JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

CRISPR-Cas9-بوساطة الجينوم التحرير في الأحرف ال الخيطية هانتييلا omanensis

Published: June 09, 2020
doi:
10.3791/61367
,
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology,University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI),University of Pretoria

Summary

نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 هو محرر جينوم سهل الاستخدام تم استخدامه في الأنواع النموذجية وغير النموذجية. هنا نقدم نسخة البروتين القائم على هذا النظام الذي كان يستخدم لإدخال كودون وقف سابق لأوانه في جين التزاوج من الفطريات غير نموذج خامكوميت.

Abstract

نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 هو أداة جزيئية يمكن استخدامها لإدخال تغييرات دقيقة في جينومات الأنواع النموذجية وغير النموذجية على حد سواء. يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لمجموعة متنوعة من نهج تحرير الجينوم ، من الضربات القاضية الجينية وs knockins إلى تغييرات أكثر تحديدا مثل إدخال عدد قليل من النيوكليوتيدات في مكان مستهدف. ويمكن استخدام تحرير الجينوم في العديد من التطبيقات، بما في ذلك التوصيف الوظيفي الجزئي للجينات، وإنتاج الكائنات المحورة وراثيا وتطوير أدوات التشخيص. بالمقارنة مع استراتيجيات تحرير الجينات المتاحة سابقا، وقد ثبت أن نظام CRISPR-Cas9 من السهل تأسيسها في الأنواع الجديدة، ويفتخر بكفاءة عالية وخصوصية عالية. والسبب الرئيسي لذلك هو أن أداة التحرير تستخدم جزيء الحمض النووي الريبي لاستهداف الجين أو تسلسل الاهتمام ، مما يجعل تصميم الجزيء المستهدف واضحًا ، نظرًا لأن قواعد الاقتران الأساسية القياسية يمكن استغلالها. وعلى غرار أنظمة تحرير الجينوم الأخرى، تتطلب الأساليب القائمة على CRISPR-Cas9 أيضاً بروتوكولات تحويل فعالة وفعالة فضلاً عن الوصول إلى بيانات تسلسل ذات نوعية جيدة لتصميم جزيئات الحمض النووي الريبي الحمض النووي والحمض النووي المستهدفة. منذ إدخال هذا النظام في عام 2013 ، تم استخدامه لهندسة مجموعة متنوعة من الأنواع النموذجية وراثيًا ، بما في ذلك Saccharomyces cerevisiae و Arabidopsis thaliana و Drosophila melanogaster و Musculus. وفي وقت لاحق، استفاد الباحثون العاملون على الأنواع غير النموذجية من النظام واستخدمواه لدراسة الجينات المشاركة في عمليات متنوعة مثل التمثيل الغذائي الثانوي في الفطريات ونمو الديدان الخيطية ومقاومة الأمراض في النباتات، من بين أمور أخرى كثيرة. يصف هذا البروتوكول المفصل أدناه استخدام بروتوكول تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 لاقتطاع جينة تشارك في الدورة الجنسية لـ Huntiella omanensis، وهو فطر مُشعِب متلَقِل ينتمي إلى عائلة Ceratocystidaceae.

Introduction

وقد أدى التوافر المتزايد للجينومات والمجمعة بالكامل والمجمعة بشكل كامل إلى تحسين القدرة على دراسة مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية في مجموعة من الكائنات الحية1. وينطبق هذا على كل من الأنواع النموذجية والأنواع غير النموذجية، التي قد يوفر الكثير منها فهما أكثر تنوعا للعمليات البيولوجية. ويمكن استخدام هذه الأنواع من البيانات لاكتشاف الجينات، وتحديد شبكات النسخ والمقارنات الجينومية الكاملة والمستنسخة، وكل منها يأتي مع مجموعة تطبيقاته الخاصة. ومع ذلك، في حين يجري التنبؤ الجينات، مشروحة ومرتبطة بشكل مُفترض بمسارات وظيفية مختلفة بمعدل لم يسبق له مثيل، فإن التوصيف الوظيفي لهذه الجينات لا يزال متخلفاً، ومحدودية بسبب مجموعات الأدوات الجزيئية المتاحة للعديد من الأنواع. وهذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للأنواع غير النموذجية ، حيث من السهل نسبيا توليد البيانات الجينومية ولكن حيث كان التوصيف الجزيئي القريب من المستحيل1،2.

ويمكن تحقيق التوصيف الجزئي لوظائف جينات محددة مهمة لبيولوجيا الأنواع الفطرية إما بالضربة القاضية أو تجارب knockin تليها تحليل فيناتبيك من سلالات متحولة3. ويعتمد هذان النظامان كليا على توافر بروتوكولات الهندسة الوراثية، بما في ذلك، كحد أدنى، نظام تحويل ونظام تحرير وراثي. هناك عدد من أنظمة التحول المختلفة التي تم تطويرها في مجموعة متنوعة من الفطريات الخيطية4. وقد تم تطوير النظم الفيزيائية مثل تلك التي تعتمد على البيولوجيا والكهربية في تريشورميرما harzianum5 و Aspergillus النيجر6, على التوالي. وقد تم تطوير النظم التي تستخدم المواد الكيميائية مثل كلوريد الكالسيوم أو خلات الليثيوم في Neurospora crassa7. وأخيرا، فقد استخدمت النظم البيولوجية التي تعتمد على استخدام البكتيريا الزراعية tumefaciens للتحول بنجاح في Ceratocystis albifundus8.

وعلى النقيض من توافر بروتوكولات التحول المختلفة، فإن نظم تحرير الجينوم أقل وفرة. العديد من التجارب التقليدية توصيف وظيفية أجريت في الفطريات خيوط تستخدم بناء خروج المغلوب علامة الانقسام في شكل علامة اختيار محاطة مناطق من homology إلى المنطقة المستهدفة أو الجينات في الجينوم3. تعتمد الطريقة على إصلاح الحمض النووي الموجه (HR) الموجه ، والذي يُنشئ إعادة التركيب المتماثل بين بناء الضربة القاضية والمنطقة ذات الاهتمام. هذا الحدث إعادة التركيب يؤدي إلى استبدال الجين من الفائدة مع تسلسل علامة اختيار. للأسف، في حين أن هذا كان ناجحا في العديد من الأنواع بما في ذلك Cercospora nicotianae10، Aspergillus fumigatus11 و Grosmannia clavigera12، ومعدلات إعادة الكومبينيشن المتجانسة هي متغيرة للغاية عبر أنواع فطرية مختلفة ، مما يجعل هذا بروتوكول غير فعال وغير قابل للاستخدام في بعض الأحيان في بعض الأنواع3.

وتمثل أنظمة تحرير الجينوم الأخرى، بما في ذلك تلك التي تستفيد من نوىات الزنك الإصبع (ZFNs) والنوى المؤكّدة الشبيهة بالمفعول (TALENs) تحسينًا كبيرًا في الأنظمة القديمة، لا سيما بالنظر إلى قدراتها على إجراء تغييرات محددة ومستهدفة13. وتتألف كل من ZFNs و TALENs من البروتين النوى والبروتين الذي هو قادر على التعرف على تسلسلات النيوكليوتيدات محددة13. عند التعرف عليها ، فإن النوى تحفز كسر الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل التي يمكن أن تسهل إدخال طفرات محددة. من أجل إحداث تغييرات الجينوم، تحتاج منطقة البروتين التي تعترف تسلسل النيوكليوتيدات إلى أن تصمم خصيصا لكل تجربة. وبسبب هذا الاعتماد على البروتين النووي التفاعلات حمض لتوجيه التحرير ، وتصميم وإنتاج الجزيئات المستهدفة لكل خروج المغلوب أو knockin التجربة من الصعب والعمل المكثف14،15. ومن الأمثلة على هذه التحديات، أن عدداً قليلاً جداً من الفطريات الخيطية قد أُخضعت لتحرير الجينوم باستخدام هذه النظم. مثال واحد هو نظام TALENs القائم الذي تم تطويره في فطر انفجار الأرز ، Magnaporthe oryzae16.

يمكن القول إن أعظم ثورة في مجال تحرير الجينوم كانت اكتشاف وتطوير لاحق لنظام CRISPR-Cas9 – محرر الجينوم الذي يسمح للشق المستهدف لسلسلة من الاهتمام من قبل endonuclease التي تسترشد جزيء الحمض النووي الريبي. وكان هذا تحسنا كبيرا على المحررين الجينوم المتقدمة سابقا التي اعتمدت على التفاعلات حمض البروتين النووي كميزة رئيسية لنظام CRISPR-Cas9 هو أنه يعتمد على جزيء الحمض النووي الريبي لاستهداف المنطقة ذات الأهمية. وهذا يعني أن النظام يعتمد على تفاعل الحمض النووي الريبي DNA وبالتالي يمكن استغلال قواعد الاقتران الأساسية القياسية عند تصميم كل تجربة15.

ويتألف نظام CRISPR-Cas9 كما هو مفصل هنا من ثلاثة مكونات رئيسية: RNA دليل واحد (sgRNA), إنزيم Cas9 والحمض النووي المانح (DDNA)17. وتتألف SgRNA من 20 منطقة نوكلييوتيد دعا بروتوسبر وكذلك منطقة أطول تسمى سقالة18. وتستخدم منطقة بروتوسبر لتوجيه نظام التحرير إلى المنطقة المستهدفة، وبالتالي يتم إعادة تصميمها لكل تجربة. السقالة هي منطقة الجيش الملكي النيبالي التي ترتبط جسديا إلى إنزيم Cas9 لتشكيل ريبونوكليوبروتين (RNP) وبالتالي هو متطابقة بغض النظر عن المنطقة التي سيتم استهدافها. إنزيم Cas9 يسهل فيزياء شق الحمض النووي الهدف، وذلك باستخدام protospacer كدليل لتحديد هذه المنطقة19. العنصر الأخير، DDNA، هو اختياري واستخدامه يعتمد على تجربة معينة20. ويأوي DDNA التسلسل الذي ينبغي إدراجه على وجه التحديد في المنطقة التي يتم قطعها من قبل إنزيم Cas9 ، وبالتالي فهو مثالي لتجارب knockin الجينات حيث يتم إدخال جين في الجينوم أو لتجارب خروج المغلوب الجينات حيث يتم إدخال جين مقاومة المضادات الحيوية أو علامة أخرى يمكن اختيارها لتحل محل جينة الفائدة. ويمكن أيضا أن تصمم DDNA بطريقة لإدخال تسلسلات جديدة في الجينوم. على سبيل المثال ، كما هو مفصل أدناه ، من الممكن إدخال وقف في الإطار كودون في منطقة معينة في جين الفائدة عندما يتطلب اقتطاع الجينات21. وتشمل التطبيقات الأخرى الطفرة في مناطق معينة من الجين، مثل المجال الوظيفي22،أو إدخال تسلسل العلامات23.

من الفوائد الرئيسية لاستخدام نظام CRISPR-Cas9 هو تعدد براعة24. ومن الأمثلة على هذه القدرة على التكيف هو أن إنزيم Cas9 يمكن إدخاله إلى الخلية المضيفة في أحد أشكاله الثلاثة- الحمض النووي الريبي أو البروتين – اعتماداً على نظام التحويل الخاص المستخدم. عندما يتم إدخالها في شكل الحمض النووي ، وغالبا ما يتم تضمين الجين cas9 على plasmid جنبا إلى جنب مع علامة اختيار ، كاسيت للتعبير عن sgRNA ، وإذا لزم الأمر ، كاسيت ترميز تسلسل dDNA25. والميزة الأساسية لهذا النظام هي أن بناء واحد فقط يحتاج إلى تحويل إلى خلية والتحول الناجح يضمن وجود جميع المكونات اللازمة لتحرير الجينوم بوساطة CRISRP-Cas9. ومع ذلك، تعتمد هذه الطريقة على توافر نظام التعبير للأنواع المضيفة. لكي ينجح Cas9 في إحداث تلف الحمض النووي ، يجب التعبير عنه على مستويات عالية ، وبالتالي ، مطلوب مروج مناسب ويحتمل أن يكون محددًا. بالنسبة للأنواع غير النموذجية التي لم يتم بعد تطوير مثل هذه المروجين ، قد يكون هذا عاملًا ينتقص ، وبالتالي قد تكون القدرة على إدخال Cas9 في الحمض النووي الريبي أو شكل البروتين خيارًا أكثر جاذبية. إدخال الجيش الملكي النيبالي في الخلية يجلب التحديات الخاصة بها- خاصة في أن الجيش الملكي النيبالي غير مستقر، وربما لا البقاء على قيد الحياة عملية التحول. وعلاوة على ذلك، عند إدخالها في شكل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، قد تحتاج سلسلة جينات Cas9 إلى أن تكون محسنة للاستخدام في النظام المضيف17. على سبيل المثال، قد لا يعمل الجين cas9 من المكورات العقدية في خلية مضيفة للثدييات وقد لا يعمل جين cas9 الذي تم تحسينه للاستخدام في خلية الثدييات في خلية نباتية. كل هذه التحديات يمكن التغلب عليها باستخدام شكل البروتين من Cas9، والتي، جنبا إلى جنب مع sgRNA، يمكن تجميعها في RNP وتحويلها إلى الخلية المضيف26،27. هذا النظام لا يعتمد على أي نظام التعبير الذاتي أو codon الأمثل وينبغي أن تعمل بالتالي في معظم الأنواع غير النماذج. وعيب النظام القائم على البروتين هو أنه غير متوافق مع أنظمة التحول القائمة على الحمض النووي مثل نقل البكتيريا الزراعية-بوساطة. وهكذا، لكي تعمل الطريقة القائمة على البروتين، يجب أن يتوفر بروتوكول تحويل مثل تلك التي تعتمد على عمليات البلاستك أو البيولوجية. وقد تم استخدام هذا النظام القائم على RNP بنجاح في الفطريات خيوط، فوساريوم أوكسيسبوروم26 وmucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, عضو في عائلة Ceratocystidaceae, هو فطر عالمية غالبا ما توجد على النباتات الخشبية الطازجةالجرحى 28. في حين أن جودة عالية الجينوم والبيانات transcriptome متاحة لهذا النوع28,29,30, وقد تم تطوير أي تحويل أو بروتوكولات تحرير الجينوم. حتى الآن، ركزت البحوث على ه. عمانينسيس على المكونات الوراثية الكامنة في دورته الجنسية29،31. هذا الفطر معارض دورة جنسية غير تقليدية نموذجية، مع التكاثر الجنسي التي تحدث حصرا بين العزلات من MAT1-1 و MAT1-2 أنواع التزاوج31. في المقابل، MAT1-2 يعزل من moniliformis هنتيلا وثيقة الصلة قادرة على التكاثر الجنسي المستقل وإكمال دورة جنسية في غياب شريك MAT1-131. ويعتقد أن هذا الاختلاف في القدرات الجنسية أن يكون، على الأقل جزئيا، بسبب اختلاف كبير في الجين التزاوج، MAT1-2-7، حيث H. omanensis المرافئ كامل الطول ونسخة سليمة، في حين يتم اقتطاع الجين بشدة في H. moniliformis29،31. لمزيد من وصف دور هذا الجين في التكاثر الجنسي، تم اقتطاع الجين MAT1-2-7 من H. omanensis لتقليد الاقتطاع الذي شوهد في H. moniliformis21.

البروتوكول أدناه تفاصيل التحول من H. عمانيونسيس والاقتطاع من الجين MAT1-2-7 باستخدام نسخة البروتين القائم على نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas9. تم تطوير هذا البروتوكول بعد أن فشلت نهج استبدال الجينات المتجانسة القائمة على إعادة التركيب وتحرير الجينوم CRISPR-Cas9 القائم على plasmid.

Protocol

1. تصميم وتوليف sgRNA لتحديد المناطق protospacer المحتملة التي ستشكل جزءا من sgRNA ، والبحث يدويا من خلال الجينات من مصلحة لثلاثة توائم 5 ‘NGG 3 ‘ ، وذلك باستخدام وظيفة البحث في أي برنامج يتم استخدامها. اُنمّي هذه الثلاثات الثلاثات على هيئة تسلسلات PAM.ملاحظة: تتوفر برامج مختلفة للبحث عن و تعليق توضيحي على تسلسلات PAM و protospacer المحتملة. حدد 20 bp المنبع لكل من تسلسل PAM المحدد و تعليق توضيحي هذه التسلسلات كبروتوسسبيرس المحتملة. لاتخاذ قرار بشأن protospacer واحد، تنفيذ خطوات التصفية التالية لتجاهل تسلسلات ذات جودة منخفضة. لاختبار خصوصية protospacers المحتملة ، والجمع بين تسلسل PAM وprotospacer في تسلسل واحد واستخدامه كاستعلام BLASTn ضد الجينوم بأكمله. تجاهل أي بروتوسارس التي تظهر التشابه مع أي منطقة في الجينوم غير المنطقة المستهدفة (الشكل 1A). لضمان أن جزيء RNA سوف أضعاف في الهيكل الصحيح 3D لربط إلى إنزيم Cas9، إنشاء تسلسل مجتمعة بما في ذلك protospacer وتسلسل سقالة محددة إلى إنزيم Cas9. تحميل كل من تسلسلات protospacer-سقالة مجتمعة في أداة التنبؤ بنية ثانوية RNA(جدول المواد). تحليل النتائج من خلال مقارنة الحد الأدنى من الطاقة الحرة والهياكل الثانوية المركزية.ملاحظة: سيكون للمرشحين protospacer المثالي الحد الأدنى من الطاقة الحرة متطابقة والهياكل الثانوية المركزية. وينبغي أن يتألف الهيكلان الثانويان من ثلاث حلقات جذعية، تقطعها خمسة هياكل دائرية. وينبغي أن تظهر أيضا الهياكل احتمالات عالية ملزمة (المشار إليها باللون الأحمر) في جميع أنحاء هيكل كامل، باستثناء المنطقة التي تمثل بروتوسبر(الشكل 1B). قيم الطاقة الفعلية ليست ذات صلة. اختر مرشح نهائي من تلك التي اجتازت خطوات التصفية أعلاه عن طريق اختيار المرشح الأقرب إلى المنطقة المحددة المستهدفة. لتجميع sgRNA كجزيء RNA واحد، استخدم مجموعة تجميع sgRNA(جدول الموادs) متوافقة مع إنزيم Cas9 معينة التي سيتم استخدامها (على سبيل المثال، Cas9 من المكورات العقدية pyogenes).ملاحظة: قد تعتمد الخطوات التالية على مجموعة تجميع sgRNA المستخدمة. في حالة استخدام مجموعة مختلفة، اتبع إرشادات الشركة المصنعة. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون أمر sgRNA قبل توليفها. عند العمل مع RNA، استخدم الكواشف الخالية من النوى والمواد المستخدمة. إذا كان 20 bp protospacer المختار في الخطوة 1.3 أعلاه لا يأوي G في نهاية 5 ‘، إضافة G إلى هذه المنطقة. أضف تسلسل المروج T7 إلى نهاية 5 من تسلسل الهدف. هذا التسلسل هو المعيار و5 ‘TTCTAATACGACTCACTATAG 3’. إضافة تسلسل تراكب 14 NT إلى نهاية 3 ‘من تسلسل الهدف. هذا التسلسل هو عدة محددة و5 ‘GTTTTAGAGCTAGA 3 ‘ لمجموعة المستخدمة هنا. ترتيب الجزء الناتج 5 ‘ TTCTAATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA، مع (N)20 تمثل presynthesized protospacer مختارة (جدول المواد). وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة(جدول المواد)،والجمع بين الكواشف التالية في درجة حرارة الغرفة: 2 ميكرولتر من الماء، 10 ميكرولتر من العازلة رد فعل، 5 ميكرولتر من تسلسل protospacer توليفها، 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT و 2 ميكرولتر من الإنزيم transcriptase. احتضان هذا الحل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ونقلها إلى الجليد. إضافة 30 ميكرولتر من الماء و 2 ميكرولتر من DNase الأول، مزيج واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى. تصور sgRNA الناتجة على هلام agarose 2٪. 2. اختبار في المختبر الانقسام القدرة من sgRNA ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكن يوصى. تصميم التمهيديات التي من شأنها تضخيم جزء يضم تسلسل الموقع أن SGRNA المختارة سوف تستهدف وتضخيم المنطقة باستخدام بوليميراز الحمض النووي القياسية.ملاحظة: إذا كان ذلك ممكناً، تصميم التمهيديات في مثل هذه الطريقة التي انشقاق في الموقع المستهدف سوف تنتج شظيتين من أحجام مختلفة جداً التي يمكن تمييزها بسهولة من بعضها البعض على هلام agarose القياسية. تجميع مجتمعة sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) عن طريق احتضان حل يتكون من 30 nM sgRNA كما تم تصنيعها أعلاه، 30 NM Cas9 البروتين، 10x التفاعل العازلة و 10 ميكرولتر من الماء في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اختبار قدرة الانقسام من sgRNA بإضافة منتج PCR من المنطقة المستهدفة في حل RNP إلى تركيز نهائي من 3 ن م. احتضان الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إضافة 3 ميكروغرام من البروتينات K و 2 ميكروغرام من RNase إلى الحل لوقف تفاعل الانقسام واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تصور شظايا الحمض النووي الناتجة على هلام agarose 2٪. SGRNA هو مناسبة لفي التجارب في الجسم الحي إذا لوحظت شريطين من الحجم المتوقع على هلام. 3. تصميم وتوليف DDNA تصميم DDNA لتكون تتألف من ثلاث مناطق – 5 ‘ و 3 ‘ المناطق مع التكامل إلى منطقة الجينوم التي يجري استهدافها ومنطقة وسطى إيواء علامة اختيار (جدول المواد، الشكل 2).ملاحظة: يمكن أيضا إضافة تسلسلات محددة أخرى إلى هذه العلامة القابلة للتحديد. لهذه التجربة بالذات، تم إضافة تسلسل كودون وقف (5’TGA 3’) قبل علامة اختيارها مباشرة، وبالتالي إدخال كودون وقف في الإطار في الجين. يمكن أن يكون أمر dDNA presynthesized. وبدلاً من ذلك، يمكن تضخيم DDNA وتجميعه باستخدام نهج تدريجي متداخل من نهج PCR على النحو المفصل أدناه. تصميم التمهيدي لتضخيم ما يقرب من 800 BP من المناطق 5 ‘و 3’ يحيط. أضف 20 NT من التسلسل الذي هو مكمل لتسلسل العلامة القابلة للتحديد إلى التمهيدي العكسي للمنطقة 5 و 3’التمهيدي الأمامي للمنطقة. تصميم التمهيديات التي تضخيم علامة اختيار، وضمان أن المنتج تضخيم تؤوي الجينات المقاومة، فضلا عن المروج المعروف للعمل في الأنواع ذات الاهتمام. باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة (جدول المواد) ، تضخيم المناطق الثلاثة dDNA. تضخيم المناطق 5 ‘و 3’ من gDNA للكائن الحي يجري تحريرها. تضخيم العلامة القابلة للتحديد من مصدر ذي صلة. في رد فعل واحد، والجمع بين تضخيم 5 ‘ المنطقة مع علامة اختيار و, باستخدام طويلة المدى, عالية الدقة الحمض النووي البوليميراز, تضخيم المنطقة بأكملها. في رد فعل واحد ثان، والجمع بين تضخيم 3 ‘المنطقة مع علامة اختيار و, باستخدام طويلة المدى, عالية الدقة الحمض النووي البوليمرات, تضخيم المنطقة بأكملها. وأخيراً، قم بدمج منتجي البوليميراز المتسلسل السابقين في تفاعل واحد وتضخيم تسلسل dDNA بأكمله مع بوليميراز حمض نووي طويل المدى وعالي الدقة. تصور جزء الحمض النووي على هلام agarose 1٪ . في حالة إنتاج شظيتين أو أكثر، تنقية الجزء الحجم بشكل صحيح من الجل باستخدام مجموعة تنقية هلام. 4. استخراج بروبلاستس لإنتاج conidia، تلقيح 200 مل من 2٪ الشعير الطازجة استخراج مرق (MEB) في قارورة 500 مل مع 1 سم × 1 سم mycelia المغطاة كتلة الأجار.ملاحظة: ليست كل الفطريات قادرة على إنتاج conidia. في هذه الحالة ، يمكن أيضا أن تستخدم mycelia. وهذا سوف يتطلب عادة تركيزات أعلى من الانزيم lysing كذلك في البروتوكول. احتضان الثقافة السائلة في حاضنة تهتز في 25 درجة مئوية مع اهتزاز في 120 دورة في الدقيقة لمدة 24 – 48 ساعة.ملاحظة: تم تحسين وقت الحضانة ودرجة الحرارة هذا لH. omanensis. هذا سوف تحتاج إلى أن تكون الأمثل للأنواع الأخرى. لحصاد conidia؛ تصفية الثقافة السائلة من خلال طبقة من القماش المختبري العقيم (على سبيل المثال، Miracloth)، ونقل التعليق المتكون إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 مل والطرد المركزي في 3220 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل المُندفع. Resuspend conidia في 5 مل من الماء والماصات 10 ميكرولتر من الحل conidia على شريحة المجهر وتغطية مع غطاء. تصور باستخدام المجهر المركب تحت 40x التكبير لضمان conidia فقط قد تم استردادها (الشكل 3A). في قارورة 500 مل، تلقيح 200 مل من 1٪ MEB الطازجة مع الحجم الإجمالي للمكونية resuspended. احتضان الثقافة السائلة في حاضنة تهتز في 25 درجة مئوية مع اهتزاز في 120 دورة في الدقيقة لمدة تصل إلى 12 ساعة.ملاحظة: تم تحسين وقت الحضانة هذا لH. omanensis. هذا سوف تحتاج إلى أن تكون الأمثل للأنواع الأخرى. ولجني الهباتات، قم بنقل الاستزراع السائل إلى أنابيب 50 مل من أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 3,220 x ز عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل المُندفع. إعادة إنشاء الجراثيم في ما يصل إلى 10 مل من 1 M سوربيتول. ماصة 10 μL من حل الجراثيم على شريحة المجهر وتغطية مع غطاء. تصور باستخدام المجهر المركب تحت 40x التكبير لضمان فقط تم استردادباتات (الشكل 3B).ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تخزين اربيات في 1 M سوربيتول في -80 درجة مئوية. لتجميل جدران الخلية منباتات الشباب والإفراج عن الضمادات، إضافة 1 مل من تعليق الجراثيم إلى 9 مل من الانزيم lysing في تركيزات مختلفة في قارورة عقيمة 50 مل.ملاحظة: يتم استخدام تركيزات الإنزيمات وأوقات الاحتضان المختلفة ويمكن العثور عليها في الجدول 1. ومن المرجح أيضا أن تختلف الإنزيمات والتركيزات تبعا للفطريات، وسوف تحتاج إلى أن تكون الأمثل لكل نوع. احتضان محلول spore-enzyme في حاضنة تهتز عند درجة حرارة 25 درجة مئوية مع اهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 2 إلى 3 ساعات. تصفية محلول بروبلاست من خلال طبقة من القماش المختبري العقيم وجمع البلاستات بواسطة الطرد المركزي عند 1,810 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل المُندفع.ملاحظة: البروتبلاستات هي خلايا بدون جدران الخلايا وبالتالي حساسة جداً للتعطيل الميكانيكي. تأكد من التعامل معها بعناية، لا سيما عندما pipetting. إعادة بناء بيليه بروتبلاست بعناية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت STC(جدول المواد). Pipette 10 μL من محلول البروتبلاست على شريحة المجهر وتغطية مع غطاء. تصور باستخدام المجهر المركب تحت 40x التكبير لضمان فقط قد تم استرداد protoplasts (الشكل 3C). باستخدام مقياس الدم، عد وحساب عدد من بروتبلاستس ولدت في الخطوات المذكورة أعلاه. تخفيف حل بروبلاست في aliquots التي تحتوي على ما يقرب من 5 × 106 protoplasts.ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تخزين البلاستات في STC العازلة في -80 درجة مئوية. 5 – التحول والتعافي من التحويل بمساعدة بروبلاست و PEG لبدء التحول، والجمع بين حوالي 5 × 106 protoplasts مع وحدة تخزين واحد من حل RNP وحوالي 6 ميكروغرام من جزء dDNA.ملاحظة: البروتبلاستس حساسة جداً لتعطل الميكانيكية. تأكد من التعامل معها بعناية، لا سيما عندما pipetting. باستخدام ماصة، بالتنقيط ببطء 1 مل من حل PTC 30 إعداد حديثا على حل protoplast واحتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.ملاحظة: هذه الخطوة خطوة حساسة و الهامة جداً. تأكد من استخدام حل PTC الطازجة وإسقاط الحل على الخلايا ببطء واتزان قدر الإمكان ، وخلق طبقة مبيدة للماء عبر سطح الخلية. أضف 5 مل من وسيط التحكم التناضحي (OCM) إلى محلول الضمون والماصات ببطء ولطف لضمان خلط الحل تمامًا. احتضان محلول بروبلاست في حاضنة تهتز عند درجة حرارة 25 درجة مئوية مع اهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. لتحديد المعزولات المحولة، قم بتقسيم الحل إلى 5 لوحات استزراع فارغة 60 مم. إضافة 10 مل من أوك إم أجار تكملها 30 ميكروغرام / مل hygromycin B إلى كل لوحة الثقافة وتدوير ببطء كل لوحة لخلط دقيق. السماح للطبقة الأولى من أجار لتعيين قبل إضافة 10 مل من التحكم التناضحي أجار المتوسطة تكملها 40 ميكروغرام / مل hygromycin B. السماح للطبقة الثانية من أجار لتعيين واحتضان الثقافات في 25 درجة مئوية حتى يمكن رؤية عزل واحد ينمو من خلال كل من طبقات من أجار. لاستعادة العزلات المحولة بنجاح، نقل المعزولات الفردية القادرة على النمو من خلال طبقة الأجار المكملة بـ 40 ميكروغرام/مل هيغروميسين B لاستخراج الشعير الطازج agar (MEA) لوحات مكمّلة بـ 50 ميكروغرام/مل hygromycin B (MEA-50). احتضان الثقافات الطازجة في 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام، والتحقق يوميا للنمو. وقد تم بنجاح تحويل الثقافات القادرة على النمو المستدام في هذه الوسائط ويمكن استخدامها لمزيد من الدراسة. 6- تأكيد تكامل وثبات DDNA من أجل التأكد من أن DDNA قد تم دمجها في الجينوم في المنطقة المستهدفة ، وتصميم التمهيديات التي تحيط 5 ‘ و 3 ‘ المتوقعة إدراج المواقع (الشكل 2). تنفيذ اثنين PCRs باستخدام هذه المجموعتين التمهيدي وبوليمرات الحمض النووي عالية الدقة. وإذا كان كل من وحدات الـ PCRs تنتج ابلكونات من الحجم والتسلسل المتوقعين، فإن يداما الوطنية للديون الوطنية قد أدمجت بنجاح في المنطقة المستهدفة. ثم، تقييم وصمة عار متحولة للاندماج مستقرة من DDNA. من أجل التأكد من أن DDNA قد تم دمجها بشكل ثابت في الجينوم وسيتم الحفاظ عليها أثناء النمو النباتي ، وإجراء اختبار نقل الوسائط. نقل كتلة من أجار التي تغطيها mycelial من عزل متحولة تنمو بنشاط على MEA-50 المتوسطة إلى المتوسط MEA غير الموردة. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام. نقل كتلة من أجار مغطية mycelia من العزلة المتنامية على المتوسطة MEA إلى MEA-50 المتوسطة. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام. كرر هذه العملية، ونقل الزباء المتنامية بنشاط من مكملة إلى المتوسطة غير المجهزة لمدة أربع جولات على الأقل.ملاحظة: إذا كان العزلة قادرة على النمو المستدام على المتوسط MEA-50 بعد العديد من عمليات النقل، وقد تم دمج DDNA بشكل ثابت في الجينوم ويمكن الحفاظ عليها من خلال النمو النباتي. يمكن تقييم البقعة المتحولة لوجود نسخة واحدة فقط من dDNA المتكاملة. من أجل التأكد من أن DDNA قد تم دمجها في الجينوم في موقع واحد، وإجراء تحليل البقعة الجنوبية. اجسّم ما مجموعه 30 ميكروغرام من gDNA من كل سلالة متحولة باستخدام HindIII و ECORI إنزيمات تقييد وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.ملاحظة: في حين أن اختيار إنزيم القيد متروك للباحث، تأكد من أن موقع التعرف على إنزيم القيد غير موجود في تسلسل dDNA. فصل gDNA هضم على 0.75٪ agarose هلام ونقل الحمض النووي على غشاء النايلون باستخدام الإجراءات القياسية32. اخضاع الغشاء للتهجين باستخدام مسبار يستهدف تسلسل dDNA. تصميم التمهيدي لتضخيم قصيرة (300 BP) منطقة من DDNA. باستخدام هذه التمهيديات، توليف التحقيق باستخدام PCR DIG المزيج وضع العلامات. استخدام المجس توليفها حديثا لتهجين الغشاء والعلاج والتصور باستخدام الإجراءات القياسية32. إذا كان ينظر إلى شريط واحد فقط في كل حارة، dDNA موجود في موقع واحد فقط في الجينوم. ويمكن الآن استخدام سلالة متحولة لمزيد من تحليل الظاهريات والتجارب توصيف وظيفية. 7. تحليل فينوبايبيك من سلالات متحولة إجراء تجارب التزاوج لتحديد ما إذا كان تعطيل الجين MAT كان له تأثير على القدرات الجنسية للفطريات التي يجري دراستها.ملاحظة: تعتمد هذه الخطوة على الجينات والأنواع التي تجري دراستها. في هذه الحالة، يعتقد أن الجين الذي يستهدفه هو المشاركة في الإنجاب الجنسي وبالتالي تم إجراء اختبارات التزاوج. إذا كان يعتقد أن الجين ، على سبيل المثال ، يشارك في التكاثر اللاجنسي ، ثم شيء مثل الإنتاج المخروطي يمكن قياسه. من أجل اختبار قدرات heterothallic سلالة متحولة، شارك في تلقيح المتوسطة MEA الطازجة مع سلالة متحولة، فضلا عن سلالة من نوع التزاوج المعاكس. في حالة H. omanensis، حافظ على أغطية اللوحات مغلقة ، ولكن ليس مختومة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 أيام. تقييم بصريا لإنتاج الهياكل الجنسية. من أجل اختبار قدرات المثلية من سلالة متحولة، تلقيح المتوسطة MEA الطازجة مع سلالة متحولة. في حالة H. omanensis، حافظ على أغطية اللوحات مغلقة ، ولكن ليس مختومة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 أيام. تقييم بصريا لإنتاج الهياكل الجنسية. إجراء تجارب معدل النمو لتحديد ما إذا كان تعطيل الجين MAT كان له تأثير على معدل نمو الفطريات التي يجري دراستها. إنشاء المقابس أجار التي تغطيها mycelial من حافة النمو بنشاط من الثقافات من سلالات متحولة و wildtype عن طريق إدراج الجانب الخلفي من كبير، تلميح ماصة معقمة في أجار. تلقيح المتوسطة MEA الطازجة مع هذه المقابس أجار. تأكد من إجراء ثلاثة نسخ متماثلة على الأقل لكل نوع من أنواع البيانات الموروثة. بعد 3 أيام من النمو عند 20 درجة مئوية، وقياس النمو على اثنين من أقطار عمودي. قارن البيانات من النمط البري والسلالات المتحولة.

Representative Results

البروتوكول المذكور أعلاه سهل إدخال كودون وقف سابق لأوانه في جين التزاوج من ascomycete غير نموذج, H. omanensis. استخدمت هذه العملية نسخة من نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 وعلى هذا النحو واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هو تصميم وتوليف sgRNA عالية الجودة. ويبين الشكل 1 كيف تم تصميم هذا الجزيء بطريقة أنه A) يستهدف على وجه التحديد الجين من الفائدة ويظهر التشابه قليلا مع مناطق أخرى في الجينوم وB) طيات بشكل صحيح من أجل ربط مع بروتين Cas9. كما يجب أن تكون الـ sgRNA قادرة على شق المنطقة المستهدفة بشكل فعال. وقد أجريت قدرة sgRNA على استهداف والسماح لانشقاق المنطقة المستهدفة في المختبر، مما أسفر عن اثنين من المنتجات من الحجم المتوقع. وبمجرد نجاح التحول، من المهم ضمان أن يكون نظام DDNA قد اندمج في الجينوم مرة واحدة فقط وفي المكان المتوقع. ويوضح الشكل 2 تصميم الأحرف التمهيدية لـ PCR التي تستهدف مواقع الإدراج، والتي يمكن استخدامها لفحص التحويلات المحتملة لموقع التكامل الصحيح. من خلال تصميم التمهيديات التي تحيط مواقع الإدراج 5 ‘و 3′ ، التضخيم ممكن فقط إذا تم إدراج dDNA في المنطقة الصحيحة. ويوضح الشكل 4 أن التوقف المبكر codon أدخلت في الجين MAT1-2-7 في إطار القراءة الصحيحة، وضمان أن يتم اقتطاع الجين بطريقة مماثلة لتلك التي من ه. moniliformis . وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل البقعة الجنوبية أن بناء DDNA لم يكن متكاملا إلا في موقع واحد في الجينوم. وقد تأكد نجاح البروتوكول على تحليل الظاهرية من سلالات متحولة. وفي حالة تجربة الاختلال MAT1-2-7، تم تطوير نوعين من السلالات المتحولة المستقلة. في كل من العزل، تم تخفيض معدل النمو الشعاعي الخضري بشكل كبير، مما يشير إلى تأثير pleiotropic من جين التزاوج الرواية(الشكل 5). وعلاوة على ذلك، كانت عزلات متحولة غير قادرة على إكمال دورة جنسية، وتنتج فقط الهياكل الجنسية غير ناضجة التي لم تنتج الجراثيم الجنسية(الشكل 5). وكان هذا على النقيض من عزل النمط البري ، الذي أكمل الدورة الجنسية بأكملها في غضون أيام قليلة من الحضانة (الشكل 5). الشكل 1: اختيار مرشح مناسب للـ sgRNA.(أ) سوف يكون للـ sgRNA مناسبة فقط تشابه مع المنطقة المستهدفة من الجينوم (في هذه الحالة المشار إليها من قبل MAT التسلسل). (B)وسوف يكون sgRNA مناسبة مماثلة الحد الأدنى من الطاقة الحرة والهياكل الثانوية المركزية، مع حلقات الجذعية الثلاثة وخمس حلقات في حلقة الخطوة الأولية. وعلاوة على ذلك، فإن غالبية الهيكل لديها احتمالات ملزمة عالية (المشار إليها باللونين البرتقالي والأحمر الداكنين) في حين ينبغي أن ينظر إلى احتمالات الربط الأدنى في منطقة بروتوسبر (المشار إليها في المثلثات السوداء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تصميم DDNA وتضخيمه وتجميعه.يتم استخدام أزواج التمهيدي الأول والثاني (PP1 و PP2) لتضخيم ما يقرب من 800 BP المنبع (5′) و 800 BP المصب (3’) من الجين من الفائدة. يتضمن التمهيدي العكسي لـ PP1 وا الوزير التمهيدي الأمامي لـ PP2 مناطق من homology إلى كاسيت المقاومة الهيغروميسين. الزوج التمهيدي الثالث يضخم كامل الهيغروميسين المقاومة كاسيت. بطريقة تدريجية ، يتم تجميع ابرميكونات مختلفة حتى يتم تجميع dDNA بأكمله ، والتي تتألف من المنطقة 5 ، كاسيت المقاومة الهيغروميسين ومنطقة 3 ‘ . عندما تحولت إلى الخلية، وdDNA ينبغي إعادة تجميع في المنطقة حيث سوف تم توجيه إنزيم Cas9 لقطع، وبالتالي استبدال الجين من الفائدة مع كاسيت مقاومة الهيغروميسين. يمكن استخدام PP4 و PP5 لتحديد ما إذا كان DDNA قد تم إدراجها بشكل صحيح في الجينوم في الموقع المناسب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: أنواع الخلايا المختلفة الهامة خلال بروتوكول استخراج البروتينات.(أ)تستخدم Conidia كمادة البداية للبروتوكول. ويسمح لهذه conidia أن تنبت وتنمو حتى تكون (ب) نبات الشباب. يشار إلى مرحلة النمو المثالي من الجراثيمات الشباب من قبل الأسهم السوداء اثنين. خيوط mycelial الأخرى ينظر على (B) هي ناضجة جدا للتدهور وينبغي عدم استخدامها. الخطوة الأخيرة من البروتوكول هو الإفراج عن (C) جولة protoplasts ، المشار إليها من قبل الأسود ، الدوائر منقط. هذه الخلايا لم يعد لها جدران الخلايا وبالتالي حساسة جدا لتعطيل الميكانيكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: الاندماج الناجح للتكاثة CODON وقف في MAT1-2-7 جين من عمانينسيس H.(أ)الجين H. omanensis MAT1-2-7 الكامل الطول، مع موقع الهدف sgRNA المشار إليه بالسهم الأخضر. (ب) مخطط مكبر لموقع الهدف sgRNA داخل الجين H omanensis MAT1-2-7. (C) مخطط مكبرة من منطقة dDNA تظهر وقف كودون محاطة الأسلحة متجانسة إلى الجين MAT1-2-7 من عمانينسيس H.. (د) صباغ تسلسل سانجر يشير إلى نجاح دمج كودون التوقف في الجين MAT1-2-7. معدلة من ويلسون وآخرون 202021. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: الاختلافات الظاهرية بين (أ) عزل النمط البري وعزل (ب) متحولة.تظهر الصور الثلاث الأولى في كل لوحة الاختلافات في القدرات الجنسية لأنواع العزلة الاثنين. في حين أن عزل النمط البري يشكل أكوماتا ناضجة أثناء الإنجاب الجنسي ، كاملة مع نضح الجراثيم من نصائح الأعناق الماكومية ، فإن عزلات المتحولين تشكل فقط هياكل جنسية غير ناضجة لا تنتج أي جراثيم جنسية. الصورة الرابعة في كل لوحة يظهر الفرق في معدل النمو ومورفولوجيا نوعين عزل. في حين أن عزل النمط البري ينمو بشكل أسرع بكثير ومع المزيد من الزلية الجوية ، يظهر المتحول أبطأ ويغمر داخل agar. معدلة من ويلسون وآخرون 202021. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. رد فعل تركيز الإنزيم تدهور الوقت ألف 1.250 ملغ / مل 180 دقيقة ب 1.875 ملغم / مل 180 دقيقة ج 2.500 ملغ / مل 150 دقيقة د 3.750 ملغم / مل 150 دقيقة ه 4.375 ملغم / مل 120 دقيقة و 5.000 ملغ / مل 120 دقيقة الجدول 1: تدهور حل الجراثيم /الزليّة مع الإنزيمات من تريتشودرما هارزياينوم. تتوافق تركيزات الإنزيمات المختلفة مع فترات حضانة مختلفة ، مع تركيزات أقل تتطلب حضانات أطول.

Discussion

وقد تجلى بروتوكول للتحول الناجح من ه. عمانينسيس وتحرير الجين MAT1-2-7 من خلال إدخال في الإطار وقف كودون السابق لأوانه جنبا إلى جنب مع جين لمقاومة hygromycin B21. وقد تحقق ذلك باستخدام نسخة من البروتين من نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas9. وشملت التجربة النسخ في المختبر من sgRNA، الجمعية القائمة على PCR من DDNA والتحول المشترك من هذه الأحماض النووية اثنين مع إنزيم Cas9 المتاحة تجاريا إلى عمليات بروتبلاستس المستخرجة من H. omanensis

على عكس البروتوكولات الأخرى التي تعتمد على توافر العديد من الأدوات الجزيئية الأخرى ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف أعلاه بنجاح في الأنواع التي لا يزال صندوق الأدوات الجزيئية محدودًا إلى حدما 21. ويعتمد البروتوكول فقط على نظام تحويل راسخ وعلى توافر بيانات الـ NGS، ويفضل أن يكون تسلسل الجينوم بأكمله. وفي حين أن نظام التحول الفعال قد يأخذ بعض التحسين في الأنواع التي لا يتوفر هذا، هناك العديد من البروتوكولات المختلفة المتاحة لمجموعة متنوعة من الأنواع. وعلاوة على ذلك، فإن بيانات الجينوم أصبحت متاحة بشكل متزايد حتى لأكثر الأنواع غموضاً، وأصبحت أسهل في توليدها من جديد إذا لم تكن موجودة بالفعل.

نظراً طول البروتوكول، هناك العديد من الخطوات التي يمكن إدخال التعديلات فيها و حيث قد يكون استكشاف الأخطاء وإصلاحها ضروري. وينطبق هذا بشكل خاص على الخطوات التي تعتبر أنواعًا محددة. على سبيل المثال، هناك العديد من خطوات الحضانة في هذا البروتوكول التي تحتاج إلى أن تجري في درجات حرارة محددة و لأطوال محددة من الزمن من أجل توليد أنواع الخلايا الهامة للتجربة. وهكذا فإن هذه الخطوات تتطلب تحسين نوعي معين. وحيثما أمكن، تم توفير صور صغيرة لخلايا معينة أو مراحل نمو معينة للمساعدة في نقل هذا البروتوكول إلى نوع مختلف (الشكل1). نوع وتركيز الإنزيمات المستخدمة في تحلل جدران الخلايا من الخلايا الفطرية من أجل إطلاق القوّات البروتينة سيكون أيضاً خاصّاً بأنواع الفطريات التي تتم دراستها. في هذا البروتوكول، يتم استخدام مصدر واحد فقط من الإنزيمات من الليسينغ، في حين أن هناك حاجة إلى تركيبات انزيم مختلفة لاستخراج البلاستات في الأنواع مثل Fusarium verticillioides33. هذه الخطوة تعتمد كليا على جعل الكيميائية من جدار الخلية، وبالتالي سوف تحتاج إلى أن تكون الأمثل على الأنواع إلى أساس الأنواع.

هذه الطريقة ذات أهمية خاصة لأولئك الذين يدرسون الأنواع غير النموذجية حيث لا يوجد اعتماد على نظام التعبير. طريقة شعبية لإنشاء CRISPR-Cas9 نظام تحرير الجينوم هو التعبير عن بروتين Cas9، وsgRNA وكذلك DDNA من واحد أو اثنين من البلازميدات التي يتم تحويلها إلى الخلايا المختارة. في هذه الحالة، وكاس 9 يحتاج إلى أن يعبر عنها المروج الذي هو قادر على مستويات عالية من التعبير في كائن معين يجري دراسته. وقد تم تطوير المروجين العامة لاستخدامها في الفطريات الخيطية وعلى الرغم من أنها ليست متوافقة في جميع الأنواع، فإنها تسمح للتعبير مستوى منخفض ويمكن استخدامها بنجاح للتعبير، على سبيل المثال، الجينات مقاومة المضادات الحيوية. ومع ذلك، فإن هؤلاء المروجين لا يسمحون في كثير من الأحيان بمستويات عالية من التعبير وبالتالي لا يمكن استخدامها للتعبير عن بروتين Cas9. باستخدام نسخة قائمة على البروتين من نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 يتغلب على هذا القيد ويسمح لـ SgRNA وdDNA بالانحيار المشترك في الخلية مع إنزيم Cas9 المنتج بالفعل.

وجاء تطوير هذا النظام القائم على البروتين للاستخدام في H. omanensis بعد العديد من المحاولات الفاشلة في تحرير الجينوم باستخدام كل من نهج علامة الانقسام الكلاسيكية وكذلك نظام CRISPR-Cas9 القائم على البلازميد. في حين تختلف الكفاءات من الأنواع إلى الأنواع، وقد تم استخدام نهج علامة الانقسام بنجاح مع كفاءة 100٪ في الأنواع المتنوعة مثل Alternaria alternata34،35، وC. nicotianae36. وعلى النقيض من ذلك، كانت كفاءة هذا النظام في H. omanensis صفر، على الرغم من أكثر من 80 حدث التحول والتكامل المستقل. وبالمثل، تم استخدام نظام CRISPR-Cas9 القائم على البلازميد بنجاح مع كفاءات عالية في Trichoderma reesei (> 93٪)17 و الكريسيوجينوم البنسليوم (حتى 100٪)37. وهذا، مرة أخرى، على النقيض من فائدة هذا النظام في ه. عمانينسيس. لم يكن من الممكن الحصول على تعبير كاف عن بروتين Cas9 في H. omanensis على الرغم من محاولة عدد من المروجين المحتملين ، بما في ذلك اثنين من المروجين للأنواع المحددة المتوقعة من جينات التدبير المنزلي. وبالتالي، لم يكن من الممكن استخدام هذا النظام على الإطلاق. باستخدام البروتين القائم على نسخة من CRISPR-Cas9 النظام، ومع ذلك، أسفرت عن العديد من التحولات المستقلة، اثنان منها إيواء DDNA المتكاملة في الموقع الصحيح. وعلاوة على ذلك، تم محاولة هذه التجربة مرة واحدة فقط وكانت ناجحة – مما يدل على سهولة استخدام هذا النظام.

وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول تحسينه واستخدامه في أنواع أخرى من Ceratocystidaceae. هناك بالفعل ثروة من البيانات NGS المتاحة لهذه الأنواع30,38,39 والدراسات المتعلقة بهم خصوصية المضيف40, وقد أجريت معدل النمو والفوعة41. ويمكن تعزيز هذه الدراسات عن طريق التوصيف الوظيفي للجينات التي يعتقد أنها تشارك في هذه العمليات، وهي البحوث التي ستصبح الآن ممكنة بسبب توافر بروتوكول تحرير الجينوم والتحول.

وفي الختام، أصبح من السهل الوصول إلى إجراء تحقيقات شاملة في الجينات الكامنة في العمليات البيولوجية الهامة في الأنواع غير النموذجية بفضل توافر بروتوكولات سهلة الاستخدام لتحرير الجينوم لا تعتمد على وجود موارد بيولوجية واسعة النطاق ومجموعات أدوات جزيئية. وقد أصبحت دراسة الأنواع غير النموذجية أسهل وستتيح اكتشاف مسارات جديدة وانحرافات مثيرة للاهتمام عن العمليات البيولوجية القياسية التي تم توضيحها في الأنواع النموذجية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا المشروع من جامعة بريتوريا، قسم العلوم والتكنولوجيا/المؤسسة الوطنية للبحوث مركز الامتياز في التكنولوجيا الحيوية صحة الأشجار (CTHB). بالإضافة إلى ذلك تم دعم المشروع من قبل كرسي DST/NRF SARChI للبروفيسور BD Wingfield في علم الجينوم الفطري (رقم المنحة: 98353) بالإضافة إلى منحة الدكتور AM Wilson للدكتوراه (108548). ويقر أصحاب المنح بأن الآراء والنتائج والاستنتاجات أو التوصيات المعرب عنها في هذا العمل هي آراء الباحثين وأن هيئات التمويل لا تتحمل أي مسؤولية على الإطلاق في هذا الصدد.

Materials

EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
  2. Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
  3. Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
  4. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
  5. Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
  6. Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
  7. Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
  8. Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
  9. Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
  10. You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
  11. Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
  12. Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
  13. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
  14. Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
  15. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  16. Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
  17. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
  18. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  19. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  20. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  21. Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
  22. Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
  23. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
  24. Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
  25. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
  26. Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
  27. Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
  28. Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
  29. Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
  30. van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
  31. Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
  32. Sambrook, J., Green, M. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
  33. Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
  34. Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
  35. Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
  36. Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
  37. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  38. van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
  39. Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
  40. Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
  41. Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).

Tags

CRISPR-Cas9Genome EditingHuntiella OmanensisFilamentous AscomyceteNon-model FungiConidiaGermlingsProtoplastsTransformationRibonucleoproteinDonor DNAPTC Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image