usando los fórceps pellizcar y separar los cuadrantes superiores de los cuadrantes inferiores, y luego descartar los cuadrantes superiores. Los cuadrantes inferiores restantes tendrán exceso de tejido lateralmente en el lado dorsal, este tejido se verá menos opaco que el tejido ventral restante. Retire el tejido dorsal menos denso y deseche. El segmento restante debe contener tanto la Sustancia nigra pars compacta (SNc) como la zona tegmental ventral (VTA). Usando los fórceps cortar el segmento de tejido ventral restante en 4 piezas más pequeñas y usando una pipeta de diámetro de 1 ml de ancho transfiera estos segmentos en un tubo cónico de 15 ml con 1x HBSS. Mantenga el tubo cónico con segmentos cerebrales sobre hielo durante todo el procedimiento. Repita este proceso para todos los segmentos cerebrales restantes. 4. Disociación de células Digestión enzimática de las células Aspirar cuidadosamente el HBSS del tubo cónico de 15 ml que contiene segmentos de cerebro medio, dejando los segmentos en la parte inferior del tubo. Añadir a la tubo a 800 l de solución de papaína y colocarla en una incubadora de 37oC durante 7 min. Resuspender las células moviendo el tubo y reemplazarlo a la incubadora de 37 oC durante 7 minutos adicionales. Con una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho, retire sólo los segmentos de cerebro medio en una alícuota de 1 ml de DNase. Permita que los segmentos lleguen a la parte inferior de la alícuota o aproximadamente 1 min de exposición. Con una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho, retire sólo los segmentos de cerebro medio en un tubo cónico de 15 ml que contenga 2 ml de solución de parada. Deje que los segmentos se asienten en la parte inferior del tubo y repita el enjuague en un tubo cónico adicional lleno de solución de parada. Trituración mecánica de la suspensión celular En el tubo de enjuague de la segunda solución de parada, utilizando una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo 10 veces hasta que no haya segmentos de tejido grandes visibles. Es importante evitar la trituración excesiva para una mínima lelisis celular. Pipetear lentamente 300 l de 4% de solución de BSA a la parte inferior del tubo cónico de 15 ml que contiene segmentos cerebrales. Retire cuidadosamente la punta de la pipeta para mantener una capa de suspensión. Centrífuga a 0,4 x g durante 3 min. A continuación, aspirar cuidadosamente las células sobrenadantes y resuspendidas en 400 l del medio de cultivo celular. 5. Encote de las células NOTA: Según la experiencia, se recogen alrededor de 100.000 células viables por embrión. 2-3 meses de edad ratones embarazadas con tiempo por lo general tienen tamaños de camada de 8-10 embriones; por lo tanto, una estimación aproximada para el rendimiento total de las células por ratón embarazada cronodado es de aproximadamente 1 millón de células. Usando un hemocicómetro preformar un recuento de células y luego diluir la suspensión a 2.000 células/L utilizando un medio de cultivo celular. Triturar brevemente para mezclar. Retire los cubreobjetos con solución de laminina del paso 2 de la incubadora y aspire la solución de laminina restante de los cubreobjetos recubiertos utilizando un vacío. Placa rápidamente para evitar que los cubreobjetos se sequen por completo. Pipetear 100 l (2,0 x 105 células/cubierta) sobre cada cubreobjetos y colocar los platos de Petri en una incubadora de 37oC durante 1 h. Añadir cuidadosamente 3 ml de medio de cultivo celular a cada plato y colocar de nuevo en la incubadora de 37oC. Preformar medio cambia 2 veces por semana durante 2 semanas. 6. Infección del cultivo celular a 14 DIV con vectores virales adeno asociados (AAV) Para cada plato preparar 1 mL de medio DMEM libre de suero con 1 l de HSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 títulos) Aspirar el medio de cultivo celular de cada plato y reemplazarlo con 1 ml de DMEM libre de suero que contenga hSyn-GCaMP6f. Coloque los platos de nuevo en la incubadora de 37oC durante 1 h. Aspirar el medio libre de suero que contiene AAV y reemplazarlo con 3 ml de medio de cultivo celular. Coloque los platos de nuevo en la incubadora de 37oC. Hemos encontrado que 5-7 días de infección de AAV permite niveles ideales de expresión GCaMP. Continúe cambiando de medio cada 2-3 días durante este período de infección viral. 