Verbeterde UPLC-UV-methode voor de kwantificering van vitamine C in sla variëteiten(Lactuca sativa L.) en Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

1. Plantaardige materiaalpreparaat Monster ten minste twee bladeren per plant in 50 mL polypropyleenbuizen, een buitenste (oudere) en een binnenste (jongere) om de hele plant nauwkeuriger weer te geven. Verzamel ten minste drie biologische replica’s voor elk monster. Bevries ze onmiddellijk met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C tot gebruik. Zorg ervoor dat de vloeibare stikstof niet in de buizen komt; anders kunnen ze ontploffen wanneer ze worden verwijderd als gevolg van de gasuitbreiding tijdens de verdamping.LET OP: Handschoenen en een gezichtsschild zijn vereist vanwege de mogelijke gevaren die gepaard gaan met het gebruik van vloeibare stikstof. Haal de doppen uit de buizen en leg ze op de trays in de vriesdrogerkamer van de lyofielieverband (Tabel van materialen) geprogrammeerd als volgt: -25 °C voor 72 uur, -10 °C gedurende 10 uur, 0 °C voor 10 uur en 20 °C gedurende ten minste 4 uur. Houd de condensortemperatuur en de vacuümconstante tijdens het vriesdroogproces op respectievelijk -80,2 °C en 112 mTorr. Wanneer het materiaal volledig droog is (tussen 4 en 7 dagen, afhankelijk van de plant en de mate van verdichting in de buis), bewaar dan bij respectievelijk 4 °C, -20 °C of -80 °C (dagen tot weken), medium (maanden) of lange (jaren) opslag. Het is raadzaam zakken met silicagelkralen in de monsterhoudende buizen op te nemen. Plaats de gelyofilifiseerde monsters in 20 mL polypropyleen buizen samen met 10 mm diameter roestvrijstalen ballen en maal ze met een multitube vortexer met behulp van de intensiteit en tijd die nodig is om een fijn stof te verkrijgen.OPMERKING: Bescherm de monsters tijdens het hele proces tegen blootstelling aan direct licht. 2. Reagens en oplossingsvoorbereiding Bereid de oplosmiddelextractieoplossing voor: 8% azijnzuur (v/v), 1% MPA (metafos fosforzuur) (w/v), 1 mM EDTA (ethyleenediaminetetraacetisch zuur). Bereken het totale volume oplosmiddel dat nodig is om de hele set monsters te verwerken, rekening houdend met het feit dat er 5 mL aan elk wordt toegevoegd. Om 1 L van de oplossing te bereiden, voeg je toe aan een kolf: 30 g MPA, 0,372 g EDTA-uitdrogen, 80 mL azijnzuur en 500 mL ultrazuiver water (schaalvolumes en hoeveelheden dienovereenkomstig). Sluit de kolfmond af met plastic folie. Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, gebruik een volumetric fles om nauwkeurig te meten 1 L, het toevoegen van de nodige ultrazuiver water. Bereid de reductiereactiebuffer (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propaandiol) pH 9.0) en reduceeroplossing (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) met 0,5 M Tris pH 9.0). Bereken het totale volume van de reducerende oplossing die nodig is om de hele set monsters te verwerken, rekening houdend met het feit dat er 200 μL aan elk van deze μL wordt toegevoegd. Om 100 mL van de buffer voor te bereiden, voegt u toe aan een beker: 6.055 g Tris en 90 mL ultrazuiver water (schaalvolumes en hoeveelheden dienovereenkomstig). Sluit de bekermond af met plastic folie. Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, pas de oplossing aan op pH 9.0 door 2 M HCl toe te voegen en gebruik een volumetrische kolf om nauwkeurig 100 mL te meten, waarbij het nodige ultrazuiver water wordt toegevoegd. Om 100 mL van de reduceeroplossing voor te bereiden, voegt u toe aan een beker: 0,629 g DTT (zuiverheid: 98%) en 90 mL van de buffer (0,5 M Tris pH 9.0) eerder voorbereid (2.2.1 tot 2.2.2). Schaal volumes en hoeveelheden dienovereenkomstig. Sluit de bekermond af met plastic folie. Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, gebruik een volumetric kolf om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige volume van buffer 0,5 M Tris pH 9.0.LET OP: De reducerende oplossing is zeer instabiel. Daarom wordt een vers gemaakte oplossing sterk aanbevolen. Zwavelzuur (0,4 M H2SO4) Bereken het totale volume van 0,4 M zwavelzuur dat nodig is om de hele set monsters te verwerken, rekening houdend met het feit dat er 200 μL aan elk wordt toegevoegd. Om 100 mL van de oplossing voor te bereiden, voeg toe aan een beker: 80 mL ultrazuiver water en vervolgens 2,22 mL H2SO4 (zuiverheid: 96%, dichtheid: 1,84 g mL-1). Gebruik een volumetrische kolf om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige ultrazuiver water.LET OP: Zwavelzuur is zeer corrosief, dus het moet worden behandeld met behulp van beschermende apparatuur en onder de motorkap. Bovendien moet het zuur worden toegevoegd aan ultrazuiver water, en niet water aan zuur, om dampen te verminderen en ongevallen te voorkomen. Zoutzuur (2 M HCl). Om 100 mL zoutzuur van 2 M voor te bereiden, voeg toe aan een beker: 80 mL ultrazuiver water en vervolgens 6,13 mL HCl (zuiverheid: 37%, dichtheid: 1,19 g mL-1). Sluit de bekermond af met plastic folie. Gebruik een volumetrische kolf om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige ultrazuiver water. Schaal volumes dienovereenkomstig.LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief, dus het moet worden behandeld met behulp van beschermende apparatuur en onder de motorkap. Bovendien moet het zuur worden toegevoegd aan ultrazuiver water, en niet water aan zuur, om dampen te verminderen en ongevallen te voorkomen. AA-norm (voorraad en verdunningen) Weeg precies 10 mg AA-standaard (zuiverheid: 99%) met behulp van een precisiebalans en voeg 90 mL mobiele fase (ultrazuiver water pH 2.0 met mierenzuur). Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, gebruik een volumetric fles om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige volume van ultrazuiver water pH 2.0 met mierenzuur.LET OP: Bescherm deze voorraadoplossing tegen blootstelling aan licht. Bereid vijf verdunningen uit de voorraad van de AA-norm voor om een kalibratiecurve te verkrijgen volgens de instructies in tabel 1 en ga verder met stap 5.2. Standaard [AA] (μg mL-1) AA (100 μg mL-1)oplossing (μL) Mobiele fase (μL)een 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 a. Ultrazuiver water pH 2.0 verzuurd door mierenzuur. Tabel 1: Protocol voor de voorbereiding van vijf normen van AA (ascorbinezuur). Volumes van oplosmiddel en oplosmiddel om elk van de verschillende concentraties van de normen voor te bereiden worden aangegeven. 3. Extractie van AA en DHAA LET OP: Het wordt aanbevolen om te werken onder omstandigheden met weinig licht intensiteit tijdens de extractiestappen. Voeg aan een polypropyleencentrifugebuis van 15 mL 50 mg lyofiel grondmonster en 5 mL van het extractieoplosmiddel toe (stap 2.1). Schud het mengsel met behulp van een vortex voor 5 s en vervolgens een orbitale shaker voor 10 min bij 2000 rpm. Introduceer de buis in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten op kamertemperatuur met echografie geactiveerd. Centrifuge bij 4.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Neem de supernatant, geef het door een 0,22 μm geregenereerd cellulosefilter en bewaar het in een 5 mL amber flacon. Dit is Extract 1, dat AA en DHAA bevat.OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken door de extracten bij -80 °C te bevriezen en hen te beschermen tegen blootstelling aan licht, aangezien AA en DHAA zeer instabiel zijn en gemakkelijk degraderen in aanwezigheid van licht, bij hoge temperaturen of onder oxiderende atmosferen(supplementisch bestand 1). 4. DHAA-reductie naar AA om TAA te extraheren Breng 200 μL extract 1 over naar een 2 mL amberblad voor vloeibare chromatografie en voeg 200 μL van de reduceeroplossing toe (stap 2.2). Sluit de flacon met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en schud het met een vortex voor 5 s. Laat de oplossing 30 minuten op kamertemperatuur staan en bescherm tegen licht. Voeg 200 μL 0,4 M H2SO4 toe om de reactie te stoppen en AA te stabiliseren in zure pH. De resulterende oplossing is Extract 2, die alleen AA bevat en eigenlijk TAA is. 5. Vaststelling UPLC-UV voorbereiding Bereid de in tabel 2beschreven werkoplossingen voor, op passende wijze gefilterd door 0,22 μm filters, gesoond gedurende ten minste 10 minuten en plaats ze in het UPLC-systeem. Schakel de drie UPLC-modules in en wacht tot het interne kalibratieproces is voltooid. Open de software (bijvoorbeeld Empower 3) en laad het in tabel 2beschreven instrumenteel programma : Empower 3 | Monsters uitvoeren | Vitamine C-methode | UPLC_PDA | Gebruik QuickStart. Zodra de software is geladen met het juiste programma, toegang tot de UPLC management console: Quaternary Solvent Manager | Klik met de rechtermuisknop | Console starten. Overgaan tot de voorbereiding en stabilisatie van het UPLC-instrument: Systeem | Controle | Opstarten. Alle UPLC-lijnen gedurende ten minste 5 min zuiveren: Prime Solvents | QSM | Controleer A, B, C, D en Seal Wash | Duur van priemgetal > 5 min. Zuiveren en reinigen van de injector: Prime Solvents | SM | Controleer Wasmiddel (> 45 s) en Controleer purge oplosmiddel (> 35 cycli). Equilibrate UPLC aan methodevoorwaarden: Equilibrate aan Methode | QSM | Stroom (0,3 m L min-1) | Oplosmiddel A (2%) | Oplosmiddel B (0%) | Oplosmiddel C (98%) | Solvent D (0%); Evenwicht met de methode | SM | Monster (5 °C) | Kolom (30 °C) en Equilibrate naar methode | Overige | Lamp controleren | Druk op Start. Wacht minstens 1 uur (nog meer tijd wordt aanbevolen) voor de apparatuur te stabiliseren. Stabiliteit kan worden gecontroleerd bij het controleren van de druk in de kolom in de startconsole: Systeem | Quaternaire oplosmiddelbeheerder | QSM-systeemdruk. Zorg ervoor dat er geen identificeerbare trends zijn in drukveranderingen (stijgt of daalt) en dat de deltawaarde minder dan 10 psi bedraagt. Vul in het QuickStart-scherm de matrix met de namen van de te analyseren standaarden en monsters. AA bepaling in de normen Breng 1 mL van elk van de vijf eerder voorbereide AA-normen (stap 2.5.3) over op 2 mL amberfol flacons voor vloeibare chromatografie. Sluit het flesje met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en injecteer 5 μL in het UPLC-instrument. Voer de chromatografie uit volgens de in tabel 2 beschreven procedure, uitgaande van de meest verdund tot meest geconcentreerde. AA bepaling in de monsters Pipette 200 μL extract 1 in een 2 mL amberfuit voor vloeibare chromatografie en voeg 800 μL ultrazuiver water toe. Sluit het flesje met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en injecteer 5 μL in het UPLC-instrument. Voer de chromatografie uit volgens de procedure van tabel 2. TAA bepaling in de monsters Voeg 400 μL ultrazuiver water toe aan Extract 2. Sluit het flesje met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en