Das Manuskript präsentiert vor Ort Probenahmen menschlicher Hirntumoren mit fester Phasenmikroextraktion, gefolgt von ihrer biochemischen Profilierung zur Entdeckung von Biomarkern.
Trotz der Vielzahl von Werkzeugen, die für die Krebsdiagnose und -klassifizierung zur Verfügung stehen, sind Methoden, die eine schnelle und einfache Charakterisierung von Tumoren ermöglichen, immer noch in Not. In den letzten Jahren ist die Massenspektrometrie zu einer Methode der Wahl für die ungezielte Profilierung diskriminierender Verbindungen als potenzielle Biomarker einer Krankheit geworden. Biofluide werden aufgrund ihrer Zugänglichkeit und einfacheren Probenverarbeitung im Allgemeinen als bevorzugte Matrizen betrachtet, während die direkte Gewebeprofilierung selektivere Informationen über einen bestimmten Krebs liefert. Die Aufbereitung von Geweben für die Analyse mit herkömmlichen Methoden ist viel komplexer und zeitaufwändiger und daher nicht für eine schnelle Vor-Ort-Analyse geeignet. Die aktuelle Arbeit stellt ein Protokoll vor, das die Probenvorbereitung und Extraktion kleiner Moleküle direkt nach der Tumorresektion vor Ort kombiniert. Die Probenahmevorrichtung, die die Größe einer Akupunkturnadel hat, kann direkt in das Gewebe eingeführt und dann zur instrumentellen Analyse in das nahe gelegene Labor transportiert werden. Die Ergebnisse von Metabolomik- und Lipidomikanalysen zeigen die Fähigkeit des Ansatzes zur Etablierung von Phänotypen von Tumoren im Zusammenhang mit dem histologischen Ursprung des Tumors, der Malignität und genetischen Mutationen sowie bei der Auswahl diskriminierender Verbindungen oder potenzieller Biomarker. Der zerstörungsfreie Charakter der Technik ermöglicht die Nacherfüllung routinemäßig verwendeter Tests, z. B. histologische Tests, an denselben Proben, die für die SPME-Analyse verwendet werden, und ermöglicht so die Erzielung umfassenderer Informationen zur Unterstützung personalisierter Diagnostika.
Magnetresonanztomographie (MRT) und Computertomographie (CT) sind die wichtigsten Methoden für die Echtzeitanalyse von Hirnläsionen. Die Differenzierung von Hirntumoren basiert in der Regel auf histopathologischer Therapie mit zusätzlichen Färbungen und fortschrittlichen immunhistochemischen Techniken. Laut der aktualisierten Anleitung zu zentralen nervenaufgeponierten Hirntumoren, die 2016 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) herausgegeben wurden, sind genetische Tests entscheidend für die Differenzierung und Klassifizierung dieser Tumoren1. Die Differenzierung und Klassifizierung von Tumoren ermöglicht es Ärzten, die effektivste Behandlung für eine bestimmte Art von Tumor zu wählen und so die Lebenserwartung des Patienten zu erhöhen. Leider, trotz der Verfügbarkeit solcher fortschrittlichen Methoden, um Ärzte bei der Auswahl einer optimalen Therapie für ihre Patienten zu unterstützen, ist die Lebenserwartung der Patienten mit Glioblastom diagnostiziert (IV Grad Gliom) ist nur etwa 15-16 Monate2. Selbst mit der Raffinesse und der erhöhten Genauigkeit der besagten bildgebenden und histologischen Methoden als diagnostische Werkzeuge besteht nach wie vor ein großer Bedarf an neuen Techniken, die Ärzten bei Entscheidungen über den Behandlungsverlauf ergänzende Informationen zur Verfügung stellen können. In den letzten Jahren wurden mehrere neue Ansätze auf der Grundlage der Massenspektrometrie für die intraoperative Analyse von Krebsvorgeschlagen 3,4. Das Potenzial der Solid Phase Microextraction (SPME), der hier vorgestellten Methode, als schnelles Analyseinstrument vor Ort, wurde bereits in einer Vielzahl von Studien nachgewiesen5. Das aktuelle Manuskript zeigt eine der klinischen Anwendungen der Methode, ungezielte Metabolomik und Lipidomik menschlicher Hirntumoren. Ungezielte Untersuchungen stellen einen wichtigen Ausgangspunkt für die Entdeckung potenzieller Biomarker dar. Einmal etabliert, können solche Biomarker dann als diagnostische Referenzen verwendet werden, um zwischen Tumoren mit der gleichen Technologie zu unterscheiden, die an die Vor-Ort-Instrumentierung gekoppelt ist.
SPME ist eine gleichgewichtsbasierte Probenvorbereitungstechnik, die kleine Moleküle aus Probenmatrizen mit der Verwendung kleiner Mengen Extraktionsphase extrahiert. In der traditionellsten Konfiguration des Geräts (Sonde) von SPME wird eine Faser mit einer geeigneten Extraktionsphase beschichtet und auf einer festen Stütze, d.h. einem Metalldraht5,6,immobilisiert. Biokompatible Beschichtungen und Vorrichtungen (Sonden) ermöglichen die direkte Extraktion aus komplexen biologischen Matrizen ohne Probenvorbehandlung, z.B. Homogenisierung und Filtration. Durch den Extraktionsprozess werden die Analyten im Verhältnis zu ihren Anfangskonzentrationen zwischen Extraktionsphase und Probenmatrix aufgeteilt. Wenn die Extraktion lange genug durchgeführt wird, dann wird das Gleichgewicht erreicht. Während die Extraktion im Gleichgewicht die höchstmögliche Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bietet, ist auch die Vorgleichgewichtsextraktion möglich und in einigen Fällen sogar vorzuziehen, d. h. in vivo Probenahmen, bei denen Zeitbeschränkungen im Zusammenhang mit der Probenahme vor Ort (z. B. Betriebs- oder Notfallräume) schnelle Extraktionen erfordern. Das Extraktionszeitprofil eines gegebenen Analyten wird in der Regel durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Analyten, die zu beprobende Matrix, die Art des verwendeten Sorbens und mehrere andere Extraktionsbedingungen beeinflusst. Die Fülle von Faktoren, die ihre Extraktionskinetik bestimmen, macht es praktisch unmöglich, eine Gleichgewichtsextraktion aller Verbindungen zu gewährleisten, wenn ungezielte Analysen wie Metabolomik oder Lipidomik durchgeführt werden. Aus den oben genannten Gründen wurde die Extraktionszeit des aktuellen Protokolls willkürlich festgelegt, um einerseits eine zufriedenstellende Empfindlichkeit und Abdeckung von Metaboliten und andererseits die Praktikabilität für den Einsatz vor Ort zu gewährleisten.
Es sollte betont werden, dass die sehr geringe Größe der Sonden, die für die Extraktion von Proben aus Geweben verwendet werden, nur minimale Gewebeschäden verursacht, während das Probenahmeverfahren selbst kein Gewebe, sondern sehr kleine Mengen kleiner Moleküle aus dem probengebundenen Bereich verbraucht; Daher kann dieselbe Probe für Routinetests, d. h. histologische oder genetische, weiter verwendet werden, was die Erzielung wesentlicher und ergänzender Informationen aus derselben Probe ermöglicht. Solche ergänzenden, umfassenden Daten würden ein besseres Verständnis der Tumorbiologie ermöglichen und hoffentlich die Entdeckung neuer Behandlungsziele erleichtern. Die Nutzung dieser Methode erhöht die Möglichkeit der intraoperativen Diagnostik vor Ort bei der Bestimmung von Zielbiomarkern weiter.
Im Folgenden stellen wir Protokolle zur Probenahme von Hirntumoren vor Ort für Metabolomik- und Lipidomikanalysen und Datenverarbeitung vor.
Ungezielte Metabolomik und Lipidomik werden häufig in Studien verwendet, die sich auf die Identifizierung von Tumorbiomarkern konzentrieren. In den meisten Fällen suchen die Forscher jedoch nach Verbindungen, die zum Screening der Krankheit verwendet werden können. Folglich sind die bevorzugten biologischen Proben Blut oder Urin aufgrund ihres relativ einfachen Zugangs. Die Analyse des Tumorgewebes wird hauptsächlich durchgeführt, um die Mechanismen hinter der Krankheit zu verstehen, verschiedene Tumortypen zu charakterisieren usw. Die Vor-Ort-Analyse von Tumorbiomarkern wird nur selten durchgeführt, da solche Anwendungen eine umfangreiche Probenvorbereitung erfordern. Alternativ verdienen Strategien, die auf der Echtzeitanalyse von Gewebeprofilen ohne Vorauswahl spezifischer Biomarker basieren, die Aufmerksamkeit der medizinischen Gemeinschaft3,4. Die hier vorgestellte Lösung bietet eine weitere Perspektive auf die Gewebeverarbeitung vor Ort, indem sie die Art von Informationen enthüllt, die mit solchen Methoden gewonnen werden können.