7. Imágenes en vivo confocal Ca2+ entre 19-21 DIV NOTA: Como se menciona en el paso 6.3, las imágenes se pueden hacer entre 5-7 días después de la infección viral. Esta es la ventana ideal para lograr la expresión visible del fluoróforo a niveles que permiten la detección de actividad espontánea de Ca2+. Preparación de búferes de grabación Para hacer 1 L del búfer de grabación HEPES, agregue: 9.009 g de NaCl, 0,3728 g de KCl, 0,901 g de D-glucosa, 2,381 g de HEPES, 2 ml de solución de stock de 1 M CaCl2 y 500 ml de solución de 1 M MgCl2 a 800 ml de H2O estéril destilado. Llevar a un volumen final de 1 L. Para hacer 200 ml de tampón de grabación de glutamato de 20 m, diluir 40 ml de solución de material de glutamato de 100 ml en 200 ml del búfer de grabación HEPES descrito anteriormente. Para hacer 200 ml de tampón de grabación NBQX de 10 mL, diluir 200 ml de solución de stock NBQX de 10 mM en 200 ml del búfer de grabación HEPES. Imágenes confocales Llene una placa estéril de 35 mm Petri con 3 ml de tampón de grabación. Retire un plato de Petri de 35 mm con cultivos infectados de la incubadora de 37 oC. Usando fórceps de punta fina, agarre cuidadosamente el borde de un cubreobjetos y transfiéralo rápidamente a la placa Petri llena de tampón de grabación. Coloque el cubreobjeto restante en medio de nuevo en la incubadora de 37oC. Transporte el plato con tampón de grabación al microscopio confocal. Inicie el software de imágenes. Continúe con el paso siguiente mientras se inicializa. Inicie la bomba peristáltica y coloque la línea en el búfer de grabación. Calibre la velocidad de flujo a 2 mL/min. Transfiera el cubreobjetos infectado de la placa Petri de 35 mm al baño de grabación. Usando el objetivo de inmersión de agua 10x y la luz BF, busque el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos celulares de neuronas. Cambie al objetivo de inmersión en agua de 40x y utilice la luz BF para reenfocar la muestra. En la ventana “Lista de tintes” dentro de FluoView seleccione AlexaFluor 488 y aplíquelo. La expresión AAV puede ser variable; por lo tanto, con el fin de evitar la sobreexposición y fotoblancada de los fluoróforos, comience con los ajustes de baja potencia HV y láser. Para el canal AlexaFluor 488, establezca el alto voltaje (HV) en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento en 0. Para la línea láser 488, ajuste la potencia al 5%. Con el fin de aumentar el volumen efectivo que se muestra en el plano z, aumente el tamaño del agujero a 300 m. Utilice la opción de escaneo “focus x2” para ajustar de forma óptima las señales de emisión a los niveles de subsaturada. Desde aquí, los ajustes se pueden ajustar hasta que se alcance la visibilidad ideal de cada canal.NOTA: Para capturar con precisión toda la gama de flujos de Ca2+ con GCaMP, ajuste los ajustes de potencia de alta y alta velocidad de referencia para permitir un aumento de la intensidad fluorescente sin sobresaturar el detector. Una vez optimizados los ajustes del microscopio, mueva el escenario para localizar una región con varias células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia GCaMP6f y enfoque al plano deseado para la toma de imágenes. Utilice la herramienta “Clip rect” para recortar el fotograma de imagen a un tamaño que pueda lograr un intervalo de fotogramas de poco menos de 1 segundo. Esto es necesario para establecer el intervalo de imágenes en 1 fotograma por segundo. Establezca la ventana “Intervalo” en un valor de 1,0 y la ventana “Num” en 600.NOTA: Con el fin de entregar diferentes búferes de grabación en el punto de tiempo deseado (300 s), es importante calibrar la latencia de la bomba para entregar la nueva solución al baño. Esto dependerá de la tasa de perfusión de la solución (2 ml/min) y de la longitud de la línea utilizada para bombear la solución. Para capturar una película