Een Drosophila Model om wound-geïnduceerde polyploïdie te bestuderen

1. Enscenering en wond van volwassen fruitvliegjes Selecteer D. melanogaster stam van keuze (d.w.z., epi-Gal4/ UAS stam, zie Tabel van Materialen).OPMERKING: Hier wordt het Gal4/UAS-systeem gebruikt om epitheliale specifieke genexpressie (epi-Gal4) van een gen of RNAi gecodeerd stroomafwaarts van UAS mogelijk te maken. Deze studie maakt gebruik van fluorescerend membraaneiwit (UAS-Cd8.mRFP), mitotische inducer (UAS-fzrRNAi, UAS-stg) en WIP-remmer (UAS-E2F1RNAi; UAS-RacDN). Verzamel twee flesjes van 10-15 nieuw ingesloten vrouwelijke fruitvliegjes elk en leeftijd op verse voedsel flesjes op 25 °C tot 3-5 dagen oud. Een flesje zal dienen als de ongewonde controle en de andere flacon zal gewond raken zoals hieronder beschreven. De vrouwelijke vliegen moeten worden gehandhaafd met mannetjes (~ 5 /flacon). Om de vliegen te verwonden, monteren verschillende pinhouders elk met een enkele 0,10 mm roestvrijstalen pin. Zorg ervoor dat het scherpe uiteinde van de pin naar buiten gericht is. Pinnen kunnen gemakkelijk buigen of chipen na het doorboren van de vlieg en verslaafde of beschadigde pinnen moeten worden weggegooid. Verdoof de oude vrouwelijke fruitvliegjes op een CO2-vliegkussenonder een stereomicroscoop en lijn ze uit in een rij met behulp van een penseel. Het dragen van een veiligheidsbril, het houden van de pin houder in de ene hand en tangen in de andere, gebruik tangen om een vlieg positie met zijn ventrale buik naar boven. Doorprik het volwassen vrouwtje vliegt binnen het epitheel pleuraatgebied van tergiet A4 aan weerszijden van de ventrale middellijnventen(figuur 1A). Doorspekteren dit ventrale gebied biedt optimale ruimte weg van de dissectie sites waar weefsel randen zullen worden gescheurd door mechanische verwerking. Breng gewonde vliegen terug naar het voedsel flesje en leeftijd naar de gewenste dag na letsel (dpi). Epitheelwondengenezing begint bij 1 dpi en eindigt met 3 dpi. Endoreplicatie pieken op 2 dpi, wat ideaal is voor de EdU-test (punt 4, figuur 2). 2. Vlieg buikdissectie OPMERKING: Tijdens deze stap is het belangrijk om te voorkomen dat het ventrale buikweefsel wordt aangeraakt met de dissectiegereedschappen, omdat het de integriteit van het epitheel in gevaar brengt. Verkrijg alle benodigde materialen voor ontleding: Grace’s oplossing, tangen, Vanna’s Spring Scissors, 0,10 mm pinnen, ontleedplaten, 9 goed glazen dissectieschotel, fixatieve oplossing (4% paraformaldehyde in 1x PBS), 1x PBS, doekjes, pipettes en tips voor 30 μm, en handschoenen (zie Tabelmaterialen). Bevestig dat vliegen met succes gewond zijn geraakt door het verdoven van gewonde vliegen op een CO2-vliegkussenonder een stereomicroscoop en controleren op de aanwezigheid van het wondlitteken (d.w.z. een melaninevlek op de buik, zie figuur 1B). Gooi vliegen weg uit de experimentele groep die niet met succes gewond raakten. Om te beginnen dissectie, vul een put van een 9 goed glazen dissectie schotel met Grace’s oplossing. Gebruik een paar tangen om een gewonde vrouwelijke vlieg te grijpen door de rugzijde van de thorax en dompel de vlieg onder in de put met Grace’s oplossing. Met behulp van tangen in de andere hand zonder het vrijgeven van de thorax, punctie de dorsale cuticula onder tergite A6 en trek de cuticula van de achterkant van de fruitvlieg. De inwendige organen (eierstok en darm) zal meestal komen bij deze stap. Zo niet, duw dan voorzichtig op de rugzijde van de buik met de tangen om de resterende organen eruit te persen en in een lege put te gooien. Klik uit de volle buik bij de thoraxverbinding boven tergite A2 met behulp van de tangen en breng de buik over naar een lege put met ~100 μL van Grace’s oplossing. Herhaal stappen 2.3-2.5 totdat alle vliegenbuiken zijn ontleed. Verminder het volume van Grace’s oplossing tot 30 μL in de put met gepoolde, ontleedbuik. Fileer de buiken open door de positie van de buik op de rugzijde met de tangen in de ene hand en vervolgens het invoegen van het onderste blad van van vanna’s lente schaar in de buikholte met de andere hand. Snijd langs de dorsale middellijn tot de buik volledig is geopend, wat tot drie sneden kan vereisen(figuur 1C, 1D). Zet een droge ontleedplaat met vier pinnen van 0,10 mm per buikbevestigingsgebied. Elke 35 mm ontleden plaat past maximaal zeven montagegebieden. Pipette 30 μL van Grace’s oplossing op elk montagegebied en breng één gefileerde buik over naar elke druppel. Speld de gefileerde buiken aan de schotel op de vier rughoeken(figuur 1E). Zorg ervoor dat het weefsel plat ligt zonder het buikweefsel te scheuren of te overbelasten. Om het weefsel te repareren, pipet uit de Grace’s oplossing en voeg 30 μL van de fix oplossing aan de vastgemaakte buik.LET OP: Draag handschoenen tijdens het hanteren van de fix oplossing, omdat paraformaldehyde giftig is. Herhaal stappen 2.10-2.11 totdat alle gefileerde buiken op de ontleedplaat zijn gespeld. Plaats een tape label op de bodem van elk gerecht om elke controle en experimentele groep te markeren. Fix monsters voor 30-60 min op kamertemperatuur (RT). Was de oplossing door op elke plaat op 1,5 mL van 1x PBS te pipetten. Gooi fixoplossing en kunststoffen in geschikte containers voor vloeibaar of droog chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen. Was platen 2x met 1,5 mL 1x PBS en bewaar vast weefsel bedekt met 1,5 mL van 1x PBS in een plastic container met deksel. Voeg een laag vochtige papieren handdoek toe aan de bodem van de container en bewaar monsters op 4 °C tot ze binnen 1 week na de ontleding klaar zijn om immunostain. 3. Immunofluorescentie Reagentia vers bereiden (zie tabel met materialen):wasbufferoplossing (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA in 1x PBS). Restjes wasbuffer kan worden opgeslagen bij 4 °C en gebruikt worden voor de duur van het 2-daagse kleuringsprotocol. Bereid voldoende primaire antilichaamoplossing per test (Figuur 2) met behulp van Anti-FasIII (1:50 muis anti-Fasciclin-III) in wasbuffer met ofwel anti-Grh (1:300 affiniteit gezuiverd konijn anti-Grainyhead8) of anti-RFP (1:1,000 konijn anti-RFP). Primaire antilichaamoplossingen kunnen bij 4 °C worden opgeslagen en meerdere keren worden hergebruikt totdat het signaal aanzienlijk wordt verminderd. Doordring weefsel door pipetting off 1x PBS, het toevoegen van 1,5 mL wasbuffer, en incubatie voor ten minste 30 min op een orbitale shaker (80 rpm) bij RT. Verwijder ‘s nachts wasbuffer en vlekweefsel met 1,5 mL primaire antilichaamoplossing, uitbroeden op een orbitale shaker (80 rpm) bij 4 °C. Verzamel de primaire antilichaamoplossing en bewaar in een buis bij 4 °C voor toekomstige experimenten. Spoel het monster eerst snel af met 1x PBS en was vervolgens 3x met 1,5 mL wasbuffer. Voor elke wasbeurt, incubeer monsters op RT op een orbitale shaker gedurende ten minste 30 min. Bereid tijdens de laatste wasoplossing de secundaire antilichaamoplossing voor: 1:1.000 ezelanti-konijn Alexa 488 of 568 en 1:1.000 geitantimuis Alexa 488 of 568 (of fluorofoof naar keuze) in wasbuffer. Verwijder wasbuffers en vlekweefsels met 1,5 mL secundaire antilichaamoplossing. Bedek monsters met aluminiumfolie en incubaal op een orbitale shaker bij RT voor 3 uur. Als alternatief kunnen monsters ‘s nachts bij 4 °C worden geïncubeerd op een orbitale shaker. Was de monsters door eerst secundaire antilichaamoplossing weg te gooien en spoel het monster vervolgens snel af met 1x PBS, gevolgd door drie wasbeurten met 1,5 mL wasbuffer. Voor elke wasbeurt, incubeer monsters op RT op een orbitale shaker gedurende ten minste 30 min. Bereid de DAPI-oplossing voor door DAPI te verdunnen tot 10 μg/mL in wasbuffer. Na de laatste wasbeurt, vlek monsters met 1,5 mL DAPI oplossing uitbroeden op RT gedurende 30 min. Gooi DAPI-oplossing weg en spoel monsters 2x in 1,5 mL van 1x PBS. Bewaar gekleurd weefsel in 1,5 mL van 1x PBS in het donker, bedekt met aluminiumfolie, bij 4 °C tot klaar om te monteren op een glazen glijbaan met coverslip. De montagestap moet binnen 1 week worden uitgevoerd. 4. Celcyclusactiviteit (EdU-test) Maak een edu-voorraadoplossing van 10 mM uit click-iT-kit (zie tabel van materialen)door EdU-poeder op te lossen in dH20 en ~15 min te mengen tot het volledig is opgelost. De voorraadoplossing kan worden gespalteerd (250 μL per buis) en opgeslagen bij -80 °C. Voer vliegt EdU door eerst verdunnen EdU voorraad tot 5 mM in dH2O. Voeg droge gist totdat de oplossing is troebel en kort vortex te mengen. Snijd een 0,5 mL tube cap en plaats deze op de bodem van de vliegvoedsel flacon. Duw de dop in het voedsel, dus het is stabiel. Verdoven de vliegen en transfer 3-5 dagen oude vliegt in de flacon. Tik op de vliegen tot een rand, zodat niemand vast zitten in de dop. Pipette 75 μL gist-EdU oplossing in de dop. Vliegen moeten worden gevoed verse gist-EdU oplossing elke dag en overgebracht naar een vers voedsel flesje met een dop om de andere dag om ervoor te zorgen dat de vliegen niet vast komen te zitten in de bodem van de flacon. Om vliegen over te brengen, flip naar een nieuwe flacon met een pet, zet vliegen in slaap, tik vliegen aan de ene kant, en voeg verse gist-EdU oplossing. Op de derde dag verwonden de vliegen en blijven gist-EdU voeden tot dissectie op 2 dpi (Figuur 4A). Zie protocolsectie 2 voor dissectie- en fixatiemethoden. Edu-kleuringsrensiaaten voorbereiden: wasbuffer (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA in 1x PBS), permeabilisatiebuffer (0,5% Triton X 100 in 1x PBS), blokkerende buffer (3% BSA in 1x PBS) en reagentia voor te bereiden uit de EdU-testkit (zie Tabel van Materialen),inclusief 1x reactiebuffer en 1x reactiebufferadditief zoals aangegeven door de fabrikant. Was monsters voor 1 uur, mengen op RT in 1,5 mL wasbuffer. Voeg 1,5 mL permeabilisatiebuffer en incubeermonsters toe gedurende 20 minuten.LET OP: Ontdooi en bereid reactiecocktailoplossing met een volume van 500 μL/plaat. Was monsters 1x snel met 1x PBS en dan 3x snel met 1 mL blokkeerbuffer. Pipette uit alle resterende blokkeerbuffer en voeg 500 μL reactiecocktailoplossing per plaat toe. Draai platen om ervoor te zorgen weefsels zijn volledig bedekt. Incubeer in een lade in het donker voor 1 uur op RT. Was monsters 1x snel met 1,5 mL blokkeerbuffer. Vlek met 1,5 mL DAPI-oplossing op 1:5.000 in wasbuffer gedurende 30 minuten. Was 2x met 1x PBS snel, wikkel in folie en bewaar in het donker op 4 °C tot het binnen 3 dagen klaar is om monsters te monteren. 5. Mount gekleurd weefsel Verkrijg alle benodigde materialen voor montage: glazen platen, glazen coverslips, heldere nagellak, montagemedia, een paar tangen en doekjes. Om gekleurd vliegweefsel te monteren, de buiken losmaken van de ontleedplaat met behulp van tangen onder de stereomicroscoop. Breng weefsel over naar ~30 μL montagemedia op een glazen coverslip door het weefsel voorzichtig met tangen door de rugflanken te grijpen, waarbij u ervoor zorgt dat het ventrale gebied niet met tangen wordt aangeraakt. Onder de stereomicroscoop oriënteert het buikweefsel, zodat de binnenkant naar beneden naar beneden wordt gericht naar de coverslip (dat wil zeggen, de externe cuticula / haren zijn naar boven gericht). Trek de georiënteerde buiken naar de rand van de media druppel met behulp van de tangen. Oppervlaktespanning zal helpen om het weefsel plat te houden(figuur 1F).OPMERKING: Het is nuttig voor beeldvorming om de buiken in een kolom of rij in dit stadium te organiseren. Label een glazen schuif (d.w.z. besturing of experimenteel) en pak de coverslip op door de schuif langzaam dichter bij de coverslip te brengen. Flip schuif over en voorzichtig dep met een doekje om overtollige montagemedia te verwijderen. Verzegel de randen van de coverslip met duidelijke nagellak en herhaal voor alle resterende experimentele groepen. Bewaar dia’s in een diavak bij 4 °C tot ze klaar zijn om te worden weergegeven. 6. Beeldvorming en verwerking Beeld de vlieg buikwond gebied door eerst het melanine litteken te lokaliseren met een confocale microscoop (Figuur 1B), ofwel een puntscanner of een gestructureerde verlichting (ApoTome) met een 40x olie of droge doelstelling. Controleer de belichting op elk kanaal en zorg ervoor dat het signaal onder de verzadiging zit. De beeldvormingsinstellingen moeten gebaseerd zijn op de helderste voorbeeldgroep. Dit is vooral belangrijk voor ploidy analyse als de DAPI kanaal moet blijven in het lineaire bereik om nauwkeurig te meten DNA-inhoud. Neem een volledige z-stack afbeelding in alle drie de kanalen met een optimale afstand van ten minste 0,50 μm tussen de segmenten. Sla vastgelegde afbeeldingen op en open het bestand in het beeldanalyseprogramma Fiji (ook bekend als ImageJ). Maak voor elke afbeelding een z-stackprojectie met de som van segmenten voor alle kanalen. Draai de beelden zo nodig om ervoor te zorgen dat de kernen horizontaal over afbeeldingen worden opgesteld(figuur 3A en figuur 4E). Snijd alle afbeeldingen bij tot een rechthoekige selectie van 300 μm x 300 μm gecentreerd rond de wondplaats of het centrum van niet-gewonde controle. Het gebied identificeren door een rechthoek te tekenen en Bewerken te selecteren | Selectie | Opgeven. Controleer of geschaalde eenheden zich in micron bevinden om ervoor te zorgen dat het vak van dezelfde grootte wordt gebruikt om alle afbeeldingen te analyseren. 7. Endoreplication (ploidy) analyse Selecteer met Fiji het Grh-kanaalvenster en dupliceer de afbeelding. Gebruik vervolgens het gereedschap Drempelwaarde om een masker te maken. Pas de drempel handmatig aan door de bovenste balk te schuiven om de achtergrond te minimaliseren zonder dat de kernen drastisch krimpen(figuur 4D). Als er kernen in het Grh-kanaal worden aangeraakt in de drempelafbeelding, gebruikt u het penseelgereedschap (2 pixelbreedte) in dezelfde kleur als de achtergrond om een lijn tussen de kernen te tekenen. Klik om 1x toe te passen wanneer u klaar bent om het uiteindelijke masker te genereren. Genereer een regio van belang (ROI) kaart met behulp van de functie Deeltjes analyseren: stel grootte in op 5 μm-60 μm om de meeste kernen vast te leggen zonder de achtergrond op te geven. Pas de ROI-kaart handmatig aan als dat nodig is in de ROI-manager. Verwijder selecties die geen kernen zijn en voeg kernen toe aan de lijst die niet zijn geïdentificeerd door de kern te schetsen met het keuzegereedschap uit de vrije hand en toe te voegen aan de ROI-manager (figuur 4D). Selecteer het DAPI-kanaal en klik vervolgens op Alles weergeven in de ROI-manager om de gegenereerde ROI-kaart in het Grh-kanaal toe te passen op het DAPI-kanaal. Verwijder selecties waarbij de epitheelkernen elkaar overlappen met niet-hellend getinte kernen (bijvoorbeeld kernen van spieren of vet) van de ROI-kaart. Grainyhead bevlekt alleen epitheelkeren, terwijl DAPI alle kernen bevlekt. Controleer of elke geschetste selectie slechts één kern bevat en verwijder of bewerk selecties met meer dan één kern. De lijst met bewerkte ROI’s opslaan. Meet het gebied en de geïntegreerde dichtheid van elke epitheelkernen in de ROI-kaart met behulp van de analysetools in Fiji. Exporteer de waarden naar een spreadsheetprogramma. Meet de gemiddelde afbeeldingsachtergrond met behulp van het gereedschap Cirkelselectie. Teken drie cirkels die niet overlappen met kernen in verschillende gebieden van de DAPI-afbeelding. Voeg het gebied en de geïntegreerde dichtheid van elk van de cirkels toe aan een spreadsheetprogramma om de helderheid van de achtergrondafbeelding vast te stellen. Begin met het berekenen van de gemiddelde achtergrond per eenheidsgebied voor elke afbeelding door elke achtergrond geïntegreerde dichtheidswaarde te delen door het bijbehorende gebied. Dan gemiddeld de drie geïntegreerde dichtheid per gebied metingen voor het beeld om de gemiddelde achtergrond per eenheid gebied te verkrijgen. Bereken vervolgens de totale achtergrond van elke DAPI-kern door het gebied van de kern te vermenigvuldigen met de gemiddelde achtergrond per eenheidsgebied. De genormaliseerde DAPI-intensiteit voor elke gemeten kern kan vervolgens worden berekend door de totale achtergrond van elke kern af te trekken van de gemeten geïntegreerde dichtheid. Gemiddeld alle genormaliseerde DAPI intensiteit waarden van de ongewonde epitheel controle. De ongewonde epitheelkernen werden eerder berekend om een ploidy waarde van 2C hebben en kan dienen als referentie voor de berekening van ploidy in de epitheel kernen van de experimentele omstandigheden8. Bereken de ploidy van elke kern door de genormaliseerde DAPI-intensiteit van elke kern te delen door de genormaliseerde waarde van referentieonverwonding epitheelcontrole (2C), vermenigvuldig de waarde met 2 tot gelijk aan de genormaliseerde truc (C-waarde):(Nuclear Integrated Density – Background Nuclear Integrated Density)/Average Nuclear Integrated Density (uninjured epitheelnclei = 2C) x 2 = epitheliale nucleaire ploidy (C) Grafiekkernen met ploidywaarden als stipplot, histogram of gegroepeerd in een staafgrafiek (d.w.z. 2C [0.6-2.9C], 4C [3.0-5.9C], 8C [6.0-12.9C], 16C [13.0-24.9C], en >32C [>25.0C] (3F).