Summary

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

Published: May 31, 2020
doi:

Summary

Le protocole présenté peut déterminer la compétence vectorielle des populations de moustiques Aedes aegypti pour un virus donné, tel que Zika, dans un contexte de confinement.

Abstract

Les procédures présentées décrivent une méthodologie généralisée pour infecter les moustiques Aedes aegypti avec le virus Zika dans des conditions de laboratoire afin de déterminer le taux d’infection, d’infection disséminée et de transmission potentielle du virus dans la population de moustiques en question. Ces procédures sont largement utilisées avec diverses modifications dans les évaluations des compétences vectorielles à l’échelle mondiale. Ils sont importants pour déterminer le rôle potentiel qu’un moustique donné (c.-à-d. espèce, population, individu) peut jouer dans la transmission d’un agent donné.

Introduction

La compétence vectorielle est définie comme la capacité au niveau de l’espèce, de la population, et même d’un individu, d’un arthropode donné tel qu’un moustique, une tique ou une phlébotomine, d’acquérir et de transmettre biologiquement un agent avec réplication ou développement chez l’arthropode1,2. En ce qui concerne les moustiques et les virus transmis par les arthropodes (c.-à-d. les arbovirus), l’agent est absorbé d’un hôte virémique par un moustique femelle. Après l’ingestion, le virus doit infecter de manière productive l’une des petites populations de cellules épithéliales de l’intestin moyen3,en surmontant divers obstacles physiologiques tels que la dégradation protéolytique par les enzymes digestives, la présence du microbiote (barrière d’infection de l’intestin moyen, ou MIB) et la matrice péritrophique sécrétée. L’infection de l’épithélium de l’intestin moyen doit être suivie d’une réplication du virus et d’une éventuelle fuite de l’intestin moyen dans le système circulatoire ouvert du moustique, ou hémolymphe, qui représente l’apparition d’une infection disséminée surmontant la barrière d’échappement de l’intestin moyen (MEB). À ce stade, le virus peut établir des infections de tissus secondaires (par exemple, les nerfs, les muscles et les corps gras) et continuer à se répliquer, bien qu’une telle réplication secondaire puisse ne pas être strictement nécessaire pour que le virus infecte les cellules acineuses des glandes salivaires (en surmontant la barrière d’infection des glandes salivaires). La sortie des cellules acineuses des glandes salivaires dans leurs cavités apicales, puis le mouvement dans le canal salivaire permettent l’inoculation du virus dans les hôtes ultérieurs lors de la morsure et complètent le cycle de transmission1,2,4,5,6,7.

Compte tenu de ce mécanisme de propagation bien caractérisé et généralement conservé au sein d’un moustique vecteur, les évaluations des compétences des vecteurs de laboratoire sont souvent méthodologiquement similaires, bien qu’il existe des différences dans les protocoles1,2. Généralement, après une exposition au virus oral, les moustiques sont disséqués de sorte que les tissus individuels tels que l’intestin moyen, les jambes, les ovaires ou les glandes salivaires peuvent être testés pour l’infection virale, l’infection disséminée, l’infection disséminée / transmission transovarienne potentielle et l’infection disséminée / la compétence de transmission potentielle, respectivement8. La simple présence d’un virus dans les glandes salivaires, cependant, n’est pas une preuve définitive de la capacité de transmission, étant donné la preuve d’une barrière d’échappement/ sortie des glandes salivaires (SGEB) dans certaines combinaisons vecteur/virus1,2,4,5,7,9. La méthode standard pour prouver la compétence de transmission reste la transmission par les moustiques à un animal sensible10,11,12. Cependant, étant donné que pour de nombreux arbovirus, cela nécessite l’utilisation de modèles murins immunodéprimés13,14,15,16, cette méthode est souvent prohibitive. Une alternative couramment utilisée est la collecte de la salive du moustique, qui peut être analysée par réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-PCR) ou un test infectieux pour démontrer la présence du génome viral ou de particules infectieuses, respectivement. Il convient de noter que de telles méthodes de collecte de salive in vitro peuvent surestimer12 ou sous-estimer17 la quantité de virus déposée lors de l’alimentation in vivo, ce qui indique que ces données doivent être interprétées avec prudence. Néanmoins, la méthode in vitro est très précieuse lorsqu’elle est analysée du point de vue de la simple présence de virus dans la salive, indiquant un potentiel de transmission.

Deux approches majeures existent pour déterminer le rôle des moustiques vecteurs dans les épidémies de maladies arbovirales. La première méthode implique une surveillance sur le terrain, dans laquelle les moustiques sont collectés dans le cadre de la transmission active18,19,20,21,22,23,24. Cependant, étant donné que les taux d’infection sont généralement assez faibles (p. ex., le taux d’infection estimé à 0,061 % des moustiques dans les zones de circulation active du virus Zika (ZIKV) aux États-Unis21), l’incrimination des espèces vecteurs potentielles peut être fortement biaisée par la méthode de piégeage25,26 et le hasard aléatoire (p. ex., échantillonnage d’une personne infectée sur 1 600 non infectées)21 . Compte tenu de cela, une étude donnée peut ne pas acquérir suffisamment de moustiques en nombre brut ou en diversité d’espèces pour échantillonner avec précision les moustiques impliqués dans la transmission. En revanche, les analyses de compétence vectorielle sont effectuées en laboratoire, ce qui permet un contrôle strict de paramètres tels que la dose orale. Bien qu’elles ne soient pas entièrement capables de représenter la véritable complexité de l’infection par les moustiques et de la capacité de transmission sur le terrain, ces évaluations en laboratoire demeurent des outils puissants dans le domaine de l’arbovirologie.

Sur la base de diverses analyses de compétence vectorielle avec ZIKV chez plusieurs espèces, populations et méthodes de moustiques27,28,29,30,31,32, ainsi que d’un examen récent des évaluations de compétence vectorielle1, nous décrivons ici plusieurs des protocoles associés à un flux de travail de compétence vectorielle typique. Dans ces expériences, trois populations d’Ae. aegypti des Amériques (la ville de Salvador, Brésil; République dominicaine; et la basse vallée du Rio Grande, TX, États-Unis) ont été exposées à une seule souche de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) à des doses de 4, 5 ou 6 log10 unités focalisantes (FFU) / mL au moyen de farines de sang artificielles. Par la suite, ils ont été analysés pour détecter des signes d’infection, d’infection disséminée et de compétence en matière de transmission après diverses périodes d’incubation extrinsèque (2, 4, 7, 10 et 14 jours) au moyen d’une dissection et d’un test infectieux basé sur la culture cellulaire. Bien que le flux de travail et les protocoles actuels soient optimisés pour le ZIKV, de nombreux éléments sont directement transposables à d’autres arbovirus transmis par les moustiques dans les niveaux de confinement et de biosécurité des arthropodes 2 et 3 (ACL/BSL2 ou ACL/BSL3).

Protocol

Toutes les procédures effectuées dans le cadre de ces protocoles ont été effectuées en pleine conformité avec les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité et le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas à Galveston. 1. Amplifier le ZIKV dans les cellules Vero Cultiver des cellules Vero (CCL-81 ou VeroE6) dans la modification par Dulbecco du milieu essentiel minimal (DMEM) d’E…

Representative Results

Trois populations d’Ae. aegypti des Amériques (Salvador, Brésil; République dominicaine; et la vallée du Rio Grande, TX, États-Unis) ont été exposées à une souche épidémique de ZIKV des Amériques (ZIKV Mex 1-7, État du Chiapas, Mexique, 2015) sur une gamme de titres de farine de sang (4, 5 et 6 log10 FFU / mL) présentés dans une farine de sang artificielle à base d’érythrocytes humains lavés. Aux jours 2, 4, 7, 10 et 14 après l’infection, des sous-ensembles de moustiques ont ?…

Discussion

Les méthodes décrites ici fournissent un flux de travail généralisé pour effectuer des analyses de compétences vectorielles. En tant que cadre général, bon nombre de ces méthodologies sont conservées dans toute la littérature. Cependant, il y a une marge de manœuvre substantielle pour des modifications (examinées dans Azar et Weaver1). On sait que les virus (p. ex., lignée virale, entreposage du virus de provocation, antécédents de passage viral), l’entomologie (p. ex., colonisat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le personnel du Centre mondial de référence pour les virus et arbovirus émergents (WRCEVA) : Dr Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr Kenneth Plante, Dr Jessica Plante, Dionna Scharton et Divya Mirchandani, pour leur travail inlassable dans la conservation et la fourniture de nombreuses souches virales utilisées pour nos expériences de compétence vectorielle et celles d’autres groupes. Le travail présenté a été financé par le McLaughlin Fellowship Fund (SRA) et les subventions des NIH AI120942 et AI121452.

Materials

3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

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Cite This Article
Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

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