創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル

1. 成体のフルーツハエのステージングと負傷 選択した D.メラノガスター 株(すなわち、epi-Gal4/ UAS株、 材料表を参照)。注:ここでは、Gal4/UASシステムは、UASの下流にコードされた遺伝子またはRNAiの上皮特異的遺伝子発現(epi-Gal4)を可能にするために使用されます。本研究では、蛍光膜タンパク質(UAS-Cd8.mRFP)、有糸誘導体(UAS-fzr RNAi、UAS-stg)、およびWIP阻害剤(UAS-E2F1RNAi;RNAiUAS-RacDN)。 生後3~5日まで25°Cの生鮮食品バイアルで、新たに封入された10〜15のメスフルーツハエをそれぞれ2回収集します。1つのバイアルは、以下に説明したように、損傷していないコントロールとして機能し、他のバイアルは負傷します。メスのハエは、雄(〜5/バイアル)で維持する必要があります。 ハエを巻くために、1つの0.10 mmのステンレス鋼のピンとそれぞれ複数のピンホルダーを組み立てる。ピンの鋭い端が向いていることを確認します。ピンは、フライを穿刺した後に簡単に曲げたり、チップを切ったりすることができ、フックまたは損傷したピンは廃棄する必要があります。 老齢の雌のフルーツフライを実体顕微鏡下のCO2フライパッドで麻酔し、ペイントブラシを使用して列に並べます。安全メガネを着用し、片手にピンホルダーを持ち、もう一方の手に鉗子を持ち、腹側腹部を上に向けてハエを配置するために鉗子を使用します。 成人雌は、腹側中形の胸状突起の両側にあるテルジットA4の上皮性胸部領域内で飛ぶ(図1A)。この腹側領域を穿刺すると、組織の縁が機械的処理によって引き裂かれる解剖部位から最適な空間が得られます。 負傷したハエを食物バイアルに戻し、怪我後の希望の日(dpi)に年齢を重くします。上皮創傷治癒は1dpiから始まり、3dpiで終わる。Endoreplication は 2 dpi でピークを迎え、EdU アッセイに最適です (セクション 4,図 2)。 2. フライ腹部解剖 注:このステップの間、それは上皮の完全性を損なうので、解剖ツールで腹側腹部組織に触れないようにすることが重要です。 解剖に必要なすべての材料を入手する:グレースの溶液、鉗子、ヴァンナのスプリングシザー、0.10 mmピン、解剖プレート、9ウェルガラス解剖皿、固定液(1x PBSで4%パラホルムアルデヒド)、1x PBS、ワイプ、ピペット、チップ30μmのチップ( 材料表を参照)。 負傷したハエを実体顕微鏡下でCO2-フライパッドで麻酔し、傷の瘢痕の有無を確認してハエが正常に負傷したことを確認します(すなわち、腹部のメラニンスポットは図1BBを参照)。正常に負傷しなかった実験グループからのハエを捨てます。 解剖を開始するには、グレースの溶液で9ウェルガラス解剖皿の1つの井戸を埋めます。鉗子のペアを使用して、胸郭の後側で負傷した女性のハエをつかみ、グレースの溶液を含む井戸にハエを沈めます。 胸郭を解放せずに反対側の手に鉗子を使用し、テルギートA6の下の後部キューティクルを穿刺し、フルーツフライの後端からキューティクルを引き離します。内臓(卵巣と腸)は通常このステップで出てきます。そうでなければ、残りの器官を絞り出し、空の井戸に捨てる鉗子で腹部の後側を静かに押します。 鉗子を使用してテルギテA2の上の胸郭接合部で完全な腹部を取り除き、グレースの溶液の〜100 μLを含む空の井戸に腹部を移します。 すべてのフライ腹部が解剖されるまで、手順2.3~2.5を繰り返します。 Graceの溶液の体積を、プールされた解剖された腹部を含む井戸の30 μLに減らします。 片方の手に鉗子を持つ後部側の腹部を配置し、他方の手で腹腔にヴァンナのスプリングハサミの底刃を挿入することによって腹部を開くフィレ。腹部が完全に開くまで、後回りの正中線に沿ってカットし、最大3つの切り傷を必要とすることができます(図1C、1D)。 腹部取り付け面積あたり4つの0.10 mmピンで乾燥解剖プレートを設置します。各35 mmの解剖の版は7つの土台区域に合うことができる。各取り付け領域にグレースの溶液のピペット30 μLと各液滴に1フィレ腹部を転送します。 フィレした腹部を4つの裏隅の皿に固定します(図1E)。腹部組織を引き裂いたり伸ばしたりすることなく、組織が平らであることを確認してください。 組織を固定するには、Graceの溶液からピペットを取り除き、固定された腹部に30 μLの修正溶液を加えます。注意:パラホルムアルデヒドは有毒であるため、修正液を取り扱う際に手袋を着用してください。 すべてのフィレット腹部が解剖プレートに固定されるまで、手順2.10~2.11を繰り返します。 各皿の底にテープラベルを貼り、各コントロールと実験グループをマークします。室温(RT)で30〜60分のサンプルを修正します。 1.5 mLの1x PBSを各プレートにピペット処理して、溶液を洗い流します。制度上のガイドラインに従って、適切な液体または乾燥した化学廃棄物容器に固定溶液およびプラスチックを処分する。 1x PBSの1.5 mLでプレート2倍を洗浄し、1.5mLの1x PBSで覆われた固定組織を蓋付きのプラスチック容器に保管します。湿ったペーパータオルの層を容器の底に加え、解剖後1週間以内に免疫染色剤を準備できるまでサンプルを4°Cで保存します。 3. 免疫蛍光 試薬を新たに調製(材料表を参照):洗浄緩衝液(0.3%トリトンX 100、1x PBSで0.3%BSA)。残った洗浄バッファーは4°Cで保存することができ、2日間の染色プロトコルの持続時間に使用されます。抗Grh(1:300アFigure 2フィニティ精製ウサギ抗グレイディヘッド8)または抗RFP(1:1,000ウサギ抗RFP)のいずれかを使用して洗浄バッファーにアンチFasIII(1:50マウス抗ファシクリンIII)を使用してアッセイごとに十分な一次抗体溶液を調製します。一次抗体溶液は4°Cで保存し、シグナルが大幅に低減されるまで複数回再利用できます。 1x PBSをピペットオフし、1.5mLの洗浄バッファーを追加し、RTで軌道シェーカー(80 rpm)で少なくとも30分間インキュベートすることによって組織を透過させる。 洗浄バッファーと染色組織を一次抗体溶液 1.5 mL で一晩除去し、4 °Cで軌道シェーカー(80 rpm)でインキュベートします。 一次抗体溶液を収集し、将来の実験のために4°Cでチューブに保存します。 まず、1x PBSでサンプルを素早く洗い流し、次に1.5mLの洗浄バッファーで3倍洗います。各洗浄ごとに、RTでサンプルを軌道シェーカーで少なくとも30分間インキュベートします。 最終洗浄中に、2次抗体溶液を調製します:1:1,000ロバ抗ウサギAlexa 488または568と1:1,000ヤギ抗マウスアレクサ488または568(または選択したフルオロフォア)を洗浄バッファーに入れます。 洗浄バッファーを除去し、2 次抗体溶液の 1.5 mL で組織を汚します。サンプルをアルミホイルで覆い、RTで軌道シェーカーで3時間インキュベートします。あるいは、サンプルは軌道シェーカー上の4°Cで一晩インキュベートすることができる。 最初に二次抗体溶液を廃棄し、次に1x PBSでサンプルを素早く洗い流し、次に1.5mLの洗浄バッファーで3回洗浄します。各洗浄ごとに、RTでサンプルを軌道シェーカーで少なくとも30分間インキュベートします。 洗浄バッファーでDAPIを10 μg/mLに希釈してDAPI溶液を調製します。最終洗浄後、RTで30分間インキュベートする1.5 mL DAPI溶液を用いてサンプルを染色する。 DAPI溶液を廃棄し、1x PBSの1.5 mLで2倍の試料をすすい出します。汚れた組織を1x PBSの1.5mLに暗い状態で保存し、アルミニウム箔で覆い、カバースリップ付きのガラススライドに取り付ける準備ができるまで4°Cで保管します。取り付けステップは1週間以内に行う必要があります。 4. 細胞周期活性(EdUアッセイ) DH20でEdU粉末を溶解し、完全に溶解するまで〜15分間混合することにより、Click-iTキット(材料表を参照)から10 mM EdUストック溶液を作ります。ストック溶液は、(チューブあたり250μL)を引用し、-80°Cで保存することができます。 フィードは、最初にDH2O.で5 mMにEdUストックを希釈することによってEdUを飛ばします。0.5 mLチューブキャップを切り落とし、フライフードバイアルの底に置きます。キャップを食べ物に押し込み、安定しています。 ハエを麻酔し、バイアルに3〜5日のハエを転送します。ハエを1つの端までタップして、キャップに刺さるものはありません。 ピペット75 μLのイースト-EdU溶液をキャップに入れた。ハエは毎日新鮮な酵母-EdU溶液を供給し、ハエがバイアルの底に詰まりないように、一日おきにキャップ付きの新鮮な食品バイアルに移す必要があります。 ハエを転送するには、キャップで新しいバイアルにフリップし、ハエを眠らせ、片方の側にハエをタップし、新鮮な酵母EdU溶液を追加します。 3日目にハエを傷つけ、2dpiで解剖するまで酵母EdUに餌を与え続けます(図4A)。解剖および固定方法については、プロトコルセクション2を参照してください。 EdU染色試薬を調製:洗浄バッファー(0.3%トリトンX 100、1x PBSで0.3%BSA)、パーメビル化緩衝液(1x PBSで0.5%トリトンX 100)、ブロッキングバッファー(1x PBSで3%BSA)、およびEdUアッセイキット( 材料表を参照)から試薬を調製し、1x反応バッファーおよび1x反応剤を含む1x反応バッファーおよび1x反応剤を含む。 1時間洗浄サンプルを、1.5 mLの洗浄バッファーでRTで混合します。 1.5 mLのパーメビリゼーションバッファーを加え、サンプルを20分間インキュベートします。注:解凍し、500 μL/プレートのボリュームを使用して反応カクテル溶液を調製します。 サンプルを1x PBSで素早く洗浄し、1mLのブロッキングバッファーで3倍速く洗浄します。 残りのブロッキングバッファーをすべてピペットオフし、1皿あたり500 μLの反応カクテル溶液を加えます。組織が完全に覆われていることを確認するために、旋回プレート。RTで1時間暗闇の中で引き出しにインキュベート。 ブロッキングバッファーの1.5 mLでサンプルを1倍速く洗浄します。 1.5 mLのDAPI溶液を洗浄バッファーで30分間洗浄します。 1x PBSで2倍を素早く洗い、ホイルで包み、3日以内にサンプルを取り付ける準備ができるまで4°Cで暗闇の中で保管してください。 5. 染色されたティッシュを取り付ける ガラススライド、ガラスカバーリップ、クリアマニキュア、取り付けメディア、鉗子、ワイプなど、取り付けに必要なすべての材料を入手できます。 染色されたフライ組織を装着するには、解剖板から腹部を立体顕微鏡下で鉗子を使用して固定解除する。組織を、後側の側触れで鉗子で組織をそっとつかむことで、ガラスのカバースリップに取り付ける媒体の30μLに組織を移し、鉗子で腹側領域に触れないように注意する。 実体顕微鏡では、内側がカバースリップに向かって下向きになるように腹部組織を向けます(すなわち、外的なキューティクル/毛が上を向いています)。鉗子を使用して、配向した腹部をメディア液滴の端に引っ張ります。表面張力はティッシュを平らに保つのに役立つ(図1F)。注: この段階で、列または行に腹部を整理することは、イメージングに役立ちます。 ガラススライド(制御または実験的)にラベルを付け、ゆっくりとスライドをカバースリップに近づけてカバースリップを拾います。スライドを反転し、余分な取り付けメディアを取り除くためにワイプで静かにブロット。 カバースリップの端をクリアマニキュアで密封し、残りのすべての実験グループについて繰り返します。スライドボックスにスライドを4°Cで保存し、イメージを作成する準備が整います。 6. イメージングと処理 最初に共焦点顕微鏡(図1B)でメラニン瘢痕を見つけることによってフライ腹部の傷領域を画像化し、点スキャナーまたは40x油または乾燥目的で構造化された照明(ApoTome)を配置します。 各チャンネルの露出を確認し、信号が飽和以下であることを確認します。イメージング設定は、最も明るいサンプルグループに基づいている必要があります。DAPIチャネルはDNA含有量を正確に測定するために線形範囲にとどまる必要があるため、これは特に策略分析にとって重要です。 スライス間の最適距離が0.50μm以上の3つのチャンネルすべてで、完全なZスタック画像を撮ります。キャプチャした画像を保存し、画像解析プログラムフィジー (別名 ImageJ) でファイルを開きます。 各画像に対して、すべてのチャンネルのスライスの合計オプションを使用して、z スタックプロジェクションを作成します。 必要に応じて画像を回転させて、画像全体に水平に並べられるようにします(図3Aと図4E)。 傷跡地または傷つけていないコントロールの中心を中心とした300 μm x 300 μmの長方形の選択にすべての画像をトリミングします。四角形を描画し、[編集] を選択して領域を識別 する |選択 |を指定します。すべての画像を解析するために同じサイズのボックスが使用されていることを確認するために、スケール単位がミクロンであることを確認します。 7. 内複製(策略)分析 フィジーを使用して、Grh チャンネル ウィンドウを選択し、イメージを複製します。次に、しきい値ツールを使用してマスクを作成します。上部のバーをスライドさせて、核が大幅に縮小することなく背景を最小限に抑えて、手動でしきい値を調整します(図4D)。 Grhチャネル内のいずれかの核が閾値画像に接触している場合は、 ペイントブラシツール (2ピクセル幅)を背景と同じ色で使用し、核間に線を引きます。終了したらクリックして 1x を適用し、最終的なマスクを生成します。 「パーティクルを分析」機能を使用して対象領域(ROI)マップを生成します: 背景を含めずにほとんどの核をキャプチャするために、サイズを 5 μm-60 μm に設定します。 ROI マネージャで必要に応じて 、ROIマップを手動で調整します。核でない選択を削除し、フリーハンド選択ツールで核のアウトラインを表示し 、ROI マネージャ に追加することによって、識別されなかった核をリストに追加します (図 4D)。 DAPI チャネルを選択し、ROI マネージャで[すべて表示] をクリックして、Grh チャネルで生成された ROI マップを DAPI チャネルに適用します。 上皮核の輪郭が、筋や脂肪の核など、無形成核と重なっている場合は、ROIマップから選択を削除します。グレインヘッドは上皮核のみを染色し、DAPIはすべての核を染色する。アウトラインが表示されている各選択に 1 つの核のみが含まれていることを確認し、複数の核を持つ選択を削除または編集します。編集した ROI リストを保存します。 フィジーの解析ツールを使用して ROI マップ内の各上皮核の面積と統合密度を測定します。値をスプレッドシート プログラムにエクスポートします。 円形選択ツールを使用して、平均画像の背景を測定します。DAPI イメージの異なる領域の任意の核と重ならない 3 つの円を描画します。背景画像の明るさを確立するために、スプレッドシートプログラムに各円の面積と統合密度を追加します。 各背景の統合密度値を対応する領域で割って、各画像の単位面積あたりの平均背景を計算します。次に、単位面積あたりの平均背景を得るために、画像の面積測定ごとに3つの積分密度を平均します。 次に、各DAPI核の総背景を計算し、その核の面積に単位面積当たりの平均背景を掛けます。測定された各核の正規化されたDAPI強度は、その測定された積分密度から各核の総背景を差し引くことによって計算することができる。 全ての正規化されたDAPI強度値を、傷つけていない上皮制御から平均化する。この傷つけていない上皮核は、予め2Cの突起値を有するように計算され、実験条件8から上皮核における精滑を計算するための基準として役立つ。 各核の正規化された DAPI 強度を、参照の傷つけていない上皮制御 (2C) から正規化された値で割って各核のプロイドを計算し、その値に 2 を掛けて正規化されたプロイド(C値)に等しい値を計算します。(核統合密度- 背景核統合密度)/平均核統合密度(傷つけていない上皮核=2C)x 2 =上皮核策略(C) ドットプロットとしてプロイド値を持つグラフ核、 ヒストグラム、またはそれに応じて棒グラフにグループ化(すなわち、2C[0.6-2.9C]、4C[3.0-5.9C]、8C[6.0-12.9C]、16C[13.0-24.9C]、および>32C[>25.0C]図(F3)