de la serie t, seleccione la opción “Tiempo” y, a continuación, utilice la opción de escaneo “XYt” para comenzar la creación de imágenes. Observe la barra de progreso de la imagen y mueva la línea desde el búfer de grabación HEPES al búfer de grabación de glutamato de 20 m en el punto de tiempo adecuado (por ejemplo, si la latencia de la bomba está calibrada para entregar la solución a 60 s, mueva la línea al búfer de glutamato a 240 fotogramas para entregar glutamato a 300 s). Cuando finalice la creación de imágenes, seleccione el botón Series Done y guarde la película de la serie t terminada. Continúe perfundiendo 20 M de glutamato durante 5 minutos adicionales, de modo que las neuronas cultivadas hayan estado expuestas al glutamato durante un total de 10 min. Repita este proceso para cada portada que se va a poner en forma. Después de la exposición adicional de 5 minutos al glutamato de 20 m, retire el cubreobjetos del baño y vuelva a colocarlo en la placa Petri de 35 mm que contiene el tampón de grabación hasta que se complete el día de la toma de imágenes. Cuando haya terminado, proceda al paso 8. Análisis de trazas de Ca2+ Realice análisis de imágenes en ImageJ. Instale el plugin BIO-FORMATS para ImageJ, que permitirá . Archivos de imagen OIB para abrir. En la barra de herramientas de ImageJ, haga clic en Analizar . Establezca Medicionesy seleccione el cuadro Valor gris medio (MGV). En ImageJ, abra una película de la serie t como una hiperapila. Arrastre el control deslizante de la película e identifique el fotograma con la máxima respuesta de glutamato para visualizar todas las neuronas que responden al glutamato. Utilice la herramienta poligonal para rastrear todos los cuerpos de células de neuronas visibles, agregando sus ROI a la lista “Administrador de ROI”. Cuando haya terminado de trazar y agregar ROI, seleccione todos los ROI dentro de la ventana ADMINISTRADOR de ROI y utilice la selección Multi medida en la lista más de opciones. Copie y pegue estos datos en una hoja de cálculo. Complete este proceso para que se analicen todas las películas. Para cada ROI, convierta los datos MGV sin procesar de cada fotograma a valores de F/F0 utilizando la ecuación: .F/F0 – [F(t) – F0] / F0. Donde F(t) – MGV de cualquier trama dada, y F0 – MGV de línea de base promedio de 10 fotogramas donde no hay flujos de Ca2+. Utilizando un software estadístico como OriginPro 2020, las trazas convertidas de la serie de datos F/F0 se pueden convertir en gráficos de líneas. La función “Analizador de picos” se puede utilizar (o una función similar si se utiliza un software diferente) para medir la amplitud máxima de la respuesta glutamato, la latencia para responder al glutamato y el área debajo de la curva. 8. Inmunostaining of cultures NOTA: Después de la fijación con formalina, los cubreobjetos se pueden almacenar en 1x PBS a 4 oC hasta que estén listos para ser procesados para inmunosuqueo. La incubación de anticuerpos primarios y secundarios se realizó en serie, ya que dicha incubación con anticuerpos primarios anti-Caspase-3 y su anticuerpo secundario complementario precedió a la incubación con el anticuerpo primario anti-TH y su anticuerpo secundario complementario. Inmediatamente después de la exposición al glutamato, vuelva a colocar el cubreobjetos en su plato Petri de 35 mm, aspire el tampón de grabación y agregue 3 ml de 10% de formalina. Dejar reposar durante 40 minutos a temperatura ambiente (RT). Enjuague el plato 3 veces con 1x PBS. Aspirar el PBS y permeabilizar las células en 1 ml de 0.01% Tritón X-100 en PBS durante 2 min. Enjuague el plato 3 veces con 1x PBS. Aspirar el PBS y bloquear las células en 1 ml de 10% NGS en PBS durante 40 min. Enjuague el plato 3 veces con 1x PBS. Añadir 1 l de anticuerpo primario anti-Caspasa-3 de conejo a 1 ml de 1% NGS en PBS (1:1000 dilución). Aspirar PBS del plato y reemplazarlo con la solución primaria de anticuerpos. Colocar en una coctelera e incubar durante 1,5 h en RT. Enjuague el plato 3 veces con 1x PBS. Añadir 1 l de anticuerpo secundario de cabra anti-conejo AlexaFluor 488 a 1 mL de 