改进的 UPLC-UV 方法，用于在莱图斯品种（Lactuca sativa L.）和作物野生亲亲（Lactuca spp.） 中对维生素 C 进行定量化

1. 植物材料制备 每个植物在 50 mL 聚丙烯管中至少采样两片叶子、一个外侧（较旧）和一个内部（较年轻）的叶子，以便更准确地表示整个植物。每个样品至少收集三个生物复制。 立即使用液氮冷冻，并将其储存在-80°C，直到使用。确保液氮不会进入管中;否则，由于蒸发过程中气体膨胀，它们在去除时可能会爆炸。注意：由于使用液氮的潜在危险，需要手套和面罩。 从管中取出管盖，放在冻干机（材料表）冷冻干燥器的托盘上，编程如下：-25 °C，72小时，-10°C，10小时，0°C，10小时，20°C，至少4小时。在冷冻干燥过程中，分别保持 -80.2 °C 和 112 mTor 的冷凝器温度和真空常数。 当材料完全干燥（根据植物和压实到管中的程度，在4至7天之间），分别储存在4°C、-20°C或-80°C，分别进行短期（数周至数周）、中（月）或长（年）储存。建议将含有硅胶珠的袋子加入含样品管中。 将冻干样品放入 20 mL 聚丙烯管中，并放入直径为 10 mm 的不锈钢球中，并使用获得细尘所需的强度和时间用多管涡流器研磨。注：在整个过程中，保护样品免受直接光线照射。 2. 试剂和溶液制备 准备溶剂萃取溶液：8%醋酸（v/v）、1%MPA（元磷酸）（w/v）、1 mM EDTA（乙酰胺四乙酸）。 计算处理整个样品所需的溶剂总量，同时考虑每个样品中将添加 5 mL。要准备溶液的 1 L，请加入一个烧瓶：30 克 MPA、0.372 g EDTA 脱水、80 mL 醋酸和 500 mL 超纯水（相应缩放体积和数量）。用塑料薄膜密封烧瓶口。 在磁力搅拌器的帮助下溶解后，使用体积烧瓶精确测量 1 L，加入必要的超纯水。 准备还原反应缓冲液（0.5M Tris（2-氨基-2-（羟基甲酰）-1，3-丙烷二醇）pH 9.0）和还原溶液（40 mM DTT（1，4-二磷酸酯），含0.5 M三叶酸pH 9.0）。 计算处理整个样品集所需的还原溶液的总量，同时考虑每个样本将添加 200 μL。要准备 100 mL 的缓冲液，请加入烧杯：6.055 g Tris 和 90 mL 的超纯水（相应缩放体积和数量）。用塑料薄膜密封烧杯口。 在磁力搅拌器的帮助下溶解后，通过添加 2 M HCl 将溶液调整为 pH 9.0，并使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。 要准备 100 mL 的还原溶液，请加入烧杯：0.629 g DTT（纯度：98%）和 90 mL 的缓冲液 （0.5 M Tris pH 9.0） 之前准备的 （2.2.1 到 2.2.2）。相应地缩放数量和数量。用塑料薄膜密封烧杯口。 一旦在磁力搅拌器的帮助下溶解，使用体积烧瓶精确测量 100 mL，添加必要的缓冲液 0.5 M Tris pH 9.0。注：还原解决方案非常不稳定。因此，强烈建议使用新制作的解决方案。 硫酸 （0.4 M H2SO4） 计算处理整组样品所需的 0.4 M 硫酸总量，同时考虑每个样品将添加 200 μL。要准备100 mL的溶液，加入一个烧杯：80 mL的超纯水，然后2.22 mL的H2SO4（纯度：96%，密度：1.84 g mL-1 。使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。注意：硫酸具有很强腐蚀性，因此必须使用防护设备和发动机罩进行处理。此外，酸应添加到超纯水中，而不是水添加到酸，以减少烟雾，避免事故。 盐酸（2 M HCl）。 要准备 100 mL 的 2 M 盐酸，加入烧杯：80 mL 的超纯水，然后 6.13 mL 的 HCl（纯度：37%，密度：1.19 gmL-1）。用塑料薄膜密封烧杯口。使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入必要的超纯水。相应地缩放卷。注意：盐酸具有很强的腐蚀性，因此必须使用防护设备和引擎盖下进行处理。此外，酸应添加到超纯水中，而不是水添加到酸，以减少烟雾，避免事故。 AA 标准（库存和稀释） 重量正好为 10 毫克 AA 标准（纯度：99%）使用精密平衡，并添加 90 mL 的移动相（超纯水 pH 2.0 与甲酸）。 在磁力搅拌器的帮助下溶解后，使用体积烧瓶精确测量 100 mL，加入所需的超纯水 pH 2.0 与甲酸。注：保护此库存溶液免受光线照射。 准备从 AA 标准库存中稀释五个，以便按照表 1 中的说明 获得校准曲线 ，然后继续执行步骤 5.2。 标准 [Aa]（μg mL-1） AA （100 μg mL-1） 溶液 （μL） 移动相位 （+L）a 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 a超纯水pH2.0由甲酸酸化。 表1：制定五项AA标准（抗坏血酸）的协议。 指示用于准备每个不同浓度标准的溶质和溶剂的体积。 3. 提取AA和DHAA 注：建议在提取步骤中低光照强度条件下工作。 在 15 mL 聚丙烯离心管中，加入 50 毫克冻干接地样品和 5 mL 萃取溶剂（步骤 2.1）。 使用涡流摇动混合物 5 秒，然后在转速为 2000 rpm 时摇动轨道摇床 10 分钟。 在室温下用超声波激活，将管子引入超声波浴中10分钟。 在 4，000 x g 下离心 10 分钟，在 4 °C 下。 以上清液，通过0.22μm再生纤维素过滤器，并将其存储在5 mL琥珀小瓶中。这是包含 AA 和 DHAA 的提取 1。注：通过将提取物冻结在-80°C并保护它们免受光线照射，可以在这里暂停协议，因为AA和DHAA非常不稳定，在光的存在下，在高温或氧化气氛下很容易降解（补充文件1）。 4. DHAA 减少至AA提取AA 将 200 μL 的提取物 1 转移到 2 mL 琥珀小瓶，用于液相色谱，并加入 200 μL 的还原溶液（步骤 2.2）。用预开的PTFE-SILICONE插头关闭小瓶，用涡流摇动5 s。 让溶液在室温下站立 30 分钟，防止光线。 加入 200 μL 的 0.4 M H2SO4 以停止反应，稳定酸性 pH 中的 AA。生成的解决方案是提取 2，它仅包含 AA，实际上是 TAA。 5. 确定 UPLC-UV 制备 准备表 2 中描述的工作解决方案，通过 0.22 μm 过滤器进行适当过滤，经过至少 10 分钟的声波处理，并将它们放在 UPLC 系统中。 打开三个 UPLC 模块，等待内部校准过程完成。 打开软件（例如，授权 3），并加载表 2中描述的工具程序： 授权 3 |运行示例 |维生素C方法 |UPLC_PDA |使用快速入门。 软件加载正确的程序后，访问 UPLC 管理控制台： 第四纪溶剂管理器 |单击鼠标右键 |启动控制台。 继续准备和稳定 UPLC 仪器： 系统 |控制 |启动。 清除所有 UPLC 管路至少 5 分钟 ：主要溶剂 |QSM |检查 A、B、C、D 和密封件清洗 |黄金期限 > 5 分钟. 净化和清洁喷油器 ：主要溶剂 |Sm |检查洗涤溶剂 （> 45 s） 和检查净化溶剂 （> 35 周期）。 将 UPLC 与方法条件进行均衡：与方法均衡 |QSM |流量 （0.3 mL 最小-1） |溶剂 A （2%） |溶剂 B （0%） |溶剂 C （98%） |溶剂 D （0%）;与方法平衡 |Sm |样品 （5 °C） |列 （30 °C） 和平衡到方法 |其他 |检查灯打开 |按”开始”。 等待至少 1 小时（建议使用更多时间），使设备稳定下来。可以验证稳定性，检查启动控制台中的列中的压力：系统 |第四纪溶剂管理器 |QSM 系统压力。