組織クリアリングと光シート蛍光顕微鏡(LSFM)を組み合わせて、脳脊髄液(CSF)および脊髄硬膜外液を収集するリンパ管およびリンパ節(LN)の3次元および細胞分解能画像を得るプロトコルが提示される。
中枢神経系(CNS)に関連するリンパ系には、脳、脊髄、および関連するRNの周りを回るリンパ管が含まれる。CNS関連リンパ系は、CNS-ドレインルンに向かうCSF高分子および髄膜免疫細胞の排出に関与し、それによってCNS組織内の廃棄物クリアランスおよび免疫監視を調節する。提示は、周囲の組織内の回路の完全性を維持しながら、CNS関連リンパ系の3次元(3D)および細胞分解能画像を取得するための新しいアプローチです。iDISCO+ プロトコルは、後にライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)で画像化される椎骨カラムのリンパ管を脱灰およびクリアされた全てのマウント調製物に免疫標識するために使用されます。この技術は、脊髄周囲の髄膜および硬膜外空間を椎体外リンパ管に接続するリンパネットワークの3D構造を明らかにする。提供される分子トレーサーの排水回路の3D画像は、以前に水槽マグナまたは胸部脊髄パレンチマを介してCSFに注入された。iDISCO+/LSFMアプローチは、神経血管生物学、神経免疫学、脳および椎骨癌、または椎骨および関節生物学におけるCNS関連リンパ系の構造と機能を探求する前例のない機会をもたらします。
CNSはCSFに囲まれ、髄膜、硬膜外組織、および骨の層を重ね合わせている。全体として、CSFは柔らかい脳および脊髄に物理的な保護を提供する。それは主に脈絡叢と髄膜(すなわち、ピア・マーター、くも膜、および硬膜)によって分泌される。CSF-髄膜複合体はまた、CNS組織と身体の残りの部分との間に機能的なインターフェースを確立し、それによってCNS恒常性に寄与する。まず、CSFは、CNSパラ動脈空間を介してCNSパレンチマを貫通し、血管周囲の血管内腔およびアストロサイトの端足膜からなるリンパ管(グリアリンパ)系を介して間質流体(ISF)1と動的に相互作用する12、3、4。4,3リンパモデル,2,4によると、代謝廃棄物および過剰流体は、最終的には脳の気質から全身循環3に向かって直接壁内血管内排液によって、CSFに向かう静脈内空間と脳を排出するリンパ管を介して最終的にクリアされる。2,CSF流出は、主にリンパ系を介して、クリブリフォームプレートおよび関連する頭蓋外リンパ管5、6、7、6,7ならびに脳水流5LNs8、9、10、11、12で収束する髄膜リンパ管を介してである(図1)。8,9,1011,12重要な、二次的であるが、CSF流出における役割は、髄膜性静脈洞13のラクノイド絨毛を貫通する頭蓋くも膜絨毛によって取られる。
CFS排水回路は、CNSまたはCSFへの着色/蛍光トレーサーの注入に基づく実験的アプローチを通じて広範囲に調査され、続いてCNS内および注入後の異なる時点で全身のトレーサーパターンの画像化を行った。長い間、CSFの流出は、血液循環によって独占的かつ直接的に取られると考えられていたが、硬膜静脈洞13に突出するくも膜絨毛を介して。しかしながら、CSF流出は、マウス,9,10における近赤外(NIR)による近赤外(NIR)動的イメージングによる最近の示されるように、主にリンパ管構造によって行われる。9CSFを排出するリンパ管は、右鎖骨下静脈を介してリンパを血流に戻す。補相的なアロッホは、頭蓋外66、7、137,13および頭蓋内99、10、11、1210,11のリンパ出口の両方を検出し、CSF12が2つのリンパ経路(1つは外部およびもう1つは頭蓋骨および椎骨柱の内部)によって吸収されることを示唆している。CSFの排水の主要部分は、鼻粘膜の頭蓋骨の外側に位置するリンパ管を介して急速に起こり、エトモイド骨33、6、13、6,13および、完全に特徴付けられていない側側路を通る腰仙骨椎骨の外側の経路を介して7,7、14。また、頭蓋骨の髄膜において、硬膜直下のリンパ毛細血管は、頭蓋骨を横切ってCNS水切りLNs12,14,14に接続する硬直リンパコレクターに向けてCSFおよび髄膜免疫細胞を吸収する。これらの髄膜リンパ管は、脳の髄膜リンパ管が老化時に変化し、神経変性、神経炎症,、脳癌15、16、1716を含む神経学的脳疾患の結果にも影響を与えるため、CNS病態生理学15において重要な役割を果たす。17したがって、CNS関連リンパ管系(すなわち、CSFを排出する硬直および末梢リンパ管)は、ヒトにおけるCNS疾患と戦う有望な新しい標的となり得る。
免疫構造と高解像度の磁気共鳴画像法を用いて行われた収束研究は、髄膜リンパ系血管系が、一般的なマーモセットサルおよびヒト77、11、1311,を含む霊長類にも存在することを実証した。13また、髄膜リンパ管は頭蓋骨に限定されず、脊柱内に及び脊髄神経節とラミ13,18,18の表面まで延びる。脊椎柱リンパ管の3次元(3D)画像化は、上にある骨、筋肉、靭帯、ならびに隣接する内臓組織を含む、標識された椎骨および脊髄試料の全体的な解剖学を保存し、最近14を行った。iDISCO+プロトコル19,20を用いて、20膜受容体LYVE1 21または転写因子PROX122のいずれかに対するリンパ系特異的抗体を用いて脊椎柱全体の免疫標識およびクリアされた製剤を用いた。次いで、光シート蛍光顕微鏡(LSFM)およびイマリスソフトウェアを用いて画像取得と解析を行った。LSFMは、照明の軸性閉じ込めによって大きな標本の迅速かつ低侵襲的な3Dイメージングを可能にし、これは光漂白および光毒性23を低減させる。
iDISCO+/LSFMアプローチは、硬膜および硬膜外リンパ管の異なる層の特徴付け、および椎体外リンパ回路および脊椎列に隣接するRNへのこの血管系の接続を可能にする。このプロトコルは、脊椎管排水を実証するために、以前に蛍光トレーサーを注入した組織に適用された。本論文は、椎体リンパ管系をイメージするiDISCO+/LSFM方法論の詳細を提供し、CSFおよび硬膜外液排水調査との関連性を示す。
iDISCO+/LSFM プロトコルは、周囲の組織内の CNS 関連リンパネットワークを細胞分解能レベルで前例のない 3 D ビューで表示します。このプロトコルは、LSFM光学系の限界、作業距離の短縮、および高解像度顕微鏡23用の商用対物レンズの大きなサイズのために、1.5cm3をexededしていない中型サンプルにうまく適応される。3この制限は、脳関連リンパ系全体をキャプチャすることを防ぎます.調査領域は慎重に区切られなければいけませんし、CNSを取り巻く組織は、リンパ回路全体に寄与する頭蓋外リンパ管およびLNを含めるために注意深く解剖されなければならないことに注意することが重要です(表2)。
サイズと解剖学的考察に加えて、周囲の間葉組織の複雑さは頭蓋骨および椎骨柱に沿って変化し、均質なサンプルの明確化を得るために脱灰および前駆除処理の適応を必要とし、柔らかい等方性の生物学的組織内で光線の伝播を可能にする。骨の不在時には、脳または脊髄組織のLFSMイメージングは、脱灰工程を必要とせず、そして、キャプチャされた画像の最終的な解像度は最適19である。上記のプロトコルは、モールスの溶液を用いた軽度の脱灰ステップを含むが、図1および図4に示すように、椎骨カラムのLSFMイメージングに適している。対照的に、首領域は、筋肉、脂肪、および腺組織の複数の層に加えて特に複雑な骨解剖学を表示し、キャプチャしたLSFM画像の品質を低下させる、図3Bに反映される。首と頸部領域のLSFMイメージングは、このように組織のより厳しい治療によって改善され得る;たとえば、EDTA では、前に報告された24などです。したがって、デケイシングステップは重要であり、完全なiDISCO+プロトコルを開始する前に使用される各抗体についてデケイシング条件を事前にテストする必要があります(表2)。
iDISCO+/LSFM プロトコルでは、髄膜と硬膜外の空間と関連する LUN 間の接続回路の 3D ビューを生成できます。 LSFMキャプチャ画像からのリンパ管系の直接定量的分析は、以下の理由で実現不可能である:1)リンパ管回路の線引きはリンパマーカー発現の不連続パターンのために信頼性が低い。なぜなら、membranar LYVE1は異端分布21であり、PROX1は核発現パターンを有する。2)抗体の異種の浸透、ならびに不完全で不均一な不均一な脱灰および予めのクリアリングのために生体組織に持続し得る異方性。LSFMイメージングは、インタラクティブな可視化を可能にし、リンパ管構造の定量化を容易にするバーチャルリアリティツール(www.syglass.io)によって拡張される必要があります。また、CNS関連回路の正確な記述は、特に,14,硬膜およびCSFに関するリンパ管の位置を正確に局在させるために、薄い(5〜10 μm)の凍結スタットまたはパラフィン埋め込まれた組織切片上で従来の免疫標識によって得られた高解像度共焦点データを用いてLSFM情報をバックアップする必要があることにも注目に値する。
iDISCO+/LSFM プロトコルにより、図 3および図 4に示すように、CNS 関連リンパ系における高分子排液の三次元可視化が可能になります。しかしながら、リンパドレナージの機能評価は、上記で詳述したiDISCO+/LSFMプロトコルに+関する勧告に加えて、厳密な手順に従い、最終的な結果は注射手術の質、送達部位の選択、使用される高分子マーカーの種類および注入量、およびトレーサー投与後の犠牲の時間に依存する必要がある(表2)。. 注入された動物間のトレーサーパターンの変化のために、リンパドレナージ回路の特徴付けには、大規模な実験群が必要です(注入条件による10)。提示されたプロトコルでは、1)硬膜は、不必要な病変およびCNS組織への浸透を防ぐために注入前に穿刺されなければならない。2)注入された容積は、注入穴を通る不必要な拡散を制限するために2μL未満でなければならない、 注入毛細管に沿って、硬膜外の空間または椎体外組織に;3)注射毛細血管挿入の深さは、ICMおよび脊髄内注射におけるCNS傷害または誤標的化を避けるために、硬膜下2mmに制限されなければならない。また、リンパ管内に注入されたトレーサーの存在を評価するために、隣接する椎体セグメントの相補的な高解像度共焦点解析を行う必要があることにも注意してください。この分析では、マーカー標識リンパ管の断面にトレーサーとリンパマーカーの強度プロファイルプロットを確立する必要があります。このアプローチは、注射後15分でThLbリンパ球によるOVA555取り込みを実証するために以前に使用されてきた(補助図5F(ヤコブ14))。しかしながら、本研究では抗LYVE1トレーサーについては図示されていない(図4)。
可能なCSFトレーサーの間で、OVA-A555はiDISCO+プロトコルの処置に対して抵抗力があり、LSFMのイメージ投射のための高い蛍光を維持するので優秀な選択である。ただし、トレーサーのタイプは、解析の時点(表1および表2)に従って選択する必要があることに注意してください。上記で報告されたように、局所脊椎リンパ管のOVA-A555標識は、注射14後15分で観察される。しかし、OVA-A555は、抗LYVE1抗体とは対照的に、注射後45分(図3)でこれらの局所リンパ回路で検出されなくなりました(図4)。
結論として、iDISCO+/LSFMプロトコルは、CNSおよび脊椎列癌、または椎骨および関節疾患などの生理学的および病理学的状態におけるCNS関連リンパ系の3D構造および排水を調査するために十分に適合している。完全な手順は長く、方法論的な厳格さを必要としますが、バーチャルリアリティツールと高解像度共焦点イメージングを使用して補完的な分析を使用すると、貴重でユニークな情報を提供します。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、サンテ・エ・ラ・レシェルシュ・メディカルの研究所によって支えられ、 アジェンス・ナショナル・レシェルシュ(ANR-17-CE14-0005-03)、連盟はラ・レシェルシュ・シュル・ル・セルヴォー(FRC 2017)、カルノー・マチュレーション(L.J.へ)、ユニバーシダーデ連邦デリオ・デ・ジャニエロ(J.B.のためのUFRJ)、(R01EB016629-01)を注ぎます。私たちは、ICMプラットフォームを認めます: 細胞イメージングのためのICM-QUANTと免疫細胞化学のためのICM-ヒストミック.すべての動物の作業は、PHENO-ICMice施設で行われました。コアは2「投資ダベニール」(ANR-10- IAIHU-06とANR-11-INBS-0011-NeurATRIS)と「フォンダシオンはレシェルシュメディカルを注ぐ」によってサポートされています。私たちは、方法論的なアドバイスと原稿の読書のためにニコラス・ルニエを認めます。
Consumables | |||
Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
Needles 26G (0.45×13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
Microscopes and imaging softwares | |||
AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
Reagents | |||
Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
Surgical tools and equipments | |||
Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |