إعداد صغير لاختبار سمية الطحالب للمواد النانوية والمواد الصعبة الأخرى
Summary
نُظهر اختبار سمية الطحالب للمواد الصعبة (مثل المواد الملونة أو المواد النانوية) باستخدام إعداد مضاء عموديًا بمُدرّي.
Abstract
13 – بيانات السمية الإيكولوجية هي شرط لتسجيل المواد الكيميائية قبل السوق وما بعدها بواسطة اللوائح الأوروبية والدولية (مثل نظام REACH). وكثيراً ما يستخدم اختبار سمية الطحالب في التقييم التنظيمي للمخاطر الكيميائية. ومن أجل تحقيق موثوقية عالية وقابلية استنساخ عالية، يعد وضع مبادئ توجيهية موحدة أمرا حيويا. وبالنسبة لاختبار السمية الطحالب، تتطلب المبادئ التوجيهية ظروفاً مستقرة وموحدة من المعلمات مثل درجة الحرارة ودرجة الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون وكثافة الضوء. ويمكن أن تتداخل المواد النانوية وغيرها من المواد التي تسمى بمواد صعبة مع الضوء مما يسبب تباينا كبيرا في النتائج التي تم الحصول عليها مما يعوق قبولها التنظيمي. ولمعالجة هذه التحديات، قمنا بتطوير LEVITATT (جدول الإضاءة العمودي LED لاختبارات سمية الطحالب). يستخدم الإعداد إضاءة LED من الأسفل مما يسمح بتوزيع الضوء المتجانس والتحكم في درجة الحرارة مع تقليل تظليل العينة الداخلية. الإعداد يحسن حجم العينة للكتلة الحيوية الكم ولا في الوقت نفسه ضمان تدفق كافية من CO2 لدعم النمو الأسي للطحالب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تصميم مواد حاويات الاختبار لتقليل الامتزاز والتطاير. عند اختبار المواد الملونة أو تعليق الجسيمات، واستخدام أضواء LED يسمح أيضا لزيادة شدة الضوء دون توليد الحرارة إضافية. يزيد التصميم المدمج والمتطلبات الدنيا من المعدات من إمكانيات تنفيذ نظام LEVITATT في مجموعة واسعة من المختبرات. في حين أن الامتثال للمبادئ التوجيهية ISO ومنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي لاختبار السمية الطحالب، أظهرت LEVITATT أيضا انخفاض في التغير بين العينات لمادتين مرجعيتين (3،5-ديكولوروبفينول وK2Cr2O7)وثلاثة المواد النانوية (ZnO، CeO2،وBaSO4)مقارنة مع قارورة إرلنماير وألواح microtiter.
Introduction
اختبار السمية الطحالب هو واحد من ثلاثة اختبارات إلزامية فقط تستخدم لتوليد بيانات السمية الإيكولوجية المطلوبة لتسجيل المواد الكيميائية قبل وبعد السوق بواسطة اللوائح الأوروبية والدولية (مثل REACH1 و TSCA (الولايات المتحدة الأمريكية)). ولهذا الغرض، وضعت المنظمات الدولية مبادئ توجيهية موحدة لاختبار الطحالب (مثل المنظمة الدولية للتوحيد القياسي ومنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي). هذه المعايير والمبادئ التوجيهية اختبار يصف ظروف الاختبار المثالي من حيث درجة الحرارة ودرجة الحرارة، ومستويات ثاني أكسيد الكربون وكثافة الضوء. غير أن الحفاظ على ظروف اختبار مستقرة أثناء اختبار الطحالب أمر صعب في الممارسة العملية، وتعاني النتائج من مشاكل في قابلية التكاثر والموثوقية لمجموعة من المواد الكيميائية والمواد النانوية (التي يشار إليها في كثير من الأحيان باسم “المواد الصعبة”)2. معظم الاجهزة القائمة اختبار السمية الطحالب تعمل مع كميات كبيرة نسبيا (100-250 مل) تقع على شاكر المدارية داخل حاضنة. ويحد هذا الإعداد من عدد تركيزات الاختبار ويستنسخ كميات كبيرة وقابلة للتحقيق من ثقافة الطحالب ومواد الاختبار. بالإضافة إلى ذلك، نادراً ما يكون لهذه الاجهزة حقل ضوء موحد وظروف الإضاءة الموثوقة هي كذلك من الصعب الحصول عليها في قارورات كبيرة، جزئياً حيث تقلل كثافة الضوء بشكل كبير من زيادة الرحلات الخفيفة وجزئياً بسبب هندسة القارورة. وتشمل الاجهزة البديلةألواح 3 من البلاستيك التي تحتوي على أحجام عينات صغيرة لا تسمح بأحجام كافية لأخذ العينات لقياس رقمH أو قياسات إضافية للكتلة الحيوية أو استخراج الصباغ أو غيرها من التحليلات التي تتطلب أخذ عينات مدمرة. أحد التحديات الخاصة باستخدام الاجهزة الموجودة لاختبار سمية الطحالب من المواد النانوية والمواد التي تشكل التعليقات الملونة هو التدخل أو حجب الضوء المتوفر للخلايا الطحالب ، وغالبا ما يشار إليها باسم “التظليل”4،5. قد يحدث التظليل داخل قوارير بواسطة مادة الاختبار و/أو التفاعلات بين مادة الاختبار وخلايا الطحالب، أو يمكن أن يحدث التظليل بين القنينات، بسبب تحديد موضعها بالنسبة لبعضها البعض ومصدر الضوء.
وتستند هذه الطريقة على إعداد اختبار السمية الطحالب على نطاق صغير الذي قدمه أرينسبرغ وآخرون6 الذي يسمح بإجراء الاختبار وفقا لمعايير مثل OECD 2017، وISO 86928. والطريقة هي أكثر الأمثل لمعالجة القيود المذكورة أعلاه من خلال: 1) استخدام تكنولوجيا ضوء LED لضمان ظروف ضوئية موحدة مع توليد الحرارة الحد الأدنى، 2) توفير حجم عينة كافية للتحليل الكيميائي / البيولوجي مع الحفاظ على درجة حرارة ثابتة، ومستويات CO2، و 3) تمكين استخدام مواد حاوية اختبار متعددة الاستخدامات لاختبار المواد المتطايرة أو المواد ذات الإمكانية العالية للفحص.
Protocol
Representative Results
Discussion
العوالق النباتية تحول الطاقة الشمسية وثاني أكسيد الكربون إلى مادة عضوية، وبالتالي لها دور محوري في النظام الإيكولوجي المائي. ولهذا السبب، تدرج اختبارات تثبيط نمو الطحالب كأحد ثلاثة اختبارات إلزامية للسمية المائية اللازمة لتقييم المخاطر التنظيمية للمواد الكيميائية. والقدرة على إجراء ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل PATROLS – الأدوات المتقدمة لاختبار NanoSafety ، اتفاقية المنحة 760813 في إطار برنامج البحث والابتكار في أفق 2020.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
