メタボロミクス解析とリピドミクス解析のための脳腫瘍の現場でのサンプリングと抽出
Summary
この原稿は、ヒト脳腫瘍の現場サンプリングを固相微小抽出と共に、バイオマーカーの発見に向けた生化学的プロファイリングを行った。
Abstract
がんの診断と分類に利用できるさまざまなツールにもかかわらず、腫瘍の迅速かつ簡単な特性評価を可能にする方法はまだ必要です。近年、質量分析は、疾患の潜在的バイオマーカーとして差別性化合物の非標的プロファイリングに選択される方法となっている。生体流体は一般的に、そのアクセシビリティと簡単なサンプル処理を与えられた好ましいマトリックスと考えられ、直接組織プロファイリングは特定の癌に関するより選択的な情報を提供する。従来の方法による分析のための組織の調製は、はるかに複雑で時間がかかるため、迅速なオンサイト分析には適していません。現在の研究は、腫瘍切除直後に、現場での小分子のサンプル調製と抽出を組み合わせたプロトコルを提示する。鍼針の大きさのサンプリング装置は、組織に直接挿入し、器械分析のために近くの実験室に運ぶことができます。メタボロミクスおよびリピドミクス分析の結果は、腫瘍の組織学的起源、悪性腫瘍、遺伝子変異に関連する腫瘍の表現型の確立、ならびに識別化合物または潜在的なバイオマーカーの選択に対するアプローチの能力を示す。この技術の非破壊的な性質により、SPME分析に使用される同じサンプル上で、例えば組織学的検査など、日常的に使用されるテストのその後のパフォーマンスが可能となり、パーソナライズされた診断をサポートするために、より包括的な情報を得ることができます。
Introduction
磁気共鳴画像法(MRI)とコンピュータ断層撮影(CT)は、脳病変のリアルタイム分析に使用される主な方法です。脳腫瘍分化は、一般に、追加の染色および高度な免疫組織化学的技術を用いた組織病理学に基づく。2016年に世界保健機関(WHO)が発行した中枢神経脳腫瘍に関する最新のガイダンスによると、遺伝子検査はこれらの腫瘍の分化と分類に不可欠です。腫瘍の分化と分類により、医師は特定のタイプの腫瘍に対して最も効果的な治療法を選択することができ、それによって患者の平均余命が拡大する。残念ながら、医師が患者に最適な治療法を選択するのを助けるこのような高度な方法が利用可能であるにもかかわらず、神経膠芽腫と診断された患者の平均余命(IVグレード神経膠腫)はわずか15〜16ヶ月2である。診断ツールとしての画像および組織学的方法の高度化と精度の向上があっても、治療の経過に関する決定において医師を支援するための補完的な情報を提供できる新しい技術が依然として大きなニーズを持っています。過去数年間、癌3,4の術中分析のために質量分析法に基づくいくつかの新しいアプローチが提案されてきた。固相マイクロ抽出(SPME)の電位は、本明細書で提示される方法は、迅速なオンサイト分析ツールとして、様々な研究5で既に実証されている。現在の原稿は、この方法の臨床応用の1つである、ヒト脳腫瘍の標的化されていないメタボロミクスおよびリピドミクスを示している。対象を絞り込んだ調査は、潜在的なバイオマーカーの発見において重要な出発点となります。確立されると、このようなバイオマーカーは、オンサイトのインストルメンテーションに結合された同じ技術を使用して腫瘍を区別するための診断参照として使用することができます。
SPMEは、少量の抽出段階を使用してサンプルマトリックスから小分子を抽出する平衡ベースのサンプル調製技術です。SPMEの装置(プローブ)の最も伝統的な構成では、繊維は適切な抽出相で被覆され、固体支持体すなわち、金属線5、6に固定化される。生体適合性のコーティングおよびデバイス(プローブ)は、サンプル前処理、均質化およびろ過を行うことなく、複雑な生物学的マトリックスから直接抽出を可能にします。抽出プロセスを通じて、分析物は抽出フェーズとサンプルマトリックスの間で、初期濃度に比例して分割されます。抽出が十分に長く行われれば、平衡が達成される。平衡時の抽出は可能な限り最高の感度と再現性を提供するが、平衡前抽出も可能であり、場合によっては好ましい場合、オンサイトサンプリング(例えば、手術室または救急外来)に関連する時間制限が必要なインビボサンプリングでも好ましい。所与の分析物の抽出時間プロファイルは、一般に、検体の物理化学的性質、サンプリングされるマトリックス、使用される吸着剤の種類、および他のいくつかの抽出条件の影響を受ける。その抽出キネティクスを支配する多くの因子は、メタボロミクスやリピドミクスなどの非標的分析が行われると、すべての化合物の平衡抽出を確実にすることが事実上不可能になります。上記の理由から、現在のプロトコルの抽出時間は、一方で代謝物の満足のいく感度とカバレッジを確保するために任意に設定され、他方で現場で使用するための実用性を確保した。
組織からのサンプルの抽出に使用されるプローブの非常に小さいサイズは、サンプリング手順自体が組織を消費するのではなく、サンプリングされた領域から非常に少量の小分子を消費する一方で、最小限の組織損傷を引き起こすことを強調する必要があります。したがって、同じサンプルは、定期的な検査、すなわち、組織学的または遺伝的に、同じサンプルからの本質的かつ補完的な情報の達成を可能にするのにさらに使用することができる。このような補完的で包括的なデータは、腫瘍生物学のより良い理解を可能にし、うまくいけば新しい治療目標の発見を促進するであろう。この方法を利用すると、標的バイオマーカーを決定する際に、オンサイトの術中診断の可能性がさらに高まります。
以下では、メタボロミクスおよびリピドミクス分析およびデータ処理のための脳腫瘍を現場でサンプリングするためのプロトコルを提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
非標的メタボロミクスおよびリピドミクスは、腫瘍バイオマーカーの同定に焦点を当てた研究で一般的に使用される。しかし、ほとんどの場合、研究者は病気のスクリーニングに使用できる化合物を探します。その結果、好ましい生物学的サンプルは、比較的容易にアクセスしやすいため、血液または尿である。腫瘍組織の分析は、主に疾患の背後にあるメカニズムを理解し、異なる腫瘍タイプを特徴付けるために行われます。腫瘍バイオマーカーの現場での分析はほとんど行われないです, そのようなアプリケーションは、広範なサンプル調製を必要とするので、.あるいは、特定のバイオマーカーの事前選択なしに組織プロファイルのリアルタイム分析に基づく戦略は、医学界3、4の注目を集めています。本明細書に示すソリューションは、そのような方法で得ることができる情報の種類を明らかにすることによって、現場で組織処理に関する別の視点を提供します。
サンプリング、サンプルの準備、抽出の組み合わせにより、オンサイト分析に非常に便利なツールとしてSPMEがレンダリングされます。さらに、サンプリング中の組織消費の不足により、バイオマーカー分析とルーチンテスト(ジェノタイピング、組織学的解析)に同じサンプルを使用することができ、標準試験の結果に新しい情報を追加できます。サンプリングデバイスは非常にシンプルな設計をしており、その操作は非常に簡単で、抽出自体を実行するための特別な訓練は必要ありません。しかし、信頼性の高い結果を得るには、デバイスの適切な処理以上のものが必要です。実験を適切に実行するには、抽出プロセス、サンプルの性質を理解し、データに影響を与える可能性のある間違いを認識する必要があります。
