Здесь мы представляем протокол для измерения потока in vitro Ca2 “в нейронах среднего мозга и их вниз по течению воздействия на каспазы-3 с использованием первичных культур среднего мозга мыши. Эта модель может быть использована для изучения патофизиологических изменений,связанных с аномальной активностью Ca 2 в нейронах среднего мозга, и для проверки новых терапевтических средств на антиапоптотические свойства.
Болезнь Паркинсона (PD) является разрушительным нейродегенеративным расстройством, вызванным дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов. Чрезмерный приток Ca2 “из-за ненормальной активации рецепторов глутамата приводит к возбудимости DA и был определен в качестве важного механизма для потери нейронов DA. В этом исследовании мы изолировали, диссоциативные и культурные нейроны среднего мозга от мышей брюшной мезенцефалон (VM) эмбрионов мыши ED14. Затем мы заражаем долгосрочные первичные культуры среднего мозга мыши адено-ассоциированным вирусом (AAV), выражают генетически закодированный индикатор кальция, GCaMP6f под контролем человека нейрон-специфический синапсин промоутер, hSyn. Используя живую конфокаловую визуализацию, мы показываем, что культурные нейроны среднего мозга мышиотображают спонтанные потоки Ca 2, обнаруженные AAV-hSyn-GCaMP6f. Ванна применение глутамата к середине мозга культур вызывает аномальныевысоты во внутриклеточных Ca 2 “в нейронах, и это сопровождается активацией каспазы-3 в нейронах DA, как показано на иммуностимулятора. Методы для выявления глутамата опосредованного апоптоза в первичных нейронов мыши DA имеют важное применение для высокого содержания скрининга препаратов, которые сохраняют здоровье нейронов DA.
Болезнь Паркинсона (PD) является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным расстройством во всем мире, без известного лечения. Оценки показывают, что распространенность PD будет продолжать расти и, по оценкам, превысит 1 миллион диагнозов к 2030 году только в Соединенных Штатах1. С несколькими эффективными методами лечения в настоящее время доступны для борьбы с PD, существует настоятельная необходимость разработки более эффективных методов лечения. PD характеризуется быстрой и прогрессирующей потерей среднего мозга допамина (DA) нейронов2. Механизмы, которые лежат в основе нейродегенерации в PD плохо изучены. Фактические данные свидетельствуют о вероятном сближении нескольких механизмов, таких как окислительный стресс и митохондриальная дисфункция и т.д., которые способствуют началу апоптотических сигнальных каскадов и возможной гибеликлеток 3.
Один из таких конвергентных механизмов, глутамат-опосредованная возбудимость была вовлечена в несколько нейродегенеративных заболеваний, в том числе PD4. В то время как глутамат-опосредованная возбудимость, как полагают, работает главным образом через стимуляцию рецепторов NMDA через чрезмерное увеличение внутриклеточной концентрации Ca2 “и в конечном итоге начало апоптоза, Ca2″-проницаемые рецепторы АМРА также были вовлечены в ацитотоксичныйответ 5,6,7. Таким образом, представляет интерес для определения вклада рецепторов АМРА в глутамат-опосредованного апоптоза в модели PD. Это может быть достигнуто с помощью NB’X, блокатор аМРА и кайнат, который при концентрациях микромоляров является селективным для рецепторовАМРА 8. Глутамат-опосредованная возбудимость и апоптотические сигнальные каскады являются идеальной целью ниже по течению для измерения степени гибели клеток и потенциальной мишенью для терапевтического вмешательства. Таким образом, разработка метода высокого содержания для оценки глутамата опосредовано модуляции активности кальция и связанных вниз по течению сигнализации в первичных брюшной мезенцефалической (VM) нейронов будет иметь важное место для скрининга новых методов лечения на их способность сохранить здоровье нейронов.
Здесь мы разработали протокол, в котором мы выражаем генетически закодированный индикатор кальция (GECI), GCaMP6f, используя AAV2/5 с человеческим синапсином (hSyn) продвигателем для измерения ca2 “активность мыши VM первичных нейронов в ответ на применение глутамата, которые могут быть измерены на физиологическом и молекулярном уровне. Этот скрининг с высоким содержанием может быть адаптирован для открытия фармацевтических препаратов илиметодов лечения, которые модулируют активность Ca 2 , чтобы сохранить здоровье нейронов VM. Мы предлагаем, что эта основная модель культуры является эффективным способом проверки для новых мероприятий PD, на основе их способности сохранять здоровье нейронов VM и смягчить прогрессирование PD.