确保压力变化（增加或减少）中没有可识别的趋势，并且增量值小于 10 psi。 在 “快速 入门”屏幕中，用要分析的标准和样本的名称填充矩阵。 标准中的 AA 确定 将以前准备的五个 AA 标准（步骤 2.5.3）中的 1 mL 转移到 2 mL 琥珀小瓶，用于液相色谱。用预开的 PTFE-硅插头关闭小瓶，并在 UPLC 仪器中注入 5 μL。 按照表 2 中描述的过程执行色 谱，从 最稀释到最浓缩开始。 样本中的 AA 测定 在2 mL琥珀小瓶中移液器 200 μL 提取物 1，用于液相色谱，并加入 800 μL 的超纯水。用预开的 PTFE-硅插头关闭小瓶，并在 UPLC 仪器中注入 5 μL。 按照表 2 中描述的过程执行 色谱。 样品中的 TAA 测定 加入400μL的超纯水到提取物2。用预开的 PTFE-硅插头关闭小瓶，并在 UPLC 仪器中注入 5 μL。 按照表 2 中描述的过程执行 色谱。 组件和参数 描述 仪器 Acquity UPLC H 级 探测器 PDA e= 探测器 μabs 用于 AA=245 nm 软件 授权 3 列 交流 UPLC HSS T3 （150 毫米 x 2.1 毫米 x 1.8 μm） 通道 A Ch3哦 通道 B/洗涤 H2O：CH3OH （50：50 v：v） 通道 C 超纯水 pH 2.0 酸化由甲酸 a 通道 D/密封清洗 超纯水：醋酸（90：10 v：v） 移动阶段 0.3 mL 最小-1 的 2%A = 98%C（等式模式） 柱温度 30 °C 自动采样器温度 5 °C 喷射体积 5 μL AA 保留时间 1.874 分 运行时间 3 分钟 a在 pH 调整之前使用的未确定甲酸体积 表2：色谱过程优化，以确定从生菜和野生亲的提取物中的AA（抗坏血酸）。 说明所用部件、条件和解决方案。 6. AA 和 DHAA 的量化 统计分析 确定Bertolón等人所述的色谱法的分析参数（表3）。注：表3中所示 参数 的值需要在特定的实验条件下定义。 方法的分析参数 值 线性范围 （μg mL-1） 0.5-25 线性方程 y=53，143.03x R2 0.99998 检测限值（毫克 AA g-1 干物质） 0.013 定量极限（毫克 AA g-1 干物质） 0.045 可重复性 （CV，%） 1.75 中间精度 （CV， %a 4.22 恢复（Rec， %）b 95.6±2.4 aCV：变异系数 b恢复测定用含有50毫克相同样品的10个等分，5个用2毫克的AAg-1 的干物质进行，5个非尖峰。%Rec=（[AA]峰值样本-[AA]样本）/（[AA]峰值）x100。 表3：AA（抗坏血酸）和TAA（总抗坏血酸）检测和定量的优化分析参数。 在样品注入量为5μL时，获得了校准（R2）曲线的线性范围、方程和确定系数，以及AA的检测和定量极限（TAA相同），以及可重复性、中间精度和恢复性。 计算AA和AA浓度。 打开标准和样品色谱图： 快速入门 |浏览项目 |频道 |”标准或样品名称” |PDA Ch1 245 nm@1.2 nm. 通过单击其起点（约 1.790 分钟）并将峰值拖动到其终点（约 1.910 分钟），将相应的峰值（AA 或 TAA）集成到标准和样本中。 根据上面准备的五个 AA 标准的浓度（表 1 ）构建一个校准曲线，表示色谱上确定的吸收度值（步骤5.2.）。 使用以下公式分别对步骤 5.3 和 5.4 中确定的样品的吸光值进行插值，并获取 AA 和 TAA 浓度：其中 y 是集成峰值区域 ，x 是 ppm 中的 AA 或 TAA 浓度 ，m 和 n 分别是获得回归线的斜率和 y-intercept。 要计算 DHAA 的浓度，请应用以下公式：注：要获得干重的mgg-1 中DHAA、AA和TAA的总浓度，在校准曲线中直接插值的值必须乘以总萃取量和应用的稀释因子，然后除以用于进行萃取的样品的重量。