1% NGS en PBS (1:1000 dilución). Aspirar PBS del plato y reemplazarlo con la solución de anticuerpos secundaria. Colocar en una coctelera e incubar durante 1 h en RT. En movimiento hacia adelante proteger las muestras de la luz. Enjuague el plato 3 veces con 1x PBS. Repita los pasos 8.7 – 8.10, pero utilizando el anticuerpo primario anti-TH de pollo (1:1000) en el paso 8.7 y el anticuerpo secundario anti-pollo de cabra AlexaFluor 594 (1:1000) en el paso 8.9. Después del enjuague final de PBS, coloque 30 ml de medio de montaje en una diapositiva del microscopio. Usando fórceps agarra un cubreobjetos de la placa Petri de 35 mm y coloca el cubreobjetos con las celdas hacia abajo en el medio de montaje. Ambos cubreobjetos caben en una sola diapositiva de microscopio si se colocan correctamente. Colocar en un área seca y oscura y dejar que el medio de montaje se seque durante la noche. 9. Imágenes confocales de cultivos inmunosutenidos Imágenes confocales Inicie el software de imágenes. Coloque la muestra en la etapa del microscopio. Con los oculares del microscopio, utilizando un objetivo de aumento de 20x y una luz epifluorescente con un filtro TRITC, enfoque la muestra y busque un cuerpo celular TH+. Una vez localizado un cuerpo de celda TH+, centralo en el campo de visión y, a continuación, muévete al objetivo de ampliación de 60x. Seleccione los tintes AlexaFluor 488 y AlexaFluor 594 en la ventana “lista de tintes”. Al igual que con las imágenes en vivo, comience con ajustes de baja potencia hv, ganancia, desplazamiento y potencia láser para evitar el fotoblancada. Utilice la opción de escaneo “focus x2” para evaluar la intensidad fluorescente de cada canal y ajustar en consecuencia. Como estas imágenes se cuantificarán más adelante para la intensidad fluorescente, es necesario mantener la configuración de imágenes coherente en todos los campos de visión. Por lo tanto, es mejor mirar algunos ejemplos de cada condición para hacerse una idea de la gama de intensidad fluorescente entre las muestras. Una vez que se determinen los ajustes de imagen ideales, seleccione la opción de escaneo “focus x2” y mueva la celda de interés al centro del campo de visión. Aumente el zoom digital a 3x usando el control deslizante “zoom”. Usando la perilla de enfoque, busque el plano de enfoque con la fluorescencia más brillante y capture una sola imagen XY de plano. Guarde la imagen para finalizar. Vuelva al objetivo de ampliación de 20x para buscar otra celda TH+. Repita este proceso hasta que se haya muestreado el número deseado de celdas de cada condición. Análisis de imágenes En la barra de herramientas de ImageJ, haga clic en Analizar . Establezca Medidasy seleccione los cuadros Para El valor de Área, Densidad integrada y Gris medio. Abra una imagen como una hiperapila con cada canal separado arrastrando y soltando en la barra de herramientas de ImageJ o seleccionando la imagen a través del menú de archivos. Utilice el canal TH (594 nm) para dibujar ROI alrededor del cuerpo de la célula. Con la herramienta de trazado de polígonos en ImageJ, trace de cerca el borde exterior del cuerpo de la celda. Cuando la distancia entre la membrana celular y el núcleo celular es la más pequeña, traza una línea recta a través del citosol hasta el borde del núcleo y luego sigue de cerca el contorno del núcleo para excluirlo. A continuación, trace una línea recta de vuelta a la membrana externa, bordeando la línea inicial lo más cerca posible, y continúe siguiendo el contorno del cuerpo celular hasta que el ROI esté completo. Usando el atajo de teclado “T” o usando la ruta del menú de la barra de herramientas Analizar . Herramientas ? ROI Manager, abra el gestor de ROI y agregue el ROI que se acaba de dibujar a la lista. Seleccione la ventana del canal caspase-3 (488 nm) y, a continuación, seleccione el ROI agregado en la lista “ADMINISTRADOR DE ROI”. En la ventana Administrador de ROI, seleccione el botón Medir. La ventana de resultados aparecerá con las medidas establecidas anteriormente. Copie estos en una hoja de cálculo y repita este proceso para cada celda.