Мы описываем долгосрочную первичную систему начальной брюшной мезенцефалии (VM) клеточной культуры для анализа высокого содержания апоптоза глутамата в нейронах. Исследования использовали первичные среднебрайн дофаминергические культуры, чтобы прояснить экзцитотоксичные механизмы в контексте моделей PD11,12. В этом исследовании мы используем комбинаторный подход с использованием генетически закодированных индикаторов кальция (GECIs) для измерения активности Ca2 и далее связываем эту активность с молекулярными изменениями ниже по течению, такими как инициирование апоптотических сигнальных каскадов4. Метод имеет множество преимуществ перед другими аналогичными системами клеточной культуры. Поскольку у нас есть особый интерес к excitotoxicity в контексте болезни Паркинсона, использование первичных культур VM клеток является идеальным. Используя различные методы перемещения поля, такие как сетчатые крышки или моторизованной стадии микроскопа XY в сочетании с TH иммуностимуляторов, мы можем непосредственно изучить клеточный тип конкретных эффектов глутамата опосредованного апоптоза в брюшной середине нейронов. Кроме того, 3-недельная модель клеточной культуры позволяет нейронам развивать их полный, зрелый молекулярный профиль, отражающий взрослые нейроны DA9. Предыдущие методы в основном сосредоточены на молекулярных изменений после глутамата опосредованнойвозбудимости 13,14. Модель уникальна своей способностью соотносить острые изменения в физиологии нейронов с молекулярными событиями ниже по течению в выявленных типах клеток. Одним из ограничений первичной модели культуры является то, что метод вскрытия захватывает весь брюшной мидбрайн, в том числе DA и ГАМК нейронов, а также нейронов из SNc и VTA. Фактические данные в настоящее время свидетельствует о том, что DA нейронов SNc имеют селективную уязвимость к кальцию и возможной смерти клеток по сравнению с DA нейронов соседних VTA15. К сожалению, дифференциация SNc от VTA нейронов в эмбриональных культурах оказалось трудно с несколькими анатомическими ориентирами, чтобы определить эти структуры в эмбриональном мозге.
Мы демонстрируем, что метод первичной культуры позволяет количественно оценить неоднородную спонтанную активность Ca2 (рисунок 1). Таким образом, это идеальная модель системы клеточной культуры для изучения тонально активных клеток, таких как кардиостимуляторы дофаминергических нейронов среднего мозга, неокортические нейроны, и ГАМК-нейронов супрахиазматического ядра (SCN)16,17. В большинстве применений, Ca2 “изображения не достигает того же временного разрешения, как электрофизиология. Таким образом, вполне вероятно, что одно событие Ca2 “аналогична всплеску нейронных потенциалов действия. Это может быть истолковано как означает, что Ca2 “изображение позволяет относительно точные измерения аномальной разрыва активности в клетках pacemaking и, следовательно, подходит для высокого содержания экрана Ca2″ –опосредованное возбуждение смерти клеток.
Для достижения и поддержанияспонтанной активности Ca 2 важно рассмотреть два ключевых момента в протоколе. Во-первых, это плотность покрытия клеток после вскрытия. Для первичных нейронов VM, предыдущие исследования использовали около 100000 клеток /см 29,10. Мы адаптировали протокол к пластине плотность 200000 клеток / см2, что создает неоднородный диапазон спонтанной активности и увеличивает количество дофаминергических нейронов VM присутствует на каждом coverslip. Поскольку различные нейроны кардиостимуляторов имеютразличные свойства стрельбы 16, плотность покрытия должна быть настроена на клеточный тип изучается и оптимизирована для того, чтобы достичь идеального уровня спонтанной активности. Во-вторых, инкубацио время после вирусной инфекции AAVs. Как и плотность покрытия, это будет зависеть от конкретного контекста исследовательского вопроса и типа используемого AAV. Для конкретных AAV используется здесь, 5 дней инкубации после вирусной инфекции идеально подходит для достижения желаемого уровня экспрессии белка, что позволяет для динамических изменений в флуоресценции GCaMP для того, чтобы записать Ca2 “активности. Многие факторы определяют, насколько быстро и эффективно AAV будет выражать свой груз, большая часть которого выходит за рамки данного метода, но вкратце важно учитывать промоутерскую активность и скорость созревания и складки грузового белка.
Еще одним преимуществом метода является то, что он обеспечивает значительную гибкость в формате, векторах выражения, использовании оборудования для визуализации и спектре научных вопросов, которые могут быть решены. Кроме того, метод позволяет изучать широкий спектр конкретных вопросов, которые окружают глутамат-опосредованную возбудимость в PD, и другие модели дисфункции нервной системы. Например, глутамат-опосредованная возбудимость включает в себя несколько рецепторов и сигнальные каскады5. С помощью метода, и, как попродемонстрировано с блокатором AMPAR, NB’X на рисунке 1, можно вскрыть конкретные компоненты возбудимой реакции глутамата на физиологическом и молекулярном уровне. Предположительно, аналогичный подход с использованием ингибиторов систем второго посланника может быть использован для определения их вклада в возбуждение. Кроме того, ААВ, используемые здесь, могут быть адаптированы для выражения ГЕКИ с клеточными промоутерами или оптогенетическими датчиками, которые могут быть использованы для измерения других параметров, таких как высвобождение нейромедиатора.
Помимо первичных эмбриональных вскрытий и конфокальной визуализации, большая часть протокола использует базовые лабораторные навыки, которые не требуют специальной подготовки. Таким образом, ограничения модели включают сложность метода эмбрионального вскрытия, продолжительность времени, в течение которого клетки должны быть отучены для достижения зрелости, и доступ к конфокальному микроскопу или аналогичному аппарату визуализации. Многие преимущества и гибкость метода перевешивают эти ограничения, что делает это идеальной моделью для изучения роли глутамата опосредовано excitotoxicity в расстройствах нервной системы. Наконец, эта модель может быть эффективным инструментом для проверки новых соединений для анти-апоптотических эффектов и их способность сохранять здоровье нейронов DA.
The authors have nothing to disclose.
Поддерживается грантами Американской ассоциации болезни Паркинсона (APDA) и NIH R01NS115809-01 для RS. Мы благодарим Техасский институт геномной медицины (TIGM) за предоставление время беременных мышей для создания первичных дофаминергических культур.
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |