프로토콜은 뇌척수액(CSF) 및 척추 경막수액을 수집하는 림프관 및 림프절(LNs)의 3차원 및 세포 분해성 이미지를 얻기 위해 조직 클리어링과 가벼운 시트 형광 현미경 검사법(LSFM)을 결합하여 제시된다.
중추 신경계 (CNS)와 관련되었던 림프 계통에는 두뇌, 척수 및 관련 LN의 주위에 회전하는 림프 혈관을 포함합니다. CNS 관련 림프 계통은 CNS 배수 LN을 향한 CSF 거대 분자 및 수막 면역 세포의 배수에 관여하여 CNS 조직 내의 폐기물 정리 및 면역 감시를 조절합니다. 제시는 주변 조직 내에서 회로의 무결성을 유지하면서 CNS 관련 림프의 3차원 (3D) 및 세포 분해성 이미지를 얻는 새로운 접근 방식입니다. iDISCO+ 프로토콜은 광시트 형광 현미경 검사법(LSFM)으로 이후에 이미지되는 척추 컬럼의 탈화 및 전체 마운트 제제에서 림프성 혈관을 면역 라벨에 사용한다. 이 기술은 척수 주위의 수막 및 경막외 공간을 외피 림프관에 연결하는 림프 네트워크의 3D 구조를 보여줍니다. 제공된 분자 추적기의 배수 회로의 3D 이미지는 이전에 시스테나 마그나 또는 흉부 척추 parenchyma를 통해 CSF에 주입된다. iDISCO+/LSFM 접근법은 신경 혈관 생물학, 신경 면역학, 뇌 및 척추암 또는 척추 뼈 및 관절 생물학에서 CNS 관련 림프시스템의 구조와 기능을 탐구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다.
CNS는 CSF와 수막, 경막외 조직 및 뼈의 겹치에 둘러싸여 있습니다. CSF는 모두 부드러운 뇌와 척수에 물리적 인 보호를 제공합니다. 그것은 주로 choroid 신경총과 수막 (즉, 피아 마터, 거미류 및 듀라 마터)에 의해 분비된다. CSF-수막 복합체는 또한 CNS 조직과 신체의 나머지 부분 사이의 기능적 인터페이스를 확립하여 CNS 항상성에 기여합니다. 첫째, CSF는 CNS 파라 동맥 공간을 통해 CNS parenchyma를 관통하고 CNS혈관2,3,,4,4 주위에 파라바 공간 및 성상세포 말발 막으로 구성된 글리프파틱 (glia-lymphatic) 시스템을 통해 중간 유체 (ISF)1과 동적으로 상호 작용합니다. 대사 폐기물및 과잉 유체는 궁극적으로 전신 순환을 향한 뇌 의 정맥 내 배수에 의해 궁극적으로 지워집니다3,뿐만 아니라 CSF를 향한 정맥 공간과 뇌 배수 림프혈관을 통해, 글리프파틱 모델2에따르면2,4. CSF 유출은 주로 림프계를 통해, 크리브리폼 플레이트및 관련 외두개,,림프혈관5,,6,,7을통해, 뿐만 아니라 뇌 배수 LN8,9,910,11,,12(도 1)에수렴되는 수막 림프혈관에 의해서이다. 중요한, 비록 보조, CSF 유출에서 역할은 수막 정맥 부비동의 lacuna를 관통 하는 두개골 거미 악에 의해 촬영13.
CFS 배수 회로는 CNS 또는 CSF로 착색/형광 추적기를 주입한 다음, CNS 내부및 체내 장기 및 조직 전체에 대한 추적자 패턴의 이미징이 주입후 13후에 다른 시점에서 추적자 패턴의 이미징을 기반으로 실험적 접근법을 통해 광범위하게 조사되었다. 오랜 시간 동안, CSF의 유출은 거미 정맥부비동(13)으로투사되는 거미악을 통해 혈액 순환에 의해 독점적으로 직접 적으로 담당한 것으로 간주되었다. 그러나, CSF 유출은 주로 림프혈관에 의해 수행되며, 최근에는 마우스9,,10에서CSF 주입 추적기 수송의 근적외선(NIR) 동적 이미징에 의해 도시된다. CSF 배수 림프관은 오른쪽 서브클라비아 정맥을 통해 림프를 혈류로 돌려보습니다. 보완 적 어프로치는 CSF 주입 추적자의 외두개66,7,,13 및 두개 내9,,10,,11,,12 림프 출구를 모두 검출하고 CSF가 두 개의 림프 경로, 하나 외부 및 두개골 및 척추 컬에 내부에 흡수되는 것을 제안합니다. CSF 배수의 주요 부분은 비강 점막의 두개골 바깥쪽에 있는 림프관을 통해 빠르게 발생하며, ethmoid bone3,,6,,13의 크리브리폼 플레이트의 채널을 통해, 소들, 요추성 척추 뼈 의 외부는 아직 완전히 특징적이지 않은 등쪽 경로7,,14. 또한, 두개골의 수막에서, 두라 마터의 림프모세혈관은 두개골 뼈를 교차하고 CNS 배수 LNs12,,14에연결하는 격막 림프 수집기를 향해 CSF 및 수막 면역 세포를 흡수한다. 이러한 뇌 수막 림프관은 노화 시 뇌 수막 림프제가 변하고 신경변성, 신경염증 및 뇌암15,,16,,17을포함한 신경뇌질환의 결과에영향을 미치기 때문에 CNS 병리생리학에서 중요한 역할을 한다. 따라서, CNS-관련 림프 혈관(즉, CSF를 배수하는 두랄 및 말초 림프관)은 인간에서 CNS 질병에 대항하는 유망한 새로운 표적이 될 수 있다.
면역 조직학 및 고해상도 자기 공명 영상으로 수행 된 수렴 연구는 수막 림프혈관이 일반적인 마모셋 원숭이와 인간7,,11,,13을포함한 영장류에도 존재한다는 것을 입증했습니다. 더욱이, 수막 림프관은 두개골에 국한되지 않고 척추 컬럼 내에서 척추 신경리아와라미(13,18)의18표면으로 확장한다. 뼈, 근육, 인대 뿐만 아니라 인접한 내장 조직을 포함하여 표지된 척추 및 척추 샘플의 전반적인 해부학을 보존하는 척추 컬럼 림프제의 3차원(3D) 이미징은 최근14회수행되었다. 상기 iDISCO+ 프로토콜(19)은,,20은 림프계 항체를 가진 전체 척추컬럼의 탈칼화 및 클리어된 제제를 막 수용체 LYVE1(LYVE1 21) 또는 전사인 PROX1(22)에 대해 사용하였다.21 22 영상 수집 및 분석은 광시트 형광 현미경 검사법(LSFM) 및 Imaris 소프트웨어로 수행하였다. LSFM은 조명의 축 감금에 의해 대형 표본의 신속하고 최소 침습적인 3D 이미징을 허용하여 광표백 및광독성(23)을감소시다.
iDISCO+/LSFM 접근법은 두막 및 경막외 림프관의 뚜렷한 층의 특성화와 이 혈관을 외피 림프 회로및 척추 기둥에 인접한 LN에 연결할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이전에 형광 추적기로 주입된 조직에 적용되어 척추 운하 배수를 입증했습니다. 본 논문은 iDISCO+/LSFM방법론에 대한 세부 정보를 제공하여 척추 림프 혈관을 이미지화하고 CSF 및 경막외 유체 배수 조사와의 관련성을 보여줍니다.
iDISCO+/LSFM 프로토콜은 세포 해상도 수준에서 주변 조직 내에서 CNS 관련 림프 네트워크의 전례없는 3D 보기를 제공합니다. 이 프로토콜은 LSFM 광학 시스템의 한계, 작업 거리 감소 및 고해상도 현미경검사기(23)를위한 상용 목표 렌즈의 큰 크기로 인해 1.5cm3을방출하지 않고 중간 크기의 샘플에 잘 적응된다. 이 제한은 전체 두뇌 관련 림프 계통을 포착하는 것을 방지합니다. 조사 영역은 신중하게 구분되어야 하며 CNS를 둘러싼 조직은 전체 림프회로에 기여하는 외두개 림프관과 LN을 포함시키기 위해 신중하게 해부되어야한다(표 2).
크기 및 해부학적 고려 사항 외에도 주변 중간 엽 조직의 복잡성은 두개골과 척추 컬럼에 따라 다양하며, 이는 균일한 샘플 설명을 얻고 연동 식물성 생물학적 조직 내에서 광선 전파를 허용하기 위해 탈매화 및 프리클리어링 처리의 적응을 필요로 합니다. 뼈가 없는 경우 뇌 또는 척수 조직의 LFSM 이미징은 탈석화 단계를 필요로 하지 않으며 캡처된 이미지의 최종 해상도가 최적19이다. 모스의 용액을 가진 온화한 탈화 단계를 포함하는 전술한 프로토콜은 도 1 및 도 4에도시된 바와 같이 척추 컬럼의 LSFM 이미징에 잘 적응된다. 대조적으로, 목 영역은 도 3B에반영된 바와 같이, 포착된 LSFM 심상의 질을 감소시키는 근육, 지방 및 선 조직의 다층 이외에 특히 복잡한 뼈 해부학을 표시합니다. 목과 자궁 경관 지역의 LSFM 화상 진찰은 이렇게 조직의 더 엄격한 처리에 의해 향상될 수 있습니다; 예를 들어 EDTA를 사용하면 이전에 보고된24. 따라서 탈화 단계는 전체 iDISCO+ 프로토콜(표2)을시작하기 전에 사용되는 각 항체에 대해 이전에 테스트되어야 한다.
iDISCO+/LSFM 프로토콜은 수막 및 경막외 공간과 관련 LN 사이의 연결 회로의 3D 뷰생성을 허용하지만, LSFM-캡처된 이미지로부터 림프혈관의 직접적인 정량적 분석은 다음과 같은 이유로 실현 가능하지 않다: 1) 림프용기 회로의 형상은 림프마커 발현의 불연속 패턴으로 인해 신뢰할 수 없는, membranar LYVE1은 이체로 분포되어 있기 때문에21 및 PROX1은 핵발현 패턴을22; 2) 항체의 이종성 침투뿐만 아니라 불완전하고 이종성 탈화 및 사전 정리로 인해 생물학적 조직에서 지속될 수 있는 이소성.. 따라서 LSFM 이미징은 대화형 시각화를 가능하게 하고 림프 혈관(www.syglass.io)의 정량화를 용이하게 하는 가상 현실 도구에 의해 확장되어야 합니다. 또한 CNS 관련 회로의 정확한 설명은 종래의 면역 라벨링에 의해 얻어진 고해상도 공초점 데이터로 LSFM 정보를 백업해야 하며, 특히 두라 마터 및 CSF에 관한 림프관의 위치를 정확하게 지역화하기 위해,118,18, 118이전에보고된 바와 같이,14,118.
iDISCO+/LSFM 프로토콜은 도 3 및 도 4에도시된 바와 같이 CNS 관련 림프계에서 거시 분자 배수의 3차원 시각화를 허용한다. 그러나, 림프 배수의 기능적 평가는, iDISCO+LSFM 프로토콜에 대한 권장 사항 외에도, 엄격한 절차에 따라, 최종 결과는 주사 수술의 품질에 따라 달라지므로, 전달 부위의 선택, 사용된 거대분자 마커의 종류 및 주입량, 및 추적자 투여 후의 희생 시간(표2)이필요하다. 주입된 동물 사이의 트레이서 패턴의 변화로 인해 림프 배수 회로의 특성화는 큰 실험 군(주사 조건에 의한 10)을 필요로 합니다. 제시된 프로토콜에서, 1) 듀라 마터는 CNS 조직에 원치 않는 병변및 침투를 방지하기 위하여 주입의 앞에 구멍을 뚫어야 합니다; 2) 주입된 부피는 주사 구멍을 통해 원치 않는 확산을 제한하기 위해 2 μL 미만이어야 하며, 주입 모세관을 따라 경막외 공간 또는 외피 조직으로; 3) 분사 모세관 삽입의 깊이는 각각 ICM 및 척추 주사에서 CNS 부상 이나 오타겟팅을 피하기 위해 듀라 마터 아래 2mm로 제한되어야한다. 또한 상기와 같이, 림프관 내부에 주입된 트레이서의 존재를 평가하기 위해, 상기와 같이, 인접한 척추 세그먼트의 보완적인 고해상도 공초점 분석을 수행해야 합니다. 이 분석은 마커 표지 림프관의 단면에 트레이서 및 림프 마커에 대한 강도 프로파일 플롯을 확립해야합니다. 이 접근법은 이전에 주사 후 15 분에서 ThLb 림프학에 의해 OVA555 섭취량을 입증하는 데 사용되었습니다 (야곱 외14에서보충 도 5F). 그러나, 본 연구에서 안티-LYVE1 트레이서에 대해서는 설명되지않았다(도 4).
가능한 CSF 트레이서 중, OVA-A555는 iDISCO+ 프로토콜 치료에 내성이 있고 LSFM 이미징에 대한 높은 형광을 유지하기 때문에 훌륭한 옵션입니다. 그러나 분석시점(표 1 및 표 2)에따라 트레이서 유형을 선택해야합니다. 위에서 보고한 바와 같이, OVA-A555 국소 척추 림프혈관의 라벨링은 주사 후 15분 후에 관찰된다14. 그러나, OVA-A555는 주사 후 45분(도 3)에서 이러한 국소 림프회로에서 더 이상 검출되지않는다(도 3)항-LYVE1항체(도 4)와대조적이다.
결론적으로, iDISCO++/LSFM 프로토콜은 CNS 및 척추 컬럼 암, 척추뼈 및 관절 질환과 같은 생리적 및 병리학적 조건에서 CNS 관련 림프계의 3D 구조 및 배수를 조사하기 위해 잘 적응된다. 전체 절차는 길고 방법론적 엄격이 필요하지만 가상 현실 도구및 고해상도 공초점 이미징을 사용하여 상호 보완 분석과 함께 사용할 때 귀중하고 독특한 정보를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 Institut 국립 드 라 산테 에 드 라 Recherche Medicale에 의해 지원되었다, 기관 내셔널 레체체 (ANR-17-CE14-0005-03), 연맹 부어 라 레체쉬 쉬르 르 세르베오 (FRC 2017), 카노트 성숙 (L.J.), 유니버시드 연방 드 리오 드 자니에로 (J.B.에 대한 UFRJ), NIH (R01EB0166-019 의 학원) 우리는 ICM 플랫폼을 인정합니다: 면역 조직화학을 위한 세포 화상 진찰및 ICM-조직학을 위한 ICM-QUANT. 모든 동물 작업은 PHENO-ICMice 시설에서 수행되었습니다. 코어는 2 “투자 d’avenir”(ANR-10-IAIHU-06 및 ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS)와 “퐁디부어 라 레쉐 메디칼”에 의해 지원됩니다. 우리는 방법론적 조언과 원고 읽기니콜라스 레니에를 인정합니다.
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |