Небольшая установка для тестирования токсичности водорослей наноматериалов и других сложных веществ
Summary
Мы демонстрируем тестирование токсичности водорослей на сложные вещества (например, цветные вещества или наноматериалы) с помощью установки, освещенной вертикально со светодиодом.
Abstract
Данные об экотоксичности являются обязательным требованием для предварительной и постпроданной регистрации химических веществ европейскими и международными правилами (например, REACH). Тест на токсичность водорослей часто используется при оценке регулятивного риска химических веществ. Для достижения высокой надежности и воспроизводимости жизненно важно разработать стандартизированные руководящие принципы. Для тестирования токсичности водорослей руководящие принципы требуют стабильных и равномерных условий таких параметров, как рН, температура, уровень двуокиси углерода и интенсивность света. Наноматериалы и другие так называемые сложные вещества могут мешать свету, вызывая большие различия в полученных результатах, препятствующих их регулятивной принятию. Для решения этих проблем мы разработали LEVITATT (LED Vertical Illumination Table для испытаний токсичности водорослей). Установка использует светодиодное освещение снизу, что позволяет однородное распределение света и контроль температуры, а также минимизации внутри образец затенения. Установка оптимизирует объем выборки для количественной оценки биомассы и в то же время обеспечивает достаточный приток CO2 для поддержки экспоненциального роста водорослей. Кроме того, материалы тестовых контейнеров могут быть адаптированы для минимизации adsorption и volatilization. При тестировании цветных веществ или суспензий частиц использование светодиодных фонарей также позволяет увеличить интенсивность света без дополнительной тепловой генерации. Компактный дизайн и минимальные требования к оборудованию увеличивают возможности для внедрения LEVITATT в широком диапазоне лабораторий. В соответствии со стандартизированными руководящими принципами ИСО и ОЭСР по тестированию токсичности водорослей, LEVITATT также показал более низкую межпробную изменчивость для двух эталонных веществ (3,5-dicholorophenol и K2Cr2O7)и трех наноматериалов (NonO, CeO2, и BaSO4) по сравнению с Флябами и микротлорными пластинами Erlenmeyer.
Introduction
Тест на токсичность водорослей является одним из трех обязательных тестов, используемых для получения данных об экотоксичности, необходимых для предварительной и постпродающей регистрации химических веществ европейскими и международными правилами(например, REACH 1 и TSCA (США)). С этой целью международные организации (например, ИСО и ОЭСР) разработали стандартизированные руководящие принципы тестирования на водоросли. Эти стандарты и руководящие принципы тестирования предписывают идеальные условия тестирования с точки зрения рН, температуры, уровня углекислого газа и интенсивности света. Тем не менее, поддержание стабильных условий испытаний во время испытаний водорослей на практике трудно и результаты страдают от проблем с воспроизводимостью и надежностью для целого ряда химических веществ и наноматериалов (часто называют “трудные вещества”)2. Большинство существующих установок по тестированию токсичности водорослей работают с относительно большими объемами (100-250 мл), расположенными на орбитальном шейкере внутри инкубатора. Такая установка ограничивает количество тестовых концентраций и воспроизводит достижимые и большие объемы водорослей культуры и испытательного материала. Кроме того, эти установки редко имеют равномерное световое поле и надежные условия освещения, кроме того, трудно получить в больших колбы, отчасти как интенсивность света уменьшается экспоненциально дальше свет путешествует и отчасти из-за геометрии колбы. Альтернативные установки включают пластиковые микротитр3 пластины, содержащие небольшие объемы выборки, которые не позволяют адекватные объемы выборки для измерения рН, дополнительные измерения биомассы, извлечения пигмента или других анализов, требующих разрушительной выборки. Одной из конкретных проблем, использующих существующие установки для тестирования токсичности водорослей наноматериалов и веществ, образующих цветные суспензии является вмешательство или блокирование света, доступного для водорослей клеток, часто называют “затенение”4,5. Затенение может происходить во флаконах испытательным материалом и/или взаимодействиями между испытательным материалом и клетками водорослей, или затенение может происходить между флаконами, из-за их позиционирования относительно друг друга и источника света.
Метод основан на мелкомасштабной установке теста токсичности водорослей, введенной Arensberg et al.6, которая позволяет проводить тестирование в соответствии с такими стандартами, как OECD 2017и ISO 86928. Метод дополнительно оптимизирован для устранения ограничений, о которых говорилось выше: 1) с использованием технологии светодиодного освещения для обеспечения равномерных условий освещения с минимальной теплосысловой, 2) обеспечивая достаточный объем выборки для химического/биологического анализа при сохранении постоянногорН, уровня CO 2 и 3), позволяющего использовать универсальный испытательный контейнерный материал для тестирования летучих веществ или веществ с высоким потенциалом сорбиона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фитопланктон преобразует солнечную энергию и углекислый газ в органическое вещество и, таким образом, играет ключевую роль в водной экосистеме. По этой причине тесты на ингибирование водорослей включаются в качестве одного из трех обязательных испытаний на водную токсичность, необхо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано PATROLS – Расширенные инструменты для тестирования NanoSafety, Грант соглашение 760813 в рамках Horizon 2020 научно-исследовательской и инновационной программы.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