injecteer 5 μL in het UPLC-instrument. Voer de chromatografie uit volgens de procedure van tabel 2. Componenten en parameters Beschrijving Instrument Vrijspraak UPLC H-Klasse Detector PDA eλ Detector λabs voor AA=245 nm Software Empower 3 Kolom Vrijspraak UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) Kanaal A CH3OH Kanaal B/Wash H2O:CH3OH (50:50 v:v) Kanaal C Ultrazuiver water pH 2.0 verzuurd door mierenzuura Kanaal D/Seal Wash Ultrazuiver water:acetonitril (90:10 v:v) Mobiele fase 0,3 mL min-1 van 2%A + 98%C (isocratische modus) Kolomtemperatuur 30 °C Autosampler temperatuur 5 °C Injectievolume 5 μL AA retentietijd 1.874 min Looptijd 3 min a. Onbepaald volume mierenzuur gebruikt tot pH-aanpassing Tabel 2: Chromatografische procedure geoptimaliseerd om AA (ascorbinezuur) te bepalen in extracten van sla en wilde verwanten. Beschrijving van de gebruikte componenten, voorwaarden en oplossingen. 6. Kwantificering van AA en DHAA Statistische analyse Bepaal de analytische parameters van de chromatografische methode zoals beschreven door Bertolín et al.18 (tabel 3).OPMERKING: De waarden van de parameters die in tabel 3 worden weergegeven, moeten onder specifieke experimentele omstandigheden worden gedefinieerd. Analytische parameters van de methode Waarden Lineair bereik (μg mL-1) 0.5-25 Lineaire vergelijking y=53.143,03x R2. 0.99998 Detectielimiet (mg AA g-1 van droge stof) 0.013 Limiet van kwantificering (mg AA g-1 van droge stof) 0.045 Herhaalbaarheid (CV, %)een 1.75 Tussentijdse precisie (CV, %)een 4.22 Herstel (Rec, %)b 95±2,4 a. CV: variatiecoëfficiënt b De hersteltest werd uitgevoerd met 10 aliquots die 50 mg van hetzelfde monster bevatten, 5 verrijkt met 2 mg AA g-1 droge stof en 5 niet-spiked. %Rec=([AA]spiked sample-[AA]sample)/(AA]spiked)x100. Tabel 3: Geoptimaliseerde analytische parameters voor de detectie en kwantificering van AA (ascorbinezuur) en TAA (totaal ascorbinezuur). Het lineaire bereik, de vergelijking en de bepalingscoëfficiënt van de kalibratiecurve (R2),evenals de grenzen van detectie en kwantificering van AA (hetzelfde voor TAA), en de herhaalbaarheid, tussenprecisie en terugwinning werden verkregen met een monsterinjectievolume van 5 μL. Bereken de AA- en TAA-concentratie. Open de standaard- en monsterchromatogrammen: QuickStart | Browse Project | Kanalen | “naam van de norm of het monster” | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm. Integreer de overeenkomstige piek (AA of TAA) in de normen en monsters door op het startpunt (ongeveer 1.790 min) te klikken en deze met de muis naar het eindpunt (ongeveer 1.910 min) te slepen. Bouw een kalibratiecurve die de chromatografisch bepaalde absorptiewaarden (stap 5.2.) vertegenwoordigt tegen de concentratie van de vijf hierboven voorbereide AA-normen (tabel 1). Interpoleer de absorptiewaarden van de in de stappen 5.3 en 5.4 vastgestelde monsters en verkrijg de AA- en TAA-concentratie met de volgende formule:wanneer y het geïntegreerde piekgebied is, is x de AA- of TAA-concentratie in ppm en m en n respectievelijk de helling en de y-interceptievan de verkregen regressielijn. Voor de berekening van de concentratie van DHAA de volgende formule toepassen:OPMERKING: Om de totale concentraties van de DHAA, AA en TAA in mg g-1 droog gewicht te verkrijgen, moeten de waarden die rechtstreeks in de kalibratiecurve worden verkregen, worden vermenigvuldigd met het totale extractvolume en de toegepaste verdunningsfactor, en vervolgens worden gedeeld door het gewicht van het monster dat wordt gebruikt om de extractie uit te voeren.