癌組織10の不均一性を考慮することが重要である。サンプルされた腫瘍は壊死、石灰化、低酸素症を起こしている部分を含むことがあり、これらのプロセスのそれぞれがメタボロームおよびリピドームに反映され、結果に影響を与える。したがって、空間分解能サンプリングは、癌組織の異なる部分に複数の繊維を挿入することによって行うか、あるいは、腫瘍に関する平均情報を得るために腫瘍全体を浸透させるためにより長いコーティングを使用することを推奨する。空間分解サンプリング法を実行すると、繊維はすべて1つの脱離溶媒に脱離することができます。これは腫瘍に関する全体的な情報の達成を可能にするだけでなく、分析の感受性を高める。あるいは、個々の繊維を別々のバイアルに脱離することで、癌細胞で構成される脳腫瘍の内部多様性と、健康な組織の境界である外帯を解明するための調査が可能になる。腫瘍のより深い部分は、通常、癌11に関連するプロセスによってより損傷を受ける。しかし、研究者は、このオプションは、方法の感度と検出可能な化合物の全体的な数を損なう点に留意する必要があります。現在の作業では、7ミリメートルのコーティングが使用されました。この長さは、研究に含まれる腫瘍の様々なサイズに最適であると考えられていた。コーティングは腫瘍を貫通し、非特殊な分解能を提供したが、サンプル全体の平均データを提供した。選択されたプロトコルに関係なく、個々のサンプリングに使用される繊維の数、コーティングの長さ、抽出時間、およびこの研究で説明される他のすべての要因を含む、研究全体の間に同じプロトコルに従うことが重要です。
解析の品質を制御することが重要です。プールされた QC (プロトコルのステップ 4.7 および 7.7 を参照) を準備し、サンプル バッチ全体の実行中に機器の安定性を監視するために使用する必要があります。ブランク制御(ステップ2.8を参照)は、溶媒または繊維製造から発生する汚染物質の信号を除去する「除外リスト」を後で作成するために使用することができます。汚染の危険性など、特別な場合には、汚染のリスクを引き起こす可能性のある手袋、テーブル、装置、その他の表面からのサンプリングを行う必要があります。このような場合、繊維調製、抽出および脱離プロトコルの時間は、サンプルと同じである。
メタボロミクスおよびリピドミカル解析は、生物に現れる小分子(1,500 Da未満)、または特定の器官、組織、液体、細胞などの生物の特定の成分に完全に焦点を当てています。メラボロミクスとリピドミクスは、体内で生化学的変化が起き、がんの場合は、腫瘍のゲノム、組織学、悪性腫瘍に関連する情報を統合します。これらのオミクス科学は、代謝産物がタンパク質または遺伝子12よりも生化学的なはしごの上にあるように生理学と表現型の間の接続を作成します。癌性腫瘍のメタボロムとリピドメを理解することで、これらの研究部門が様々な刺激に対する生物の反応として分子の動的変化に関するより深い知識を提供するので、我々はすべてのオミクス科学の間で表現型を発見することに近づく。本研究で示したように、1回のサンプリングで得られたデータは、癌の細胞質の細胞質、悪性腫瘍の程度に対応し、ゲノムレベルで起こる変化を反映している。神経膠腫では、この研究に関心のある癌の種類として、ゲノムに隠された情報は特に重要であり、遺伝子検査の結果に基づいてパーソナライズされた治療法が開発される。特定の突然変異は、化学療法または放射線療法の結果の予後マーカーである。ここで示したように、提案された戦略では、所定の突然変異を反映するバイオマーカーの選択が可能である。突然変異マーカーは、腫瘍の悪性度を示すものなどの追加の記述子タイプと同様に、日常的な診断方法をサポートするためにも使用され得る。
固相マイクロ抽出繊維を用いてのエキビボ化学生検は、術中診断法への応用の第一歩である。この方法は、適切な倫理委員会からの許可を保留しているin vivoサンプリングに対して簡単に採用することができます。このような場合、SPMEデバイスの滅菌は、サンプリングが運ばれる病院の受け入れられた滅菌手順、すなわちオートクレーブまたはエチレンオキシド滅菌に従って行われなければならない。事前に調整され、滅菌された繊維は、殺菌期限が付いた密封されたパッケージに保管する必要があります。繊維は界面活性剤を使用して洗浄すべきではないことに注意することが重要です。このような手順は、吸着剤組成の非特異的な変化を引き起こし、したがって、分析物の抽出に影響を与える可能性があります。本明細書に記載の研究では、30分の抽出期間が使用されたが、他の報告では、より短い時間が、生体内研究13において満足のいく結果を生じさせることができると検証している。Huqらは、単純行列14よりも複雑なマトリックスとして、組織において検体平衡時間がより速く達成されることを示した。しかし、より多くの分析物が平衡前の条件下で抽出されるように得られた結果の再現性は、より短い抽出期間の下で損なわれる可能性があります。したがって、正確な時間制御を実装する必要があります。
この研究の一環として利用されたオミックス科学の両方は、バイオマーカー発見ツールとして優れた可能性を秘めています。バイオマーカーを選択するか、または化学測定モデルを確立すると、本研究で説明するSPMEアプローチのようなオンサイト調査に適用可能な方法を介して標的代謝産物の決定に基づく医療診断を、ルーチン診断の一部として開発し、実施することができる。
本稿で提案されている議定書は、潜在的なバイオマーカーのスクリーニングのための固相微小抽出を用いて癌組織の非標的性メタボロミックおよびリピドミック分析を行う方法を説明する。代表的な化合物の抽出、腫瘍の分化、および特定の癌すなわち潜在的なバイオマーカーを特徴付ける差別的化合物の同定を可能にするように設計されている。この記事で説明されているSPMEによる非標的分析は、迅速な術中診断の開発の出発点であり、サンプル中に存在するすべての化合物をスクリーニングする必要なしに選択された化合物のパネルを決定することができる。迅速な診断結果のために、現場での抽出に使用されるSPMEプローブは、病院施設にある分析機器に直接結合することができます。最小限のサンプル調製とクロマトグラフィーフリー分析で行う単純な抽出は、薬物モニタリング15に関して既に説明されているように、全体の時間を数時間から数分に大幅に短縮するであろう。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学センターからの助成金ハルモニア2015/18/M/ST4/00059によって支えられた。著者らは、メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツのビジネスであるMilliporeSigmaが、この作業で使用されるSPMEデバイスを提供していることを認めたいと考えています。メルクのライフサイエンス事業は、米国とカナダでミリポアシグマとして事業を展開しています。また、著者らは、Q-Exactive Focus軌道質量分析計へのアクセスに対するサーモフィッシャーサイエンティフィックに感謝したいと考えている。
著者の貢献: JB: サンプル調製およびLC-MSパラメータの最適化, SPME-LC-MS実験のパフォーマンス, データ解析, 統計解析とデータ解釈とリピドミクス部分に関連する原稿調製;PZG:病院でのサンプリングの大部分の調整とパフォーマンス、サンプリングおよびサンプル調製パラメータの最適化、SPME-LC-MS実験の性能、データ分析、統計解析およびデータ解釈、メタボロミクス部分に関連する原稿調製。MG – サンプル調製の最適化、LC-MS法およびリピドミクス部分に関連するデータ分析の支援;KG:SPMEサンプリングの共同性能とサンプリングおよびサンプル調製の最適化、メタボロミクス部分に関連するSPME-LC-MS分析。KC:病院での複数のSPMEサンプリングの性能、サンプルの最適化、サンプル調製、メタボロミクス部分に関連するデータ分析の支援。KJ:病院でいくつかのSPMEサンプリングのパフォーマンス、リピドミクス分析の支援;DP:外科的処置のパフォーマンス、患者の募集;JF:手術のパフォーマンス、患者の募集;MH: 手術のパフォーマンス, 研究の臨床部分の調整;BB:コンセプト、プロジェクトのコーディネート監督、原稿の準備、いくつかのサンプリングのパフォーマンス
Materials
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
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