Die Kombination aus Probenahme, Probenvorbereitung und Extraktion macht SPME zu einem sehr nützlichen Werkzeug für die Vor-Ort-Analyse. Darüber hinaus ermöglicht der fehlende Gewebeverbrauch während der Probenahme die weitere Verwendung derselben Proben für Biomarkeranalysen und Routinetests (Genotypisierung, histologische Analyse), wodurch den Ergebnissen der Standardtests neue Informationen hinzugefügt werden. Das Probenahmegerät hat ein sehr einfaches Design, seine Bedienung ist sehr einfach, und es ist kein spezielles Training erforderlich, um die Extraktion selbst durchzuführen. Das Erreichen zuverlässiger Ergebnisse erfordert jedoch viel mehr als nur die ordnungsgemäße Handhabung von Geräten. Um das Experiment richtig durchführen zu können, muss man den Extraktionsprozess, die Art der Probe verstehen und sich möglicher Fehler bewusst sein, die die Daten beeinflussen können.
Es ist wichtig, die Heterogenität des Krebsgewebes zu berücksichtigen10; beprobte Tumoren können Teile enthalten, die einer Nekrose, Verkalkung und Hypoxie unterzogen werden, und jeder dieser Prozesse wird im metabolom und lipidom erreicht enthont, wodurch die Ergebnisse beeinflusst werden. Daher wird empfohlen, die räumliche Auflösungsprobenahme durch Einsetzen mehrerer Fasern in verschiedenen Teilen des Krebsgewebes durchzuführen, oder alternativ, dass eine längere Beschichtung verwendet wird, um den gesamten Tumor zu durchdringen, um gemittelte Informationen über den Tumor zu erhalten. Wenn die Probenahmemethode für die räumliche Auflösung durchgeführt wird, können Fasern alle in ein Desorptionslösungsmittel desorbieren werden; dies würde nicht nur die Erzielung von Gesamtinformationen über den Tumor ermöglichen, sondern auch die Empfindlichkeit der Analyse erhöhen. Alternativ würde die Desorption einzelner Fasern in separate Fläschchen es den Untersuchungen ermöglichen, die innere Vielfalt des Hirntumors, der aus dem aus Krebszellen gebauten Kern besteht, und der äußeren Zone, die die Grenze von gesundem Gewebe ist, herauszufinden. Tiefere Teile des Tumors sind in der Regel mehr durch die Prozesse im Zusammenhang mit Krebs11geschädigt. Die Ermittler müssen jedoch bedenken, dass diese Option die Methodsensitivität und die Gesamtzahl der nachweisbaren Verbindungen gefährdet. Bei den aktuellen Arbeiten wurde eine 7-mm-Beschichtung verwendet; diese Länge wurde als optimal für verschiedene Größen von Tumoren in der Studie enthalten. Die Beschichtungen drangen in die Tumore ein und lieferten somit eine nicht spezielle Auflösung, aber gemittelte Daten in der gesamten Probe. Unabhängig vom gewählten Protokoll ist es wichtig, dass während der gesamten Studie dasselbe Protokoll befolgt wird, einschließlich der Anzahl der Fasern, die für die individuelle Probenahme verwendet werden, der Länge der Beschichtung, der Extraktionszeit und allen anderen Faktoren, die in dieser Arbeit abgegrenzt sind.
Es ist wichtig, die Qualität der Analyse zu kontrollieren. Das gepoolte QC (siehe Schritte 4.7 und 7.7 im Protokoll) sollte für die Überwachung der Gerätestabilität während des Ablaufs der gesamten Probencharge vorbereitet und verwendet werden. Die Leerensteuerungen (siehe Schritt 2.8) können später verwendet werden, um eine “Ausschlussliste” zu erstellen, um Signale von Verunreinigungen aus Lösungsmitteln oder der Faserherstellung zu beseitigen. In besonderen Fällen, z. B. bei der Gefahr einer Kontamination, ist es erforderlich, Proben von Handschuhen, Tischen, Geräten oder anderen Oberflächen durchzuführen, die ein Kontaminationsrisiko darstellen können. In solchen Fällen sind faservorbereitungs-, Extraktionszeit- und Desorptionsprotokolle die gleichen wie bei den Proben.
Metabolomische und lipidomische Analysen konzentrieren sich ausschließlich auf kleine Moleküle (weniger als 1.500 Da), die in einem Organismus oder bestimmten Komponenten des Organismus auftreten, wie bestimmte Organe, Gewebe, Flüssigkeiten, Zellen usw. Metabolomicundik und Lipidomik bieten eine Momentaufnahme der biochemischen Veränderungen im Körper, und im Falle von Krebs, sie integrieren Informationen über das Genom, Histologie, und Malignität des Tumors. Diese Omics-Wissenschaften schaffen eine Verbindung zwischen Physiologie und Phänotyp, da Metaboliten in der biochemischen Leiter höher sind als Proteine oder Gene12. Durch das Verständnis des Metaboloms und Lipidoms von Krebstumoren kommen wir der Entdeckung des Phänotyps unter allen -omics-Wissenschaften näher, da diese Studienzweige ein tieferes Wissen über dynamische Veränderungen von Molekülen als Reaktion lebender Organismen auf verschiedene Reize bieten. Wie in dieser Arbeit dargestellt, entsprechen die in einer Probenahme gewonnenen Daten der Histologie des Krebses, seinem Grad der Malignität, und es spiegelt Veränderungen wider, die auf Genomebene auftreten. Bei Gliomen, der Art des Krebses, der in dieser Studie von Interesse ist, sind die im Genom verborgenen Informationen besonders wichtig, da eine personalisierte Behandlung auf der Grundlage der Ergebnisse genetischer Tests entwickelt wird. Besondere Mutationen sind prognostische Marker der Ergebnisse der Chemo- oder Strahlentherapie. Wie hier gezeigt, ist die Auswahl von Biomarkern, die eine bestimmte Mutation widerspiegeln, mit der vorgeschlagenen Strategie möglich. Mutationsmarker, sowie zusätzliche Deskriptorentypen, wie diejenigen, die den Grad der Malignität des Tumors angeben, können auch verwendet werden, um routinemäßige diagnostische Methoden zu unterstützen.
Die ex vivo chemische Biopsie unter Verwendung von Festphasen-Mikroextraktionsfasern ist der erste Schritt bei der Anwendung des Verfahrens auf die intraoperative Diagnostik. Die Methode kann leicht für In-vivo-Proben entnommen werden, bis die Genehmigung durch geeignete Ethik-Gremien erteilt wird. In solchen Fällen muss die Sterilisation von SPME-Geräten gemäß den akzeptierten Sterilisationsverfahren des Krankenhauses durchgeführt werden, in dem die Probenahme durchgeführt werden soll, d. h. Autoklavierung oder Ethylenoxidsterilisation. Die vorkonditionierten und sterilisierten Fasern müssen in versiegelten Verpackungen aufbewahrt werden, die mit einem Sterilisationsablaufdatum gekennzeichnet sind. Es ist wichtig zu beachten, dass Fasern nicht mit der Verwendung von Tensiden gereinigt werden sollten. Ein solches Verfahren kann zu unspezifischen Veränderungen der Sorptionszusammensetzung führen und somit die Extraktion von Analyten beeinträchtigen. In den hier beschriebenen Studien wurde eine Extraktionsphase von 30 min verwendet, aber andere Berichte bestätigen, dass kürzere Zeiten in in vivo-Studien zufriedenstellende Ergebnisse liefern können13. Huq et al. zeigten, dass die Analytgleichgewichtszeit im Gewebe als komplexe Matrix schneller erreicht wird als in einfachen Matrizen14. Die Reproduzierbarkeit der erzielten Ergebnisse kann jedoch unter kürzeren Extraktionszeiträumen beeinträchtigt werden, da mehr Analyten unter Vorgleichgewichtsbedingungen extrahiert werden; daher muss eine genaue Zeitregelung implementiert werden.
Beide im Rahmen dieser Arbeit genutzten Omics-Wissenschaften haben ein ausgezeichnetes Potenzial als Biomarker-Entdeckungswerkzeuge. Sobald Biomarker ausgewählt oder ein chemometrisches Modell erstellt ist, kann die medizinische Diagnostik auf der Grundlage der Bestimmung von Zielmetaboliten über Methoden, die für Vor-Ort-Untersuchungen geeignet sind, wie der in dieser Arbeit beschriebene SPME-Ansatz, im Rahmen der Routinediagnostik entwickelt und implementiert werden.
Das in diesem Manuskript vorgeschlagene Protokoll beschreibt, wie ungezielte metatonomische und lipidomische Analysen von Krebsgewebe unter Verwendung der Solid-Phasen-Mikroextraktion zum Screening potenzieller Biomarker durchgeführt werden können. Es wurde entwickelt, um die Extraktion repräsentativer Verbindungen, die Differenzierung von Tumoren und die Identifizierung diskriminierender Verbindungen zu ermöglichen, die einen bestimmten Krebs charakterisieren, d. h. potenzielle Biomarker. Die in diesem Artikel beschriebenen ungezielten Analysen mit SPME stellen einen Ausgangspunkt für die Entwicklung einer schnellen intraoperativen Diagnostik dar, bei der ein ausgewähltes Wirkstoffpanel ohne die Notwendigkeit eines Screenings aller in der Probe vorhandenen Verbindungen bestimmt werden kann. Im Interesse schneller diagnostischer Ergebnisse könnten SPME-Sonden, die für die Vor-Ort-Extraktion verwendet werden, direkt an analytische Instrumente gekoppelt werden, die sich in der Krankenhauseinrichtung befinden. Einfache Extraktionen, die mit minimaler Probenvorbereitung und anschließender chromatographiefreier Analyse durchgeführt werden, würden die Gesamtzeit von Stunden auf wenige Minuten erheblich verkürzen, wie bereits für die Arzneimittelüberwachung beschrieben15.
The authors have nothing to disclose.
Die Studie wurde durch das Stipendium Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 vom National Science Centre unterstützt. Die Autoren möchten MilliporeSigma, ein Unternehmen der Merck KGaA, Darmstadt, für die Bereitstellung der in dieser Arbeit verwendeten SPME-Geräte würdigen. Das Life-Science-Geschäft von Merck firmiert als MilliporeSigma in den USA und Kanada. Außerdem möchten die Autoren Thermo Fisher Scientific für den Zugang zum Q-Exactive Focus Orbitrap-Massenspektrometer danken.
Beiträge der Autoren: JB: Optimierung der Probenvorbereitung und LC-MS-Parameter, Durchführung von SPME-LC-MS-Experimenten, Datenanalyse, statistische Analyse und Dateninterpretation und Manuskriptvorbereitung im Zusammenhang mit Lipidomik-Teil; PZG: Koordination und Durchführung der meisten Stichproben im Krankenhaus, Optimierung der Parameter für die Probenahme und Probenvorbereitung, Durchführung von SPME-LC-MS-Experimenten, Datenanalyse, statistische Analyse und Dateninterpretation, Manuskriptvorbereitung im Zusammenhang mit Metabolomik Teil; MG – Unterstützung bei der Optimierung der Probenvorbereitung, LC-MS-Methode und Datenanalyse im Zusammenhang mit Lipidomik-Teil; KG: Ko-Performance von SPME-Probenundproben und Optimierung der Probenahme und Probenvorbereitung, SPME-LC-MS-Analyse im Zusammenhang mit Metabolomik-Teil; KC: Durchführung mehrerer SPME-Proben im Krankenhaus, Unterstützung bei der Optimierung der Probenahme, Probenvorbereitung und Datenanalyse im Zusammenhang mit metabolomics Teil; KJ: Durchführung mehrerer SPME-Proben im Krankenhaus, Unterstützung bei der Lipidomik-Analyse; DP: Durchführung chirurgischer Eingriffe, Rekrutierung der Patienten; JF: Durchführung chirurgischer Eingriffe, Rekrutierung der Patienten; MH: Durchführung chirurgischer Eingriffe, Koordination des klinischen Teils der Forschung; BB: Konzept, Koordinationsüberwachung des Projekts und Manuskriptvorbereitung, Durchführung mehrerer Stichproben
acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |